一种基于UPLC-DAD-MS研究脉络宁注射液指纹图谱的分析方法与流程

本发明涉及一种基于uplc-dad-ms研究脉络宁注射液指纹图谱的分析方法，属于天然药物化学领域。

背景技术：

与丸、散、膏、丹等传统剂型相比，中药注射剂是一种独具特色的新型中药剂型，它有十分突出的优点：剂量准确，直达病所，起药效快，作用可靠，对于不宜口服给药的患者或不宜口服的药物都是一个很好的选择。我国现有中药注射剂100余种，涉及的生产企业数百家，1999年-2009年，全国中药注射剂市场的平均增长率均在30％以上，每年有3亿患者使用中药注射剂，年销售额超过150亿元人民币。但是，中药注射剂在生产和使用过程中出现了不少的问题，质量标准低，可控性差；控制手段落后；原料药材质量不均一；最严重的是中药注射剂应用后带来不良反应的不可预测性、多样性、多发性，有时会带来严重的后果，特别是近几年临床报道不良反应的注射剂品种几乎涉及所有的中药注射剂，这些不良反应都很大程度上限制了中药注射剂的发展和应用，中药注射剂安全性问题成为社会最关注的话题之一。

中药制剂成分的复杂性决定了其效应的多样性，在未明确之前，很难区分哪些是有效成分、无效成分或毒性成分，也很难为其制定完善的质量标准。近年来，国家加大了对中医药的重视程度，为了使中医药行业健康良性发展，国家相继出台了一系列政策法规，以规范中药注射剂的研究、申报、生产和使用。国家食品药品监督管理局在2007年颁布的《中药、天然药物注射剂基本技术要求》从非临床和临床安全性及药物代谢等方面对正在研究开发的中药注射剂提出了具体的技术要求，而且对中药注射剂化学物质基础研究和质量标准提出了更高的要求。目前中药注射剂普遍存在成分不清、质量控制标准低、存在很大的安全性问题，所以如何结合运用各种先进的技术，对中药注射剂进行深入的研究，使中药注射剂更加安全有效是摆在我们中医药工作者面前的巨大挑战。

脉络宁注射液是在著名医方“四妙勇安汤”临床应用的基础上研究开发出来的、具有自立知识产权的，并于1985年正式批准生产的中药复方静脉注射剂，由中药石斛、玄参、牛膝、金银花、山银花经科学提取精制而成。具有活血化淤、行气止痛、养阴通络和补益肝肾的功效，主要用于治疗缺血性中风急性期、血栓闭塞性脉管炎、下肢深静脉血栓形成、动脉硬化性闭塞症、脑梗塞、心绞痛、心肌梗死、血液循环障碍及其后遗症等疾病，总有效率可达94.5％，与同类药品比较具有见效快、疗效高、疗程短、价格低廉、副作用少、安全性高等优点，已成为全国名特优中成药，在基层医院应用广泛。1992年被国家中医药管理局列为首批全国中医院急诊科(室)必备中成药之一以及国家中药保护品种；2000年6月被列为《国家基本医疗保险药品目录》中成药甲类药品；2009年7月入选国家新医改基本药物目录基层版307种，为仅有的3个中药注射剂品种之一，医改给脉络宁注射液带来了新的成长契机，是一个走向更广阔市场的极好机会，显示着很强的生命力和广阔的应用前景。据不完全统计，迄今该品种已累计生产近10亿支，累计销售收入近100亿元，创造了巨大的社会效益与经济效益。

脉络宁注射液临床应用广泛，疗效可靠，但由于脉络宁注射液是五种药材组成的复方中药注射剂，在精制过程中存在相互作用，绝不是各味药材的简单加和，成分极其复杂；本发明围绕脉络宁注射液质量再评价研究的系列关键科学问题包括脉络宁注射液的物质基础分离、化合物的鉴定、有效物质的含量分析等开展了一系列创新性的研究工作，旨在提高脉络宁中总固体中的可检测成分含量，为其质量标准的提高、药效和药代动力学研究、生产工艺优化和不良反应源查找等一系列研究工作提供科学依据。

技术实现要素：

本发明涉及一种基于uplc-dad-ms研究脉络宁注射液指纹图谱的分析方法，在前期化学成分(专利201910041593.9)的研究基础上，建立了脉络宁注射液uplc-dad-ms液质联用指纹图谱，可以直接分析并鉴定23种主要成分。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于uplc-dad-ms研究脉络宁注射液指纹图谱的分析方法，包括以下分析步骤：

(1)利用uplc-dad-ms，在一定色谱质谱条件下，进行正负离子全扫描得到脉络宁注射液的总离子流图；

(2)通过三批以上脉络宁注射液指纹图谱测定和与对照品比对，比较其色谱图确定其共有峰为23个主成分，化学结构分别为：右旋奎宁酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、6，7-二羟基香豆素、咖啡酸、断马钱子苷、对羟基肉桂酸、断氧化马钱子苷、1，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸(异绿原酸a)、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸(异绿原酸b)、丁香树脂酚、脉络宁酯、咖啡酸乙酯、肉桂酸、竹节参皂苷4a、α-常春藤皂苷、常春藤皂苷元-3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖苷。

所述的uplc-dad-ms，由美国安捷伦公司生产的1260uplc-dad-6530esi-qtofms；其色谱质谱条件为：色谱柱，安捷伦zorbaxsb-c184.6mm×100mm，1.8μm，600bar；流动相a相：0.1％甲酸-水，b相：甲醇；洗脱梯度为0min10％b，10min20％b，20min20％b，50min50％b，70min100％b，85min100％b；流速0.3ml·min^-1；进样量5μl；柱温35℃；dad检测波长254nm；质谱检测器esi离子源，负离子模式(100-1700m/z)；雾化器压力(nebulizerpressure)50psi；干燥气流速(dryinggasflow)10ml·min^-1；干燥气温度(dryinggastemp)350℃；毛细管电压(capillaryvoltage)3500v；fragmentor电压0-5min195v，5-60min135v，60-85min175v。

所述对照品为绿原酸溶液。

所述脉络宁注射液0.5ml，加入0.5ml纯水稀释作为供试品溶液。

有益效果：本发明建立了脉络宁注射液uplc-dad-ms液质联用指纹图谱，可以直接分析并鉴定23种主要成分，包括有机酸13个，香豆素1个，环烯醚萜2个，黄酮1个，木脂素1个，皂苷3个，其他成分2个。该方法可快速获得优化的色谱条件，从而获得最佳指纹图谱，重现性好，相对保留时间及相对峰面积变异均小于5％，准确地阐明了脉络宁注射液的主要化学成分构成，这对于阐明脉络宁注射液的药效物质基础具有重要意义，同时为提高脉络宁注射液的质量控制标准、建立科学合理的质量控制方法以及制备工艺优化奠定了基础。

附图说明

图1脉络宁注射液紫外指纹图谱(254nm)a0-35min放大图，b35-85min放大图；

图2脉络宁注射液总离子流指纹图谱c0-35min放大图，d35-85min放大图。

具体实施方式

实施例1

仪器、试剂与样品

十万分之一电子天平mettlerae240；液质联用仪agilent1260uplc-dad-6530esi-qtofms；包括以下组件：g1322a，1260degasser；g1312b，1260binpump；g1367e，1260hipals；g1316c，1290tcc；g4212b，1260dad；g6530a，6530accurate-massq-toflc/ms；masshunterb0.05.0工作站。脉洛宁注射液，金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂；绿原酸标准品，中国药品生物制品检定所，批号110753-201314(含量以96.6％计)；甲醇，默克merck(农残级)；甲酸，美国如意roe(>99％，lcms级)；去离子纯化水(18ω)。

实验方法

1、试液溶液的配制

1.1绿原酸标准液

精密称量10mg绿原酸(含量以96.6％计)，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，使成0.966mg·ml^-1的绿原酸母液。

1.2供试品溶液

精密吸取脉络宁注射液0.5ml，加入0.5ml纯水稀释即得。

2、高效液相色谱条件的优化通过优化色谱条件，确定了最佳色谱条件为：

仪器安捷伦1260uplc-dad-6530esi-qtofms；

色谱柱安捷伦zorbaxsb-c184.6mm×100mm，1.8μm，600bar；

流动相a相：0.1％甲酸-水，b相：甲醇；

洗脱梯度0min10％b，10min20％b，20min20％b，50min50％b，70min100％b，85min100％b；

流速0.3ml·min^-1；

进样量5μl；

柱温35℃；

dad检测波长254nm；

试验结果表明各色谱图分离度良好。

3、质谱条件的优化

利用masshunterdataacquisition软件进行数据采集及仪器参数优化，qualitativeanalysis软件进行定性分析，正离子模式下，脉络宁注射液中吐温等表面活性剂抢夺离子，使得信号杂乱，负离子模式下，各化学成分的响应较好。对esi离子源的fragmentor电压进行优化，质谱电压的大小影响出峰信号，电压小，有机酸等小分子信号好，但皂苷等大分子成分信号弱；电压大，有机酸等小分子被打碎，信号弱，但皂苷信号强，对定量检测有一定的影响。

最后确定质谱条件为：

质谱检测器esi离子源，负离子模式(100-1700m/z)；

雾化器压力(nebulizerpressure)50psi；

干燥气流速(dryinggasflow)10ml·min^-1；

干燥气温度(dryinggastemp)350℃；

毛细管电压(capillaryvoltage)3500v；

fragmentor电压0-5min195v，5-60min135v，60-85min175v。

4、指纹图谱的测定

4.1参照物的选择由于绿原酸的峰面积在图谱中所占的比例较大，且较稳定，故选其为参照物(s)。

4.2指纹图谱

按上述确定的色谱和质谱方法进行检测，获得紫外指纹图谱(图1)和总离子流指纹图谱(图2)。

4.3确定共有峰

通过三批注射液指纹图谱测定和对照品比对，比较其色谱图确定其共有峰为23个，其中紫外指纹图谱可识别峰17个，超过总峰面积5％的色谱峰有6个为1号峰(右旋奎宁酸)、4号峰(新绿原酸)、6号(峰绿原酸)、7号峰(隐绿原酸)、9号峰(咖啡酸)、12号峰(断氧化马钱子苷)；其中总离子流指纹图谱可识别峰23个，超过总峰面积5％的色谱峰有5个为1号峰(右旋奎宁酸)、4号峰(新绿原酸)、6号(峰绿原酸)、9号峰(咖啡酸)、12号峰(断氧化马钱子苷)。技术参数：共有峰相对保留时间和峰面积比值，见表1。

表1共有峰相对保留时间和峰面积比值

5方法学研究

5.1稳定性试验

取同一批供试品溶液(批号201204)，分别在0，3，6，12，24h时进样测定，结果显示(表2)，指纹图谱中的各共有峰的共有峰比值，其相对峰面积比值的rsd均小于3％，表明样品在24小时内是稳定的。

表2稳定性结果

5.2重复性试验

取同一批供试品溶液(批号201204)，共制备6份供试品溶液，分别进样检测，计算指纹图谱中的各共有峰的比值，结果可见(表3)，其相对峰面积比值的rsd均小于5％，表明方法重复性良好。

表3重复性结果

5.3精密度试验

取同一批供试品溶液(批号201204)，连续进样6次,结果可见(表4)，指纹图谱中的各共有峰的共有峰比值，其相对峰面积比值的rsd均小于5％，表明方法精密度良好。

表4精密度结果

6结果和讨论

为了确定脉络宁注射液指纹图谱中各峰的药材来源，进行了文献检索，来源于金银花药材的峰19个(1-7，9-16，19-20，22-23号)；来源于玄参的峰包括2个(9、11号)；来源于牛膝的峰1个(23号)；来源于石槲的峰4个(8、11、17、20号)。其中2号峰应为制剂中葡萄糖等水解产生的，18号峰为制剂工艺中合成。通过对照品计算各峰的含量，多批样品的平均值见表5。

表5脉络宁注射液中主要成分含量测定结果