一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法与流程

本发明涉及纳米生物技术领域，具体而言，涉及一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法。

背景技术：

国际原研生物药专利的到期以及多种疾病的需要等因素增加了市场对生物药的需求，国内生物药迎来巨大的发展机遇。抗体药物是生物药的一个重要组成部分，其研究发展也最快，从20世纪80年代中期开始，相继多种抗体药物被批准上市，目前有几百个抗体药物处在临床研究阶段。

相比于以往的小分子药物，抗体药物具有特异性强、高活性、生物功能明确、低毒性、半衰期长、利于临床应用等优点。但是，由于不同的病人接受抗体药物治疗后表现出不同的临床反应，为了实现用药的个体化，保证用药的安全性，最大程度上减小用药的盲目性，同时更好地符合法规要求，建立一种更为快速、准确的血药浓度检测平台，能为今后血药浓度的监测提供必要的支持。因此，建立规范可靠的分析方法并开展单克隆抗体药物药代动力学研究对于支持单克隆抗体药物研发具有十分重要的意义。

目前，蛋白类药物药代动力学研究多采用酶联免疫吸附方法，然而，在单克隆抗体药代动力学实验中，elisa方法定量范围较窄(通常为一至两个数量级)，不能对不同形态的单抗(单克隆抗体)药物进行同时分析，且存在开发周期长(半年至数年)，成本高(数十万至百万/目标药物)，无法区分内源性蛋白的干扰等问题，大大影响了elisa定量的可靠性和实用性。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法，其包括如下步骤：根据血浆样品中利妥昔单抗的特征肽段设计合成带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作为内标肽段，将特征肽段和内标肽段混合酶解，酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，求得血浆样品中利妥昔单抗浓度。

本发明根据一条特征肽段来代表利妥昔单抗进行定量，为了降低样品的处理过程对测定结果的影响，设计合成了带有酶切位点的稳定同位素标记肽段，并以此标记肽段为内标肽段。

选择利妥昔单抗重链第126-137位氨基酸作为特征肽段。

使内标肽段和特征肽段进行同步酶解，这样最大限度地提高了蛋白样品测定的准确性。将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，即可求得血浆样品中利妥昔单抗浓度。本发明采用采用蛋白质组学研究方法中的自下而上(thebottom-upapproach)方法，即将肽段或者蛋白用酶消化成更小的肽段，然后再选取特征肽段，基于液相色谱-串联质谱技术，采用mrm(多反应监测)模式对特征肽段进行扫描分析，建立一种对利妥昔单抗药物的体内绝对定量分析方法。该质谱分析方法快速、稳定、可靠、准确。

由于肽段在样品酶解的过程中会发生部分降解，且样品处理过程中肽段也可能发生损失，因此，越早将内标肽段与特征肽段混合，理论测定结果越可靠。

在本发明应用较佳的实施例中，上述液相色谱-质谱分析中液相色谱的条件为：采用peptidecsh^tmc18色谱柱，色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为39-40℃；流动相a为甲酸体积百分数占0.1-0.15％的水；流动相b为甲酸体积百分数占0.1-0.15％的乙腈；进行梯度洗脱50-55min，进样量为9-10μl，流速为0.3-0.35ml/min。

在本发明应用较佳的实施例中，上述梯度洗脱的程序包括：0-3min，3％体积百分数的流动相b，97％体积百分数的流动相a；3-45min，45％的流动相b，55％的流动相a；45-47min，100％的流动相b；47-52min，100％的流动相b；52-52.1min，100％的流动相b；52.1-55min，3％的流动相b，97％的流动相a。

经发明人进行大量的试验摸索，发现在上述液相色谱分析的条件下，实验结果更准确，误差更小。

在本发明应用较佳的实施例中，上述液相色谱-质谱分析中质谱分析的条件为：雾化压力为50-55psi，鞘气温度400-410℃，毛细管电压5500-5800v。

在本发明应用较佳的实施例中，上述特征肽段母子离子对分别为593.6和699.3，内标肽段母子离子对分别为596.8和705.3；自动优化mrm参数分别为dp120、ce25和cxp27。

在上述质谱分析条件下，能够最大限度地提高蛋白样品测定的准确性。

在本发明应用较佳的实施例中，上述方法还包括筛选血浆样品中利妥昔单抗的特征肽段，筛选方法包括如下步骤：将血浆样品进行前处理，将前处理后的产物进行液相色谱-质谱分析，并通过软件分析得到利妥昔单抗理论肽段，将分析结果与利妥昔单抗理论肽段比对，初步筛选出利妥昔单抗的特征肽段。

在本发明应用较佳的实施例中，上述筛选血浆样品中利妥昔单抗的特征肽段还包括使用blast和uniprot软件，比对大鼠血浆和初步筛选出利妥昔单抗的特征肽段。

在本发明应用较佳的实施例中，将前处理后的产物进行液相色谱分析的条件为：采用peptidecsh^tmc18色谱柱，色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为39-40℃；流动相a为甲酸体积百分数占0.1-0.15％的水；流动相b为甲酸体积百分数占0.1-0.15％的乙腈；进行梯度洗脱50-55min，进样量为9-10μl，流速为0.3-0.35ml/min。

在本发明应用较佳的实施例中，上述梯度洗脱的程序包括：0-3min，3％体积百分数的流动相b，97％体积百分数的流动相a；3-45min，45％的流动相b，55％的流动相a；45-47min，100％的流动相b；47-52min，100％的流动相b；52-52.1min，100％的流动相b；52.1-55min，3％的流动相b，97％的流动相a。

在本发明应用较佳的实施例中，上述前处理包括：将血浆样品依次进行变性、还原、烷基化和酶解处理。

变性处理血浆样品，以使血浆样品中的蛋白质展开可以更好的进行后续处理，未变性的具有三维高级结构的蛋白质不利于后续的还原、烷基化以及酶解处理。

在其他实施例中，也可以采用其他物理变性、化学变性或加热变性的方式。

还原处理以使得蛋白质中的二硫键打开，以利于后续的烷基化和酶解。

烷基化处理可以封闭打开的二硫键，以防止重新形成二硫键，影响酶切的效率，从而对检测的准确性产生不利影响。

酶解是通过酶将蛋白质在特定的酶切位点切成肽段，酶切位点根据所用的酶的种类而不同。

在本发明应用较佳的实施例中，上述变性包括采用变性剂对血浆样品进行变性。通过变性处理以破坏蛋白的三维结构。

在本发明可选的实施方式中，上述变性剂为盐酸胍，尿素或十二烷基硫酸钠。在其他方式中，也可以根据需要选用其他蛋白变性剂。

在本发明可选的实施方式中，上述还原包括采用还原剂对变性处理的血浆样品进行二硫键的还原。

在本发明可选的实施方式中，上述还原剂为dtt或tcep，还原剂为1-1.5m的dtt。二硫苏糖醇(dithiothreitol，简称为dtt)是一种小分子有机还原剂，化学式为c4h10o2s2。其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。tcep为三(2-羧乙基)膦。

在本发明可选的实施方式中，上述烷基化包括采用烷基化试剂进行烷基化处理。

在本发明可选的实施方式中，上述烷基化试剂为iaa或iam。烷基化试剂为1-1.2m的iaa。iaa为碘乙酰胺，iam为碘乙酸，在其他实施例中，可以根据需要选择其他烷基化试剂。

在本发明可选的实施方式中，上述酶解为使用胰蛋白酶酶切处理。胰蛋白酶能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。

酶解过程中添加bsa，bsa的质量体积百分数为1-1.5％。在酶解缓冲液中加入bsa，可以有效的解决当前实验过程中多肽吸附这一常见问题，可使检测结果更加准确。

在本发明可选的实施方式中，上述内标肽段的两端比特征肽段的两端分别多引入至少三个氨基酸，且内标肽段两端引入的氨基酸数目相等。

设计合成的内标肽段与特征肽段的区别在于，内标肽段的两端分别含有至少三个引入的氨基酸，且内标肽段上含有同位素标记的氨基酸。为了节约合成成本，同时兼顾检测结果的准确性，本发明设置内标肽段两端分别含有至少三个引入的氨基酸。在其他实施方式中，可以根据需要增加引入的氨基酸数目和种类。

内标肽段两端引入的氨基酸数目相等。这样可以减少酶的选择性，保证酶切位点可以同时被酶进行酶切。

在本发明可选的实施方式中，上述内标肽段n端引入的氨基酸从n端起依次为丝氨酸、酪氨酸和赖氨酸，内标肽段c端引入的氨基酸从n端起依次为丝氨酸、酪氨酸和丝氨酸。

在本发明可选的实施方式中，上述内标肽段所含的稳定同位素标记是针对内标肽段中的脯氨酸的n和c元素分别进行15n和13c标记。

由于蛋白质的结构复杂，蛋白质的酶解速率和酶解程度对测定结果也会产生影响，稳定同位素标记的蛋白质或肽段串联体等方法是通过同步酶解过程以降低酶解过程带来的误差，但稳定同位素标记的蛋白质或串联体的制备过程相对复杂且成本较高。本发明设计带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作为内标肽段，在蛋白样品酶解前加入内标肽段，进行同步酶解和样品处理过程，以最大限度地提高蛋白样品测定的准确性。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法，该方法以一条特征肽段来代表利妥昔单抗进行定量，为了降低样品的处理过程对测定结果的影响，设计合成了带有酶切位点的稳定同位素标记肽段，并以此标记肽段为内标肽段。使内标肽段和特征肽段进行同步酶解，这样最大限度地提高了蛋白样品测定的准确性。将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，即可求得血浆样品中利妥昔单抗浓度。本发明采用采用蛋白质组学研究方法中的自下而上(thebottom-upapproach)方法，即将肽段或者蛋白用酶消化成更小的肽段，然后再选取特征肽段，基于液相色谱-串联质谱技术，采用mrm(多反应监测)模式对特征肽段进行扫描分析，建立一种对利妥昔单抗药物的体内绝对定量分析方法。该质谱分析方法快速、稳定、可靠、准确。本发明提供的分析方法对其他蛋白类药物的要带动力学研究具有指导借鉴意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中单抗酶解后特征肽段标准品的色谱图；

图2为实施例1合成的稳定同位素内标肽段的色谱图；

图3为实施例2中血浆样品中特征肽段的色谱图；

图4为实施例3中血浆样品中稳定同位素内标肽段的色谱图；

图5为实施例4空白血浆酶解后不含特征肽段的色谱图；

图6为实施例5空白血浆酶解后不含稳定同位素内标肽段的色谱图；

图7为实施例6单抗大鼠血浆的标准曲线；

图8为实施例7不同给药剂量得到的大鼠血浆样品中单抗药物rituximab的药时曲线；

图9为对比例1中血浆样品中特征肽段的色谱图；

图10为对比例1中血浆样品中稳定同位素内标肽段的色谱图；

图11为对比例2中血浆样品中特征肽段的色谱图；

图12为对比例2中血浆样品中稳定同位素内标肽段的色谱图；

图13为对比例3中血浆样品中特征肽段的色谱图；

图14为对比例3中血浆样品中稳定同位素内标肽段的色谱图；

图15为对比例4中血浆样品中特征肽段的色谱图；

图16为对比例4中血浆样品中稳定同位素内标肽段的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法，其包括如下步骤：

(1)筛选特征肽段。

将20μl含利妥昔单抗的大鼠血浆(南京吉特恩生物科技有限公司)中加入加入80μl甲醇沉淀血浆中的蛋白，利妥昔单抗在血浆中的终浓度为1μg/ml，-20℃，20分钟，然后13000rpm离心15分钟，去除上清。放入离心浓缩机中旋干，去除掉沉淀中残留的甲醇，避免其对后续实验的影响。向旋干后的沉淀中加入50μl50mm的nh4hco3缓冲液，涡旋至沉淀变成均匀生物蛋白悬浮液。将ep管中的样品转移到1.5ml的超滤离心管中，加入100μl50mm的nh4hco3缓冲液，14000g，15min，重复两次。

然后加入100μl7m的盐酸胍进行变性，加入4μl1m的dtt使蛋白样品的二硫键还原，在55℃反应60min。再加入10μl1m的iaa进行烷基化，25℃避光反应30min。烷基化反应后，14000g，15min，离心2次。加入100μl50mm的nh4hco3缓冲液，置换两次，14000g，15min，离心2次。离心后将超滤管至于新的ep管中，加入100μl50mm的nh4hco3缓冲液，12μl1mg/ml的trypsin(胰蛋白酶)溶液，涡旋混匀，37℃过夜酶切。酶切完后，1000g，3min，倒扣收集样品。最后加入2μl甲酸终止反应。

将样品离心浓缩干，加入100μl20％乙腈复溶，得到前处理后的样品。取10μl前处理后的样品进行液相色谱-质谱分析。

液相色谱分析的条件为：采用美国waters公司peptidecsh^tmc18色谱柱，色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为40℃；流动相a为甲酸体积百分数占0.1％的水；流动相b为甲酸体积百分数占0.1％的乙腈；进行梯度洗脱55min，进样量为10μl,自动进样器温度保持4℃。检测系统串联三重四极杆液相质谱。

梯度洗脱的程序包括：0-3min，3％体积百分数的流动相b，97％体积百分数的流动相a；3-45min，45％的流动相b，55％的流动相a；45-47min，100％的流动相b；47-52min，100％的流动相b；52-52.1min，100％的流动相b；52.1-55min，3％的流动相b，97％的流动相a。

液相色谱-质谱分析中质谱分析的条件为：雾化压力为50psi，鞘气温度400℃，毛细管电压5500v。使用blast和uniprot软件，得到利妥昔单抗理论肽段。将质谱分析结果与理论肽段比对，初步筛选出可用来定量抗体的特征性肽段。再使用blast和uniprot软件，对比大鼠血浆和利妥昔单抗的肽段序列，通过理论分析比对，最终确定了特征肽段为gpsvfplapssk。

特征肽段母子离子对分别为593.6和699.3。

特征肽段酶解后记录色谱图，参照图1所示，在16.26min时有最大单一吸收峰。

在特征肽段确定的基础上，设计合成带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作为内标肽段。本实施例中，在特征肽段的两端分别引入3个氨基酸，并对标肽段中的脯氨酸的n和c元素分别进行15n和13c标记。内标肽段为：stkgpsvfplap*[¹⁵n，¹³c]ssksts。

内标肽段母子离子对分别为596.8和705.3；自动优化mrm参数分别为dp120、ce25和cxp27。内标肽段的液相色谱-质谱参数与上述特征肽段的参数均相同。内标肽段在血浆中的终浓度为0.03μg/ml。

稳定同位素内标肽段的色谱图参照图2所示，在16.26min时有最大单一吸收峰。该色谱结果与图1一致，即证明本发明实施例1提供的内标肽段具有与特征肽段相同的酶切位点。

实施例2

本实施例提供了一种标准曲线样品的制备方法，包括如下步骤：

(1)取适量利妥昔单抗储备液(货号：43492，罗氏10μg/μl)，用水分别稀释成1μg/ml、0.75μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml，得到利妥昔单抗标准系列溶液，于4℃冰箱保存备用。

(2)分别取10μl利妥昔单抗标准系列溶液置于2mlep管中，加入10μl大鼠空白血浆(南京吉特恩生物科技有限公司)混匀、加入80μl甲醇沉淀血浆中的蛋白，-20℃，20分钟，然后13000rpm离心15分钟，去除上清。放入离心浓缩机中旋干，去除掉沉淀中残留的甲醇，避免其对后续实验的影响。向旋干后的沉淀中加入50μl50mm的nh4hco3缓冲液，涡旋至沉淀变成均匀生物蛋白悬浮液。将ep管中的样品转移到1.5ml的超滤离心管中，加入100μl50mm的nh4hco3缓冲液，14000g，15min，重复两次。

(3)然后加入100μl7m的盐酸胍，4μl1m的dtt使二硫键还原，55℃反应60min。再加入10μl1m的iaa进行烷基化，25℃避光反应30min。反应结束后，14000g，15min，离心2次。加入100μl50mm的nh4hco3缓冲液,置换两次，14000g，15min，离心2次。离心完后将超滤管至于新的ep管中，加入100μl50mm的nh4hco3缓冲液，12μl1mg/ml的trypsin溶液，3μl0.01μg/μl的is，涡旋混匀，37℃过夜酶切。酶切完后，1000g，3min，倒扣收集样品。最后加入2μl甲酸终止反应。is为同位素标记的内标肽段。

将样品离心浓缩干，加入100μl20％乙腈复溶，得到标准曲线样品，取10μl样品进行液相色谱-串联质谱分析。记录色谱图，参照图3所示，单抗在血浆中的终浓度1ug/ml，在16.22min时有最大单一吸收峰。即含有特征肽段的血浆样品具有与图1中单抗酶解后特征肽段标准品一致的试验结果。

实施例3

为验证实施例1合成的稳定同位素内标肽段的稳定性，与实施例2的区别仅在于上述步骤(3)在加入10μl1m的iaa进行烷基化，25℃避光反应30min。反应结束后，14000g，15min，离心2次。加入100μl50mm的nh4hco3缓冲液，置换两次，14000g，15min，离心2次。离心后将超滤管至于新的ep管中，加入100μl50mm的nh4hco3缓冲液，12μl1mg/ml的trypsin溶液，3μl0.01μg/μl的is，3μl实施例1制备得到浓度为1μg/ml的内标肽段涡旋混匀，37℃过夜酶切。酶切完后，1000g，3min，倒扣收集样品。最后加入2μl甲酸终止反应。取10μl样品进行液相色谱-串联质谱分析。记录色谱图，参照图4所示，内标终浓度0.01ug/ml在16.22min时有最大单一吸收峰，该色谱结果与图3一致，即证明本发明实施例1提供的内标肽段具有与特征肽段相同的酶切位点。

实施例4

为排除空白大鼠血浆的影响因素，本实施例采用空白大鼠血浆作为对照，与实施例2的区别仅在于步骤(2)中不含利妥昔单抗标准系列溶液，其余步骤相同。记录色谱图，参照图5所示，在16.26min时基本无吸收峰，该色谱结果显示实施例2采用的空白大鼠血浆中不含利妥昔单抗，即证明本发明实施例1提供的特征肽段特异性好。

实施例5

为排除空白大鼠血浆的影响因素，本实施例采用空白大鼠血浆作为对照，与实施例3的区别仅在于步骤(2)中不含利妥昔单抗标准系列溶液，其余步骤相同。记录色谱图，参照图6所示，在16.26min时基本无吸收峰，该色谱结果显示实施例3采用的空白大鼠血浆中不含利妥昔单抗，即证明本发明实施例1提供的内标肽段特异性好。

实施例6

按照实施例1的制备方法，以单抗浓度为横坐标，特征肽段峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线参照图7所示，标曲为y＝0.0275x-0.018，r²＝0.9995。绘制标准曲线的原始数据参照表1所示。本实验过程均在10k超滤离心管中操作，可有效去除掉血浆中少量杂蛋白进一步纯化浓缩，过程方便脱盐和置换溶液，减少操作步骤避免操作带来的误差，使结果更加准确。

表1绘制标曲的原始数据表。

实施例7

本实施例分别采用10mg/kg和63mg/kg的两个剂量对大鼠进行静脉推注给药，对两组剂量大鼠分别按给药(0h)和给药后0.5，2，4，8，24，48，96，168h采集血液，进行前处理酶解，质谱分析，实验过程按照标准曲线样品的制备过程。通过标准曲线测得各采血时间点的血浆药物浓度，得到高、低剂量利妥昔单抗的药物浓度-时间曲线，参照图8所示。

对比例1

本对比例与实施例1的区别仅在于，特征肽段和内标肽段的液相色谱分析的条件不同，特征肽段在血浆中的终浓度为80μg/ml，内标肽段在血样中的终浓度为0.03μg/ml，其余制备步骤相同。

特征肽段的液相色谱分析条件为：采用美国waters公司peptidecsh^tmc18色谱柱，色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为40℃；流动相a为甲酸体积百分数占0.1％的水；流动相b为甲酸体积百分数占0.1％的乙腈；进行梯度洗脱13min，进样量为10μl,自动进样器温度保持4℃。检测系统串联三重四极杆液相质谱。

梯度洗脱的程序包括：0-0.7min，3％体积百分数的流动相b，97％体积百分数的流动相a；0.7-11min，45％的流动相b，55％的流动相a；xmin，100％的流动相b；11.1-12min，100％的流动相b；12-12.1min，100％的流动相b；12.1-13min，3％的流动相b，97％的流动相a。

特征肽段母子离子对分别为593.6和699.3。

特征肽段酶解后记录色谱图，参照图9所示，在5.6min时有最大吸收峰。

稳定同位素内标肽段的色谱图参照图10所示，在5.6min时有最大吸收峰。

对比例2

本对比例与对比例1的区别仅在于，特征肽段和内标肽段的液相色谱分析的条件不同，特征肽段在血浆中的终浓度为80μg/ml，内标肽段在血样中的终浓度为0.03μg/ml，其余制备步骤相同。

特征肽段的液相色谱分析条件为：采用美国waters公司peptidecsh^tmc18色谱柱，色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为40℃；流动相a为甲酸体积百分数占0.1％的水；流动相b为甲酸体积百分数占0.1％的乙腈；进行梯度洗脱20min，进样量为10μl,自动进样器温度保持4℃。检测系统串联三重四极杆液相质谱。

梯度洗脱的程序包括：0-1min，3％体积百分数的流动相b，97％体积百分数的流动相a；1-16.5min，45％的流动相b，55％的流动相a；16.5-17min，100％的流动相b；17-19min，100％的流动相b；19-19.1min，100％的流动相b；19.1-20min，3％的流动相b，97％的流动相a。

特征肽段母子离子对分别为593.6和699.3。

特征肽段酶解后记录色谱图，参照图11所示，在9.75min时有最大吸收峰。

稳定同位素内标肽段的色谱图参照图12所示，在9.75min时有最大吸收峰。

对比例3

本对比例与对比例1的区别仅在于，特征肽段和内标肽段的液相色谱分析的条件不同，特征肽段在血浆中的终浓度为80μg/ml，内标肽段在血样中的终浓度为0.03μg/ml，其余制备步骤相同。

特征肽段的液相色谱分析条件为：采用美国waters公司peptidecsh^tmc18色谱柱，色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为40℃；流动相a为甲酸体积百分数占0.1％的水；流动相b为甲酸体积百分数占0.1％的乙腈；进行梯度洗脱55min，进样量为10μl,自动进样器温度保持4℃。检测系统串联三重四极杆液相质谱。

梯度洗脱的程序包括：0-3min，3％体积百分数的流动相b，97％体积百分数的流动相a；3-45min，45％的流动相b，55％的流动相a；45-47min，100％的流动相b；47-52min，100％的流动相b；52-52.1min，100％的流动相b；52.1-55min，3％的流动相b，97％的流动相a。

特征肽段母子离子对分别为593.6和699.3。

特征肽段酶解后记录色谱图，参照图13所示，在16.35min时有最大吸收峰。

稳定同位素内标肽段的色谱图参照图14所示，在16.33min时有最大吸收峰。

对比例4

本对比例与对比例1的区别仅在于，特征肽段和内标肽段的液相色谱分析的条件不同，特征肽段在血浆中的终浓度为80μg/ml，内标肽段在血样中的终浓度为0.03μg/ml，其余制备步骤相同。

特征肽段的液相色谱分析条件为：采用美国waters公司peptidecsh^tmc18色谱柱，色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为40℃；流动相a为甲酸体积百分数占0.1％的水；流动相b为甲酸体积百分数占0.1％的乙腈；进行梯度洗脱100min，进样量为10μl,自动进样器温度保持4℃。检测系统串联三重四极杆液相质谱。

梯度洗脱的程序包括：0-5min，3％体积百分数的流动相b，97％体积百分数的流动相a；5-82min，45％的流动相b，55％的流动相a；82-85min，100％的流动相b；85-95min，100％的流动相b；95-95.1min，100％的流动相b；95.1-100min，3％的流动相b，97％的流动相a。

特征肽段母子离子对分别为593.6和699.3。

特征肽段酶解后记录色谱图，参照图15所示，在24.37min时有最大吸收峰。

稳定同位素内标肽段的色谱图参照图16所示，在24.35min时有最大吸收峰。

由上述对比例1-4可知，本发明实施例1提供的色谱洗脱时间在55min时实验结果最好，特征肽段和内标的响应值最高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。