免疫印迹一步法的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种免疫印迹一步法。

背景技术：

免疫印迹试验即westernblot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织蛋白样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

westernblot常规实验流程为：制胶→电泳→转膜→封闭→一抗→二抗→曝光，实验周期长，整个流程花费的时间在2天左右，实验流程复杂，且需要多步条件优化。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明通过筛选合适条件的一抗和二抗，将一抗和二抗混合一起孵育，在保证实验灵敏度的情况下，缩短了westernblot的实验周期，提高检测效率。

为实现上述目的，本发明所提供的免疫印迹一步法，采用的试剂包括二抗和良级一抗，步骤为：

a)样品依次进行电泳、转膜；

b)转膜后，将印迹膜与二抗和良级一抗同时孵育，直至达到后续显色标准；

c)随后洗膜进行显色；

其中，所述二抗为与良级一抗能匹配使用的二抗；

所述良级一抗为通过抗体分级方法检测的一抗；所述抗体分级检测方法为：采样三个或以上不同生物类别来源的样本，经常规免疫印迹实验检测后，进行曝光，所产生条带结果满足条件的为良级一抗，所述条件为：

1)至少3个泳道有单一目的条带，有目的条带的泳道无杂带，其余泳道无带；

或2)至少3个泳道有单一目的条带且有目的条带的泳道有杂带，杂带位于与目的条带间隔2个marker以上的位置；

所述条带为经图像识别软件分析，灰度值180以上的条带。

上述方案中，所述检测到目的条带的常规方法为肉眼可见或通过imagej分析，灰度值>180。

优选地，所述抗体分级检测方法中，同一生物类别来源的所述样本的数量大于等于3。

优选地，所述生物类别为人、小鼠和大鼠。

优选地，上述方案在执行时，优选采用9个样本(来源于3钟不同生物)，检测后有1/3或以上的样本产生目的条带。

优选地，所述抗体分级检测方法中，常规免疫印迹实验检测时，总蛋白上样量为30μg，抗体1:1000稀释；曝光时间为1s。

优选地，所述步骤b)中孵育过程还添加有稳定剂、保护剂、防腐剂，其中，所述防腐剂为硫柳汞，所述保护剂为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钾，所述稳定剂为甘油。

优选地，所述步骤b)中孵育时间为90～120min。

优选地，所述步骤c)洗膜为多次，采用洗剂为tbst。

现对于现有技术，本发明的有益效果为：

1.试剂稳定性好，需要在2-8℃保存，如果长期不用可于-20℃保存，至少半年有效。

2.通过控制试剂中一抗和二抗的比例，在保证实验灵敏度的情况下，使一抗和二抗稳定共存。

2.免疫印迹一步法的流程为：制胶→电泳→转膜→封闭+一抗+二抗→曝光，相对于常规免疫印迹，将孵育过程从两步改成一步，而且孵育后，简单洗涤即可进行发光或显色检测，操作简单，缩短实验周期。

附图说明

图1：实施例1中免疫印迹常规实验与免疫印迹一步法的对比图；

图2：实施例2中免疫印迹常规实验与免疫印迹一步法的对比图；

图3：实施例3中免疫印迹常规实验与免疫印迹一步法的对比图；

图4：实施例4中免疫印迹常规实验与免疫印迹一步法的对比图；

图5：实施例5中免疫印迹常规实验与免疫印迹一步法的对比图；

图6：实施例6中试剂保存90天后的检测图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步阐述，但并不作为对本发明的限定。

实验材料

实施例所用细胞：lo2、a549、a431、raji、k562、hepg2、u251、mcf7、hela、nih/3t3、h460。

实施例所用组织范围小鼠组织和大鼠组织，小鼠(mice)组织：心脏(heart)、肾脏(kidney)、脑(brain)、肝脏(liver)、睾丸(testis)、胸腺(thymus)；大鼠(rat)组织：心脏(heart)、脑(brain)、肝脏(liver)、胸腺(thymus)、脾(spleen)、肺(lung)。

实验试剂，trisbase:国药集团，gly:国药集团，丙烯酰胺：国药集团，甲叉双丙烯酰胺：国药集团，tween-20：国药集团，十二烷基硫酸钠(sds)(片状)：sigma，western及ip细胞裂解液(无抑制剂)：上海碧云天，temed(n,n,n’,n’-四甲基乙二胺)：国药集团，过硫酸铵：国药集团，氯化钠：国药集团，磷酸二氢钾：国药集团，磷酸氢二钠：国药集团，溴酚蓝：国药集团。

实验耗材及仪器，nc膜(0.4μm)：merckmillipore，蛋白制胶及电泳系统：北京六一仪器厂，湿式转膜装置：上海天能，x胶片：柯达

主要试剂的配置

6×sds-page：依次量取50ml100％甘油，12gsds和30ml1mtris-hcl(ph＝6.8)，搅拌溶解后，称取0.6g溴酚蓝于烧杯中，用100ml容量瓶定容至100ml。-20℃冻存，使用前加入dtt。

30％丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺：称取丙烯酰胺290g，甲叉双丙烯酰胺10g，加入600ml去离子水搅拌溶解后，定容至1l，过滤后4℃保存。

10％sds：称取50gsds，加入400ml去离子水，搅拌溶解后定容至500ml，过滤后使用。

10％ap：称取8gap，加入6ml去离子水，震荡溶解后定容至8ml。

1.5mtris-hcl(ph＝8.8)：称取181.7gtris加入800ml去离子水，搅拌溶解后，调ph至8.8，定容至1l，过滤后使用。

1mtris-hcl(ph＝6.8)：称取60.6gtris加入400ml去离子水，搅拌溶解后，调ph至6.8，定容至500ml，过滤后使用。

5×sds-page电泳缓冲液：依次称取tris15.1g，甘氨酸94g，sds5g，加入800ml去离子水，搅拌溶解后定容至1l。

转膜缓冲液：依次称取tris3.03g，甘氨酸14.48g，加入600ml去离子水，200ml乙醇，搅拌溶解后定容至1l。

tbst：依次称取氯化钠8.8g，tris3g，加入800ml去离子水，搅拌溶解后加入1mltween-20，调ph至7.4，定容至1l。

本发明涉及的wb显色过程(现有技术)：

ecl化学发光由辣根过氧化物酶(hrp)催化发生化学反应，发出荧光，然后通过x光片压片展现。

发光原理：在ecl底物中，溶液a主要成分为luminol及特制发光增强剂，溶液b主要成分为h2o2及特殊稳定剂，发光液a和b在hrp的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生产一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生自发光，波长430nm左右。

实施例1

1、蛋白质的提取

(1)细胞蛋白提取

a.细胞培养至合适数量，收集细胞，按照5×10⁷加入1ml裂解液的比例加入对应体积的裂解液；

b.将细胞混匀，至于冰上裂解20min，每隔5min置于涡旋振荡仪上震荡10s；

c.4℃,12000rpm，离心15min；

d.收集上清，即为细胞总蛋白提取物，按照1:5(1体积蛋白提取物加入5体积6×loadingbuffer)的比例，加入6×loadingbuffer，95℃加热变性10min,待液体完全冷却后置于-20℃保存，用于后续实验。

(2)组织蛋白提取

a.用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，取少量的组织置于已预冷匀浆器球状部位，先将剪碎的组织直接进行匀浆，待组织研磨成肉糜状，再加入裂解液；

b.按照0.5ml裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎，置于冰上裂解15min；

c.4℃，12000rpm，离心15min；

d.收集上清，即为组织总蛋白提取物，按照1:5(1体积蛋白提取加入5体积6×loadingbuffer)的比例，加入6×loadingbuffer，95℃加热变性10min,待液体完全冷却后置于-20℃保存，用于后续实验。

2、凝胶电泳

a.安装制胶器，使用1.0mm玻板；

b.分离胶配制

按照配方加入30％丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺，1.5mtris-hcl(ph8.8)，10％sds，10％ap和temed混合均匀后加入玻板中，并缓缓加入异丙醇封胶。室温下放置30min，待分离胶完全凝固；

c.浓缩胶配制

待分离胶完全凝固后，倒掉所有的异丙醇，加入1.5ml浓缩胶，插样品梳。温室下静置20min；

d.点样

待浓缩胶完全凝固后，拔出样品梳，拨正上样孔间胶条。待样本完全溶解后，按照所需样本依次点样；

e.恒压电泳，80v电压浓缩胶电泳，待30min后，蛋白进入分离胶且marker开始分离时，调节电压至120v；

f.电泳结束后，分开两块玻板，拨胶，切除浓缩胶。

3、转膜

a.提前准备好相关转膜所需试剂、耗材；

b.转印三明治制备：转膜样品夹黑色面-海绵-三层滤纸-凝胶-nc膜-三层滤纸-海绵-转膜样品夹红色面；

c.将转膜样品夹合上，拉上夹锁，插入到转膜槽中，转膜样品夹的黑色面朝转移槽的黑色面，透明面朝转移槽的红色面，有夹锁的一侧在上；

e.向转膜槽中加入事先冷却的转膜缓冲液，盖上盖子，接通电源，调好相应转膜电流值。

f.转印完成后，将膜取出，置于抗体孵育盒中。

4、封闭和抗体孵育

取一抗：vdac1rabbitpolyclonalantibody(爱博泰克公司，产品号a11242)，稀释比为1:1000；取相应二抗hrpgoatanti-rabbitigg(h+l)(爱博泰克公司，产品号as014)，稀释比1:4000，加入3％vol脱脂牛奶中，混合均匀后，加入抗体孵育盒中，室温反应2小时。

5、显色

a.抗体孵育完成后，洗膜：tbst洗5次，每次5min；

b.洗膜后用镊子nc膜夹起竖着贴于孵育槽内壁，让膜上多余的液体可以自然流下，按1:1比例配置显色液，均匀混合，每张膜所需底物混合物600μl；

c.将膜置于暗匣中，均匀加入混合后底物，反应1min，擦去多余底物，盖上暗匣，进入暗室；

d.使用x胶片进行显影及定影；

e.胶片标记，将相关样本信息及胶片信息标注在胶片上对应位置。

具体检测结果如图1所示，其中左图为采用常规实验流程得到的，右图为采用本实施例的方法得到的。

实施例2

步骤1～3同实施例1。

4、封闭和抗体孵育

取一抗：sod2rabbitpolyclonalantibody(爱博泰克公司，产品号：a1340)，稀释比为1:1000；取二抗hrpgoatanti-rabbitigg(h+l)(爱博泰克公司，产品号：as014)，稀释比1:4000，加入3％vol脱脂牛奶中，混合均匀后，加入抗体孵育盒中，室温反应2小时。

步骤5同实施例1。

具体检测结果如图2所示，其中左图为采用常规实验流程得到的，右图为采用本实施例的方法得到的。

实施例3

步骤1～3同实施例1。

4、封闭和抗体孵育

取一抗：h2afxrabbitpolyclonalantibody(爱博泰克公司，产品号：a11361)，稀释比为1:1000；取二抗hrpgoatanti-rabbitigg(h+l)(爱博泰克公司，产品号：as014)，稀释比1:4000，加入3％vol脱脂牛奶中，混合均匀后，加入抗体孵育盒中，室温反应2小时。

步骤5同实施例1。

具体检测结果如图3所示，其中左图为采用常规实验流程得到的，右图为采用本实施例的方法得到的。

实施例4

步骤1～3同实施例1。

4、封闭和抗体孵育

取一抗：hspa5rabbitpolyclonalantibody(爱博泰克公司，产品号：a11366)，稀释比为1:1000；取二抗hrpgoatanti-rabbitigg(h+l)(爱博泰克公司，产品号：as014)，稀释比1:4000，加入3％vol脱脂牛奶中，混合均匀后，加入抗体孵育盒中，室温反应2小时。

步骤5同实施例1。

具体检测结果如图4所示，其中左图为采用常规实验流程得到的，右图为采用本实施例的方法得到的。

实施例5

步骤1～3同实施例1。

4、封闭和抗体孵育

取一抗：stmn1抗体，稀释比为1:1000；取二抗hrpgoatanti-rabbitigg(h+l)(爱博泰克公司，产品号：as014)，稀释比1:1000，加入3％vol脱脂牛奶中，混合均匀后，加入抗体孵育盒中，室温反应2小时。

步骤5同实施例1。

具体检测结果如图5所示，其中左图为采用常规实验流程得到的，右图为采用本实施例的方法得到的。

实施例6

采用实施例2相同的一抗、二抗及实验方法，不同之处在于，抗体孵育时的一抗和二抗构成的孵育液并非现配，而是事先配置好的，并于-20℃保存了90天。

上述抗体孵育液中包括一抗(sod2rabbitpolyclonalantibody(爱博泰克公司，产品号：a1340)，稀释比为1:1000)、二抗(hrpgoatanti-rabbitigg(h+l)(爱博泰克公司，产品号：as014)，稀释比1:4000)、3％vol脱脂牛奶、0.01％wt硫柳汞、氯化钠(0.008g/ml)、磷酸氢二钠(0.0036g/ml)，磷酸氢二钾(0.00024g/ml)，氯化钾(0.0002g/ml)，50％vol甘油。

采用同样的方法显色后，具体检测结果如图6所示，其中左图为采用常规实验流程得到的，右图为采用本实施例的方法得到的。

检测结果分析

从图1～5中可知，实施例1～5中所用的一抗均为特异性好且效价高的抗体，具体的：在免疫印迹常规实验中，实施例1～4中的一抗上样9个样本，均有8个以上有目的条带；实施例5的一抗上样9个样本，有5个目的条带。对比其一步法说的胶图，可知这几种抗体，采用本发明提供的免疫印迹一步法具有不亚于免疫印迹常规实验相同的检测效果。各实施例中，常规免疫印迹法的实验流程为：3％vol脱脂牛奶封闭1h→一抗过夜(4℃，一抗稀释度同一步法相同)→二抗(室温，二抗稀释度同一步法相同)1h，其他步骤均与一步法相同。

从实施例6、以及图2和图6可知，加入本发明提供的免疫印迹用的试剂在加入保护剂、防腐剂和稳定剂后，能长期稳定保存，且试剂经过长期保存后用于免疫印迹一步法仍能保证较好的检测结果。

当然，以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。