本发明属于淡水养殖的
技术领域：
：，涉及基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法。
背景技术：
：：目前，国内外学者对嗜水气单胞菌的生物学特性、流行病学特征、快速鉴定、分型及其蛋白质组学等研究已有了很大进展。针对虾类免疫机制的研究主要集中在海水养殖虾中，对中国对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾等海水虾的免疫基因及免疫相关蛋白的研究取得了较丰富的成果。海水虾类的研究结果固然能为淡水虾类的免疫机制研究提供参考，然而淡水养殖虾类同海水养殖虾类毕竟暴露于不同的生长环境，面对的外界刺激不同，具有淡水养殖环境的特异性。现阶段的研究结果极大的丰富了日本沼虾抗感染免疫的基因数据，然而，随着对基因组研究的深入，人们认识到单纯从基因组信息并不能完全揭示生命的奥秘。因为只有蛋白质才是生命活动的功能载体，有功能的蛋白质是基因在转录、翻译甚至是翻译后经过剪接加工产生的，而蛋白质翻译后功能修饰并不是由基因决定。目前对嗜水气单胞菌感染后沼虾血细胞的蛋白质组研究还未见报道。蛋白非标记定量技术(labelfree)是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标记，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。缺点：对质谱的重复性要求比较高；分析复杂样品的能力不如标记定量方法。silac(stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture)标记是一种代谢型的标记技术。利用天然同位素(轻型)和稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的必需氨基酸完全掺入到细胞新和成的蛋白质中替代原有的氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白质按细胞数或蛋白量等比例混合、纯化后进行质谱鉴定。最后通过比较一级质谱图中轻、重同位素标记的肽段峰面积，从而对于不同细胞样品的同一蛋白质进行相对定量。但是也存在以下不足：对于生物医学研究中常用的组织样品，体液样品等无法分析；对于动物模型的标记成本太大，无法实现。双向电泳技术(2-de)：蛋白质首先根据其等电点在ph梯度胶内等电聚焦，然后按照它们的相对分子量大小进行sds-page第二次电泳分离，从而获得二维的蛋白质分离图谱。缺点：适用于丰度较高的蛋白，并且对于疏水性、极碱或极酸性蛋白不适合；对样本的需求量较大，原则上每个样品不低于1mg。同位素标记相对和绝对定量技术，itraq(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation)，是一种体外同位素标记技术，是蛋白质组学定量研究技术。该技术利用4种或8种同位素试剂标记多肽末端氨基或赖氨酸侧链氨基基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白质表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。技术实现要素：本发明的目的在于对嗜水气单胞菌感染后沼虾血细胞的蛋白质组进行分析，提出了基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法，应用itraq技术检测嗜水气单胞菌感染日本沼虾0h、12h、24h、36h后血细胞中的差异表达蛋白，并进行go功能分类和kegg信号通路分析。本发明是采用以下的技术方案实现的：本发明提供了一种基于蛋白质组学定量技术分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质的方法，包括以下步骤：(1)提取感染嗜水气单胞菌的日本沼虾的血淋巴，分离血细胞，裂解细胞提取蛋白质；(2)对步骤(2)获得的蛋白质进行胰蛋白酶酶解，对酶解肽段进行itraq标记；(3)对步骤(3)标记的肽段进行纯化、液相色谱分离和质谱分析；(4)对步骤(3)获得的质谱分析结果进行蛋白质鉴定和定量分析及生物信息学分析，分析获得差异表达蛋白质。具体的，所述步骤(1)具体包括从感染后的日本沼虾围心腔中抽取血淋巴，与抗凝剂混合，将混合物低温离心，去上清，再加入质量浓度0.85％nacl溶液洗涤血细胞。具体的，所述步骤(3)液相色谱分离具体包括以下步骤：(3.1)色谱柱以a液平衡，将步骤(2)中已itraq标记的肽段由进样器上样到色谱柱进行分离，流速为1ml/min；液相梯度如下：0-25min，b液线性梯度从0％-10％；25min-32min，b液线性梯度从10％-20％；32min-42min，b液线性梯度从20％-45％；42min-47min，b液线性梯度从45％-100％；47min-52min，b液维持在100％；60min以后，b液重置为0％；其中，缓冲液a液为10mmkh2po4,25％(v/v)乙腈,ph3.0，b液为10mmkh2po4,500mmkcl,25％(v/v)乙腈ph3.0；(3.2)洗脱过程中监测214nm的吸光度值，每隔1min收集洗脱组分，分别冻干后采用c18cartridge脱盐；(3.3)色谱柱以95％的a液、5％的b液平衡，将脱盐后的肽段上样到上样柱，经过分析柱分离，流速为300nl/min；其中，缓冲液a液为0.1％(v/v)甲酸水溶液，b液为0.1％(v/v)甲酸+84％(v/v)乙腈的水溶液。其中，所述步骤(4)生物信息学分析依次包括以下步骤：差异表达蛋白质聚类分析、差异表达蛋白质geneontology功能富集分析、差异表达蛋白质kegg通路富集分析、蛋白质相互作用网路分析和平行反应监测prm技术验证。其中，所述步骤(4)中对出现差异表达的蛋白中筛选免疫相关蛋白进行平行反应监测prm技术验证。本发明提供的方法用于制备嗜水气单胞菌感染日本沼虾的生物标志物或诊断试剂盒。本发明的有益效果是：本发明通过分析嗜水气单胞菌感染日本沼虾血细胞差异表达蛋白质组学，丰富了日本沼虾免疫机制研究中的蛋白数据。本发明基于itraq对受感染日本沼虾的快速蛋白质组学研究，为进一步研究免疫相关蛋白的作用提供参考，尤其是过氧化氢酶、热休克蛋白60、innexininx2-like、肌球蛋白重链、整合素β在日本沼虾血细胞中发挥抗细菌感染的免疫功能。附图说明图1为感染嗜水气单胞菌的日本沼虾累积死亡率曲线；图2为12hpivs0hpi组火山图；横坐标为差异倍数，纵坐标为差异显著性p-value，图中灰点为显著性差异表达的蛋白(倍数变化大于1.2倍且pvalue＜0.05)，黑点为无差异变化的蛋白。图3为12hpivs0hpi组差异表达蛋白质聚类分析结果；横坐标为样品信息，纵坐标为显著性差异表达的蛋白；图4为12hpivs0hpi组go功能富集分析；图5为12hpivs0hpi组kegg通路富集分析；图6为24hpivs0hpi组go功能富集分析；图7为24hpivs0hpi组kegg通路富集分析；图8为36hpivs0hpi组go功能富集分析；图9为36hpivs0hpi组kegg通路富集分析；图10为12hpi-24hpi-36hpivs0hpi组go功能富集分析；图11为12hpi-24hpi-36hpivs0hpi组kegg通路富集分析；图12为36hpivs0hpi组差异表达蛋白质相互作用网络。具体实施方式为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。主要设备：蛋白质快速纯化系统aktapurifier10/100，通用电气医疗；纳升级液相系统easynlc，thermoscientific；上样柱thermoscientificacclaimpepmap100，100μm*2cm，nanoviperc18；分析柱thermoscientificeasycolumn，10cm，id75μm，3μm，c18-a2；质谱仪q-exactive，thermoscientific；下列实施例采用的材料如下：抗凝剂：0.45mol/lnacl、0.01mol/lkcl、0.01mol/ledta-na2、0.01mol/lhepes，ph7.45，渗透压780mosm/kg；sdt裂解液：4％(w/v)sds，100mmtris/hclph7.6，0.1mdtt；uabuffer：8m尿素，150mmtris-hcl，ph8.0；iaabuffer：100mmiaa的ua溶液；dissolutionbuffer(absciex，pn:4381664)；trypsinbuffer：4μgtrypsin，40μldissolutionbuffer；bca定量试剂盒(beyotime)；实施例11、细菌感染浓度的确定：日本沼虾来源于济宁微山湖，体长6-8cm，将健康的日本沼虾暂养于实验室一周。制备嗜水气单胞菌悬液，设置三个浓度梯度(1×104cfu/ml、1×105cfu/ml、1×106cfu/ml)用于日本沼虾肌肉注射，50μl/尾，阴性对照组注射同等量的0.85％(w/v)nacl溶液(ph＝7.0)，每组50尾虾，三个平行，绘制累积死亡率曲线，确定最适感染浓度。日本沼虾感染嗜水气单胞菌后，每天统计沼虾死亡情况，并绘制累积死亡率曲线(见图1)。在1×104cfu/ml感染组中，第1天累积死亡率达到10％±0.82，第2，第3天分别为16.67％±0.47，30％±1.63，到第4天达到30.67％±1.70，直至实验结束。在1×105cfu/ml感染组中，第1天累积死亡率为20.67％±1.25，第2-5天的累积死亡率分别为30.67％±0.94，49.33％±1.25，68.67％±1.89，95.33％±0.47，到第6天达到100％。在1×106cfu/ml感染组中，第1-3天累积死亡率分别为37.33％±1.25，60％±0.82，82％±0.82，到第4天沼虾全部死亡。为确保日本沼虾成功感染嗜水气单胞菌，以及实验过程中有足够的虾用以取样，选定1×105cfu/ml作为感染浓度。2、细胞样品制备：将嗜水气单胞菌注射感染日本沼虾，于感染后的0h、12h、24h、36h从围心腔抽取沼虾血淋巴，抗凝剂与血淋巴的体积比为1:1，冰盒中放置。4℃进行800×g离心10min，去上清，0.85％(w/v)nacl溶液(ph＝7.0)洗涤血细胞三次。3、细胞裂解：每个感染时间点的血细胞样品中加入适量sdt裂解液，超声(80w，工作10s，间歇15s，循环10次)，沸水浴15min。进行14000×g离心40min，取上清。采用bca法进行蛋白质定量。分装样品，-80℃保存。4、蛋白质提取和肽段酶解：每个样品取适量蛋白质采用filteraidedproteomepreparation(fasp)方法进行胰蛋白酶酶解，具体步骤为：各样品取30μl蛋白质溶液，分别加入dtt至终浓度为100mm，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μluabuffer混匀，转入10kd超滤离心管中，离心14000×g15min，弃滤液(重复该步骤一次)。加入100μliaabuffer，600rpm振荡1min，室温避光反应30min，离心14000×g15min。加入100μluabuffer离心14000×g15min，重复该步骤两次。加入100μl10倍稀释的dissolutionbuffer，离心14000×g15min，重复该步骤两次。加入40μltrypsinbuffer，600rpm振荡1min，37℃放置16-18h。换新收集管，离心14000×g15min；再加入40μl10倍稀释的dissolutionbuffer，离心14000×g15min，收集滤液。然后采用c18cartridge对酶解肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μldissolutionbuffer复溶，肽段定量(od280)。5、itraq标记：各样品分别取100μg肽段，按照absciex公司itraq标记试剂盒说明书进行标记。6、scx色谱柱分级：将每组标记后的肽段混合，采用aktapurifier100进行分级。缓冲液a液为10mmkh2po4,25％(v/v)乙腈,ph3.0，b液为10mmkh2po4,500mmkcl,25％乙腈ph3.0。色谱柱以a液平衡，样品由进样器上样到色谱柱进行分离，流速为1ml/min。液相梯度如下：0-25min，b液线性梯度从0％-10％；25min-32min，b液线性梯度从10％-20％；32min-42min，b液线性梯度从20％-45％；42min-47min，b液线性梯度从45％-100％；47min-52min，b液维持在100％；60min以后，b液重置为0％。洗脱过程中监测214nm的吸光度值，每隔1min收集洗脱组分，分别冻干后采用c18cartridge脱盐。7、质谱分析：每份分级样品采用纳升流速的hplc液相系统easynlc进行分离。缓冲液a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的a液、5％的b液平衡，样品由自动进样器上样到上样柱，经过分析柱分离，流速为300nl/min。样品经色谱分离后用q-exactive质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子，母离子扫描范围300-1800m/z，一级质谱分辨率为70,000at200m/z，agc(automaticgaincontrol)target为1e6，一级maximumit为50ms，动态排除时间(dynamicexclusion)为60.0s。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集10个碎片图谱(ms2scan)，ms2activationtype为hcd，isolationwindow为2m/z，二级质谱分辨率17,500at200m/z，normalizedcollisionenergy为30ev，underfill为0.1％。8、蛋白质鉴定和定量分析：质谱分析原始数据为raw文件，用软件mascot2.2和proteomediscoverer1.4进行查库鉴定及定量分析。在沼虾血细胞中共鉴定到蛋白质3372个，以倍数变化大于1.2倍以上(上调大于1.2倍或者下调小于0.83倍)且pvalue<0.05的标准筛选差异表达蛋白质，各比较组的差异表达蛋白质数目见表1，蛋白质定量结果统计以火山图(volcanoplot)形式进行展示，参见图2。表1蛋白质定量结果统计9、生物信息学分析：9.1差异表达蛋白质聚类分析：首先对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理(归一化到(-1,1)区间)。然后，使用complexheatmapr包(rversion3.4)同时对样品和蛋白质的表达量两个维度进行分类(距离算法：欧几里得，连接方式：averagelinkage)，并生成层次聚类热图。采用层次聚类算法对比较组的差异表达蛋白质分别进行聚类分析，并以热图(heatmap)形式进行数据展示，如图3表明，通过单因素方差分析(one-wayanova)pvalue<0.05的标准筛选得到的差异表达蛋白质可以有效的把比较组分开，进而说明差异表达蛋白质筛选的合理性。9.2差异表达蛋白质geneontology(go)功能富集分析：利用blast2go对目标蛋白质集合进行go注释，过程大致可以归纳为序列比对(blast)、go条目提取(mapping)、go注释(annotation)和补充注释(annotationaugmentation)等四个步骤。然后通过fisher精确检验方法对差异表达蛋白质进行go功能富集分析。9.3差异表达蛋白质kegg通路富集分析：利用kaas(keggautomaticannotationserver)软件，首先通过比对kegggenes数据库，将目标蛋白质序列进行ko归类，并根据ko归类自动获取目标蛋白质序列参与的通路信息。然后通过fisher精确检验方法对差异表达蛋白质进行kegg通路富集分析。在12hpivs0hpi感染组中，上调差异表达蛋白质有227个，下调差异表达蛋白质138个。经过go功能富集分析发现，多细胞组织过程、发展过程、修复过程、代谢过程等重要生物学过程，运动活性、钙离子结合活性、酶活性等分子功能，细胞骨架组分、分子复合物等定位蛋白质发生了显著性变化(见图4)。kegg通路富集分析表明，rig样受体信号通路、c-型凝集素受体信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控等重要通路发生了显著变化(见图5)。在24hpivs0hpi感染组的上调差异表达蛋白质有227个，下调差异表达蛋白质195个。经过go功能富集分析发现，多细胞组织过程、发展过程、代谢过程等重要生物学过程，运动活性、钙离子结合活性等分子功能，细胞骨架组分、分子复合物等定位蛋白质发生了显著性变化(见图6)。kegg通路富集分析表明，肌动蛋白细胞骨架的调控、紧密连接、mapk信号通路、cgmp-pkg信号通路等重要通路发生了显著变化(见图7)。36hpivs0hpi组的上调差异表达蛋白质有307个，下调差异表达蛋白质187个。经过go功能富集分析发现，细胞增殖调控等重要生物学过程，催化活性、氧化还原酶活性、运动活性等分子功能，细胞骨架组分、肌球蛋白复合物、纤维分子等定位蛋白质发生了显著性变化(见图8)。kegg通路富集分析表明，氨基酸代谢、糖酵解、脂肪酸降解、过氧化物酶体等重要通路发生了显著变化(见图9)。感染后的三个时间点(12hpi、24hpi、36hpi)均出现的差异表达蛋白质有117个，其中上调差异表达蛋白质有84个，下调差异表达蛋白质33个。经过go功能富集分析发现，多细胞组织过程的调控、活性氧代谢过程、超氧化物代谢过程等重要生物学过程，运动活性、氧化还原酶活性、水解酶活性等分子功能，肌动蛋白细胞骨架、肌球蛋白复合物、细胞器组分等细胞组分发生了显著性变化(见图10)。kegg通路富集分析表明，肌动蛋白细胞骨架的调控、焦点粘附、紧密连接、rap1信号通路等重要通路发生了显著变化(见图11)。9.5蛋白质相互作用网路分析：基于intact(http://www.ebi.ac.uk/intact/main.xhtml)或者string(http://string-db.org/)数据库中的信息查找目标蛋白质之间的直接和间接相互作用关系，并使用cytoscape软件(版本号：3.2.1)生成相互作用网络并对网络进行分析。将感染后的三个时间点(12hpi、24hpi、36hpi)与0hpi的差异表达蛋白质分别构建了蛋白质互作网络图。图12所示为36hpivs0hpi的蛋白质互作网络图，网络中，与某个蛋白质a直接相互作用的蛋白质数目称为该蛋白质a的连接度，通常来讲，蛋白质的连接度越大，该蛋白质发生变化时整个系统受到的扰动就越大，该蛋白质可能是维持系统平衡和稳定的关键，为后续蛋白质的重点研究提供参考依据。10、prm验证：从嗜水气单胞菌感染日本沼虾12hpi、24hpi、36hpi后均出现差异表达的蛋白中筛选免疫相关蛋白：过氧化氢酶、热休克蛋白60、innexininx2-like、肌球蛋白重链、整合素β，并应用平行反应监测(parallelreactionmonitoring，prm)技术进行定性和定量分析。经prm验证，所筛选的上述5个免疫相关蛋白存在于嗜水气单胞菌感染的日本沼虾血细胞中。应用lc-prm/ms进行定量分析，并且采用同位素重标肽段对定量信息进行归一化校正，结果表明，在不同条件下，5个目标蛋白于感染后的12h、24h、36h呈现显著上调表达。过氧化氢酶于感染后的三个时间点的上调表达倍数依次为：14.14±0.02、3.13±0.18、51.88±0.13；热休克蛋白60于感染后的12h、36h的上调表达倍数依次为：1.88±0.01、1.70±0.08；innexininx2-like于感染后的三个时间点的上调表达倍数依次为：2.89±0.004、1.69±0.005、3.90±0.05；肌球蛋白重链于感染后的三个时间点的上调表达倍数依次为：5.82±0.02、3.73±0.17、11.15±0.01；整合素β于感染后的三个时间点的上调表达倍数依次为：5.42±0.02、2.55±0.001、5.55±0.01。当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12