rhTSG-6双抗体夹心ELISA法定量检测试剂盒及其使用方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种rhtsg-6双抗体夹心elisa法定量检测试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术：

肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumornecrosisfactor-αstimulatedgene6，tsg-6)是一种炎症相关的分泌性蛋白，是由间充质干细胞或基质细胞(mscs)对炎症信号的反应产生的，在多种炎症性疾病或类炎症性病理过程中呈高表达。现已知，tsg-6介导了许多免疫调节和组织修复过程，具有抗炎和组织保护作用，是一个正调节的功能蛋白。

大量研究表明，tsg-6蛋白具有抑制炎症因子tnf-α、il-1β、il-6等的表达、抑制中性粒细胞浸润等功能，发挥较强的抗炎作用。随着相关研究的进展，tsg-6蛋白效力已逐渐被生物医药领域重视。但目前市场暂无相应直接用于rhtsg-6产品和临床标本检测的试剂盒。本发明首次发现，重组人tsg-6(recombinanthumantsg-6，rhtsg-6)在体内外均具有抗病毒活性。并以此发现研制了rhtsg-6双抗体夹心elisa法定量检测试剂盒，填补了此领域的空白。

技术实现要素：

本发明提供了一种rhtsg-6双抗体夹心elisa法定量检测试剂盒及其使用方法和应用，其具有简便快速、成本低、特异性及灵敏性高等特点。

本发明采取的技术方案为：

一种重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6双抗体夹心elisa法定量检测试剂盒的研制，包括包被有抗rhtsg-6多克隆抗体的酶标板、酶标记的rhtsg-6抗多克隆抗体、rhtsg-6蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、显色液a液、显色液b液、终止液。

进一步地，抗rhtsg-6多克隆抗体为rhtsg-6重组抗原免疫balb/c小鼠得到的抗血清经多次纯化后得到的精制抗体。

所述rhtsg-6重组抗原的基因序列如sequencelisting400〈2〉所示，其是通过对如sequencelisting400〈1〉所示的重组人tsg-6基因进行密码子优化获得的，优化前密码子适应指数(cai)为0.73，优化后cai为0.97，通过密码子优化可实现重组人tsg-6抗原蛋白的高效表达，表达量达到30％以上。

所述rhtsg-6重组抗原的氨基酸序列如sequencelisting400〈3〉所示。

所述酶标记抗rhtsg-6多克隆抗体为rhtsg-6重组抗原免疫balb/c小鼠得到的抗血清经亲和层析法纯化后采用辣根过氧化物酶(hrp)标记。

所述包被有抗rhtsg-6多克隆抗体的酶标板的制备方法为：将精制后的抗rhtsg-6多克隆抗体经0.05m碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标板中，4℃过夜后，用ph7.0内含体积分数为10％小牛血清的0.01mol/l磷酸盐缓冲液封闭封闭，洗涤拍干后装入包装袋抽真空保存。

所述rhtsg-6蛋白标准品为rhtsg-6重组抗原与冻干保护剂混合，经冷冻干燥制备得到。

所述样品稀释液为ph7.0内含体积分数为10％小牛血清的0.01mol/l磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为ph7.0内含有体积分数为0.05％tween-20的0.01mol/l的磷酸盐缓冲液。

所述显色液a液为加入过氧化氢溶液；所述显色液b液为加入四甲基联苯胺(tmb)溶液；所述终止液为2mol/l硫酸溶液。

本发明还提供了所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6双抗体夹心elisa法试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：

(1)将rhtsg-6蛋白标准品以样品稀释液稀释成系列浓度的rhtsg-6蛋白标准品溶液；

(2)向包被有抗rhtsg-6多克隆抗体的酶标板中分别加入rhtsg-6蛋白标准品溶液、待测样品样品液，按100μl/孔加入微孔酶标板内；于37℃温箱内静置30min；弃液，加入洗涤液200μl/孔，洗涤5次后拍干；

(3)加入1:30000稀释的酶标记抗rhtsg-6多克隆抗体100μl/孔，静置于37℃温箱内30min；弃液，加入洗涤液200μl/孔，洗涤5次后拍干；

(4)加入显色液b液50μl/孔，再加入显色液a液50μl/孔，轻敲板框混匀，室温避光反应10min；

(5)加入终止液50μl/孔终止反应，并立即在酶标仪上测450nm处的吸光度值；

(6)以rhtsg-6蛋白标准品溶液浓度的负对数为横坐标，吸光度值对数为纵坐标，绘制标准曲线，求出线性回归方程，将待检样品孔内吸光度值带入标准曲线，即可求得待检测样品中rhtsg-6的浓度。

本发明还提供了一种重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的定量检测方法，利用所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6双抗体夹心elisa法试剂盒按照上述使用方法进行检测。

本发明首次研制了适用于rhtsg-6定量检测的双抗体夹心elisa法试剂盒，即通过对基因库中的rhtsg-6基因进行密码子优化以提高密码子的适应指数，并采用基因工程原核表达技术可快速大批量高效生产rhtsg-6，纯度高成本低，较现有重组蛋白原核表达rhtsg-6的产量提高了100倍以上。经采用自行研制的rhtsg-6重组抗原免疫balb/c小鼠的抗血清经亲和层析法纯化后得到精纯的rhtsg-6多克隆抗体；将该精纯的一定量的多克隆抗体固定于酶标板，作为捕获特异性抗原的“一抗”；再以一定量的辣根过氧化物酶标记抗rhtsg-6多克隆抗体作为捕获特异性抗原的“二抗”；当加入待检标本时，即可在此酶标板中发生高度特异性的抗原-抗体反应，以定量检测标本中相应rhtsg-6的有无及含量。酶标记结合物添加50％甘油进行保存，4℃可保存两年。

与现有技术相比，本发明的定量检测rhtsg-6的双抗体夹心elisa法试剂盒使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高准确性等特点，可快速定量检测样品中的tsg-6。

本发明通过抗原-抗体特异性反应，以酶免疫技术为基础，研制并建立了一种rhtsg-6双抗体夹心elisa法，可直接定量检测发酵液、半成品、成品等及组织细胞样本中rhtsg-6的可商品化试剂盒，可对相应产品研制及对临床样品样本进行特异性检测。本发明方法最低检测限可达1.2ng/ml，批内差异＜5％，批间差异＜10％。使用本发明方法对样品中rhtsg-6定量检测的回收率为在90％～110％之间。显示该方法对于检测临床标本及生产企业进行产品质量控制具有重要的商业开发价值。以填补本领域的空白。

附图说明

图1为优化后的重组人tsg-6基因pcr鉴定的结果，其中泳道m：dnamarkerdl2000；泳道1：阴性对照；泳道2-5：优化后的重组人tsg-6基因pcr鉴定结果；

图2为重组质粒pet32a-rhtsg-6双酶切鉴定结果；其中m为dnamarkerdl2000；泳道1为重组质粒pet32a-rhtsg-6经bamhi和hindⅲ双酶切结果，泳道2、3分别为重组质粒pet32a-rhtsg-6经bamhi和hindⅲ单酶切结果，泳道4为重组质粒pet32a-rhtsg-6阴性对照；

图3为30℃时使用1.0mmiptg诱导表达的重组人tsg-6蛋白sds-page电泳检测结果；其中m为蛋白marker，泳道1为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道2为重组人tsg-6工程菌诱导5h后菌体表达的全蛋白；泳道3为重组人tsg-6工程菌诱导5h后菌体破碎后的沉淀，泳道4为重组人tsg-6工程菌诱导5h后菌体破碎后的上清。

图4为重组人tsg-6蛋白表达方式检测结果，其中m为蛋白marker，泳道1为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道2为重组人tsg-6工程菌诱导5h后菌体破碎后的上清，泳道3为重组人tsg-6工程菌诱导5h后菌体破碎后的沉淀；

图5为westernblot鉴定重组人tsg-6蛋白结果；其中m为蛋白marker，泳道1为空载体菌体破碎后总蛋白，泳道2为重组人tsg-6蛋白样品；

图6为重组人tsg-6蛋白纯化后sds-page电泳检测结果；其中m为蛋白marker，泳道2为纯化前的重组人tsg-6蛋白溶液，泳道3为纯化后的重组人tsg-6蛋白标准品；

图7为利用rhtsg-6双抗体夹心elisa法试剂盒定量检测rhtsg-6的步骤；

图8为双抗体夹心elisa法标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白双抗体夹心elisa法试剂盒的研制，包括包被有抗rhtsg-6多克隆抗体的酶标板、酶标rhtsg-6多克隆抗体、rhtsg-6蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、显色液a液、显色液b液、终止液。

其中，rhtsg-6重组抗原的制备方法包括以下步骤：

(1)对根据genebank中已报道的如sequencelisting400〈1〉所示的重组人tsg-6基因进行密码子优化，使用化学合成的方法获得如sequencelisting400〈2〉所示重组人tsg-6基因，优化前密码子适应指数(cai)为0.73，优化后cai为0.97。如sequencelisting400〈2〉所示的重组人tsg-6基因编码的重组人tsg-6蛋白的氨基酸序列如sequencelisting400〈3〉所示。

(2)将步骤(1)所得的重组人tsg-6基因亚克隆至pet-32a表达载体中并转化至bl21大肠杆菌中，涂布含氨苄青霉素的lb平板培养过夜，挑取lb平板上单菌落进行pcr及bamhⅰ和hindⅲ双酶切鉴定，阳性即表示该表达载体构建成功，得到重组人tsg-6重组菌；pcr扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳1号泳道在800bp附近出现单一条带，如图1、2所示；

pcr鉴定引物为：

f1：ggatcctggggttttaaagatggc(bamhⅰ)；

r1：aagcttttacagatgactaaagcgac(hindⅲ)。

(3)挑取重组人tsg-6重组菌于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中震荡培养，后在含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中放大培养2～3h后，测od值在0.6-0.8时，加入终浓度1.0mmiptg，30℃诱导表达5h，收集菌体；经sds-page电泳分析，如图3所示，经iptg诱导表达5h后的菌体蛋白在45kd处可见优势表达条带，表达量达到50％；经westernblot鉴定，如图5所示，经iptg诱导表达5h后的菌体蛋白能与兔抗人tsg-6多克隆抗体发生特异性反应，在45kd左右处出现特异性条带，且特异性高；

其中westernblot鉴定方法为：以abcam公司兔抗人tsg-6多克隆抗体为一抗(1：500稀释)，以中杉金桥公司hrp标记山羊抗兔igg为二抗(1：50000稀释)。

(4)将步骤(3)收集的菌体，使用200ml的pbs重悬菌体，4℃超声破碎细菌沉淀，超声的条件为：功率：400w，工作3s，间隔3s，超声6min，重复3～4次；12000r/min离心20min分离上清和沉淀，分离出的包涵体沉淀经过洗涤、变性和复性，复性产物即为重组人tsg-6蛋白粗品。分别取沉淀和上清及菌体经sds-page电泳检测，如图4所示。经sds-page电泳分析，该重组蛋白为包涵体表达。

所述洗涤、变性和复性的方法为：

①洗涤：使用洗涤缓冲液(50mmol/ltris，100mmol/lnacl，2mol/l尿素，1mmol/ledta，0.5％tritonx-100，ph8.0)以1∶20的湿重体积比对包涵体(10g)进行重悬，洗涤2h，12000r/min离心20min取沉淀，再重复洗涤一次；

②变性：称量洗涤后沉淀湿重(4.8g)，再用溶解缓冲液(50mmol/ltris，100mmol/lnacl，7mol/l盐酸胍，0.1％β-巯基乙醇，ph8.45)以1∶50的湿重体积比重悬沉淀(240ml)，置于磁力搅拌器上过夜，充分溶解；

③稀释复性：配制复性缓冲液(50mmol/ltris，100mmol/lnacl，1mmol/lgsh，0.2mmol/lgssg，ph8.0)进行复性。取溶解后的蛋白溶液，12000r/min离心20min取上清，加入等体积的复性缓冲液(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h；再加入复性缓冲液稀释至原体积的4倍(加500ml复性缓冲液)，4℃静置3h；最后加入复性缓冲液稀释至原体积的5倍(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h。

(5)重组人tsg-6蛋白粗制品过滤处理后过his-tag亲和层析柱，用elutionbuffer(50mmtris-cl、500mm咪唑ph8.0)梯度洗脱，收集显示出重组人tsg-6蛋白紫外吸收峰的蛋白，置于10倍体积的tris-hcl缓冲液中4℃透析6h以上，透析两次去除高浓度咪唑，调节酸碱度至ph5.0，使用1mnacl洗脱液过阴离子交换层析柱收集流穿液即为rhtsg-6完全抗原，经sds-page检测，结果如图6所示，从图中可以看出得到的蛋白纯度＞90％。

所述rhtsg-6蛋白标准品的制备方法为：

将上述步骤(5)得到的rhtsg-6完全抗原与冻干保护剂按照1∶1等体积混合后，经冷冻干燥，即可得到所述重组人tsg-6蛋白标准品，其规格为40μg/支(即每支重组人tsg-6蛋白标准品中含有rhtsg-6完全抗原的量为40μg)；所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖的pbs混合液，三者在10mmol/lpbs缓冲液中的终浓度为甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。

所述抗rhtsg-6多克隆抗体的制备方法为：使用0.01mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)将rhtsg-6重组抗原的蛋白浓度稀释至2.0mg/ml，免疫balb/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐剂免疫1次，继之采用弗氏不完全佐剂免疫2次，及后续无佐剂免疫2次。收获得相应特异性抗血清免疫双扩散法检测效价应不低于1:16。抗血清依次使用饱和硫酸铵法粗纯，再使用亲和层析法精纯获得精制rhtsg-6多克隆抗体，过滤除菌后添加体积50％无菌甘油，-20℃备用。

所述酶标记rhtsg-6多克隆抗体的制备采用高碘酸钠改良法，具体步骤如下：

(a)使用去离子水将辣根过氧化物酶配制成10mg/ml水溶液，将高碘酸钠配制成12.8mg/ml水溶液，配置后立即使用；

(b)将配好的辣根过氧化物酶水溶液和高碘酸钠等体积混合于合适容器中4℃避光反应30min。

(c)用0.05m碳酸盐缓冲液配制0.16mol/l乙二醇溶液，等体积加入至上述反应容器中并混匀，于4℃避光反应30min。

(d)将浓度大于4mg/mlrhtsg-6多克隆抗体溶液与c步骤获得溶液以质量比1:1加入上述容器中，立即混匀，并用0.05m碳酸盐缓冲液调节ph9.0，于4℃避光反应2h。

(e)用去离子水新鲜配制浓度为1mg/ml硼氢化钠溶液，加入至反应容器中，混匀，加入量为每1mg辣根过氧化物酶则添加40μg硼氢化钠，于4℃避光反应2h。

(f)于20mm磷酸盐缓冲液中透析24h。

(g)将初步透析后的溶液经sephacryls-100凝胶色谱柱(ge)，用cbs洗脱，流速为0.6ml/min。

(8)向纯化后溶液中添加1％bsa，过滤后再加入50％无菌甘油，分装后于-20℃保存。

所述rhtsg-6多克隆抗体的酶标板包被的制备方法为：将已知定量的抗rhtsg-6多克隆抗体经0.05mol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6)稀释后，按照100μl/孔加入酶标板，置4℃过夜；用ph7.0内含体积分数为10％小牛血清的0.01mol/l磷酸盐缓冲液封闭60min后，弃液洗涤拍干，真空包装于4℃保存，备用。

所述样品稀释液为ph7.0内含体积分数为10％小牛血清的0.01mol/l磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液为ph7.0内含有体积分数为0.05％tween-20的0.01mol/l的磷酸盐缓冲液；

所述显色液a液为加入过氧化氢溶液；

所述显色液b液为加入四甲基联苯胺(tmb)溶液；

所述终止液为2mol/l硫酸溶液。

实施例2

使用实施例1中的试剂盒定量检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的方法，包括以下步骤：

(1)将40μg/支的rhtsg-6蛋白标准品以样品稀释液稀释成400、200、100、50、25、12.5和6.25ng/ml系列浓度的rhtsg-6蛋白标准品溶液，设置空白对照(零标准)，均重复2孔；

(2)向包被有抗rhtsg-6多克隆抗体的酶标板中分别加入rhtsg-6蛋白标准品溶液、待测样品样品液，按100μl/孔加入微孔酶标板内；于37℃温箱内静置30min；弃液，加入洗涤液200μl/孔，洗涤5次后拍干；

(3)加入1:30000稀释的酶标rhtsg-6多克隆抗体100μl/孔，于37℃温箱内静置30min；弃液，加入洗涤液200μl/孔，洗涤5次后拍干；

(4)加入显色液b液50μl/孔，再加入显色液a液50μl/孔，轻敲板框混匀，室温避光反应10min；

(5)加入终止液50μl/孔终止反应，并立即在酶标仪上测450nm处的吸光度值；

(6)每个标准品和样品的平均重复读数，并减去零标准平均吸光度值(b0)，获得各浓度标准品和样品吸光度值b。

(7)将rhtsg-6蛋白标准品溶液浓度的负对数为横坐标，吸光度值b的对数为纵坐标，绘制标准曲线，求出线性回归方程，图8所示。将待检样品孔内吸光度值b带入标准曲线，即可求得待检测样品中rhtsg-6的浓度。

最低检测量：选择10个不同浓度的rhtsg-6标准品，且每个做3个水平重复，以rhtsg-6浓度负对数作为横坐标，以各个浓度下吸光度值b的对数为纵坐标绘制标准曲线，建立曲线方程的同时，计算无rhtsg-6时b0的平均数和标准差(sd)。以b0-3sd的值在回归曲线上所对应的rhtsg-6浓度为试剂盒的最小检测量。计算出最低检测限为1.2ng/ml。

精密度：应用同一批次生产的定量检测rhtsg-6试剂盒，连续7天，每天检测一个标准品，并做3个水平重复，测出吸光值，检测批内变异系数；使用7个批次的rhtsg-6试剂盒在同一时间检测3个水平的rhtsg-6标准品，并做三个水平重复，测定吸光度值，计算批间变异系数。最终平均批内变异系数为2.05％，平均批间变异系数为8.71％。

特异性：以交叉反应率为指标判定试剂盒的特异性，将rhtsg-6与小鼠、大鼠以及兔源tsg-6配成不同浓度，用试剂盒分别测定ic50值，每个药物重复三次，计算交叉反应率，交叉反应率(％)＝ic50(rhtsg-6)/ic50(其他物质)×100％。

交叉反应率见表1：

表1本发明采用多克隆抗体的试剂盒特异性

回收率：将配制好的rhtsg-6母液(1mg/ml)稀释成100ng/ml，分别添加至5ml的样本稀释液中，使其终浓度分别为3ng/ml、6ng/ml和12ng/ml，随机选5个批次，每个批次三个浓度，每个浓度重复3次，按照试剂盒的测定程序，测定样本稀释液中rhtsg-6浓度，并计算回收率和变异系数：

回收率(％)＝实测浓度/添加浓度×100％

回收率为90～110％，批间变异系数均小于15％，表明本发明试剂盒测定结果准确可靠，结果稳定。

保存期：试剂盒保存条件为2～8℃，经过3月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、50％抑制物浓度、rhtsg-6添加实际样品测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置1天，进行加速稳定性实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冷冻7天，测定结果也表明该试剂盒各项指标参数完全正常。以上结果显示，本试剂盒可在2-8℃保存6～12个月以上。

上述参照实施例对rhtsg-6双抗体夹心elisa法定量检测试剂盒及其使用方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，均应属本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>芜湖天明生物技术有限公司

<120>rhtsg-6双抗体夹心elisa法定量检测试剂盒及其使用方法和应用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>780

<212>dna

<213>优化前的tsg-6基因

<400>1

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taccacagagaagcacggtctggcaaatacaagctcacctacgcagaagctaaggcggtg120

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gtctttacagatccaaagcaaatttttaaatctccaggcttcccaaatgagtacgaagat420

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<213>优化后的tsg-6基因

<400>2

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aataccagtaccaccagtaccggtaataagaattttctggccggtcgctttagtcatctg780

taa783

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<212>prt

<213>重组人tsg-6的氨基酸序列

<400>3

trpglyphelysaspglyilephehisasnseriletrpleugluarg

151015

alaalaglyvaltyrhisargglualaargserglylystyrlysleu

202530

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100105110

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180185190

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