定量检测口蹄疫灭活抗原中非结构蛋白残留的试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及定量检测口蹄疫灭活抗原中非结构蛋白残留的试剂盒及应用。

背景技术：

口蹄疫(fmd)是由口蹄疫病毒(fmdv)引起的，以感染猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病。fmdv是单股正链rna病毒，属于小rna病毒科口蹄疫病毒属，基因组大小为8400bp，编码4种结构蛋白(sps：vp4，vp2，vp3和vp1)和8种非结构蛋白(nsps：l，2a，2b，2c，3a，3b，3c，3d)，以及存在一些未裂解的前体，如3abc。我国口蹄疫防控主要采取疫苗免疫、扑杀感染和可疑动物以及血清监测的综合性防控措施来控制口蹄疫的流行。理论上来说只有感染fmdv的动物，体内才存在nsps抗体，而免疫动物体内不存在nsps抗体。所以区分口蹄疫感染与免疫主要依赖于检测nsps抗体。但由于抗原纯化工艺的问题，灭活疫苗抗原中仍会残留少量的nsps。因此在疫苗免疫地区进行nsps检测时，nsps抗体不仅能在口蹄疫感染动物中检测到，而且也能在一些多次疫苗免疫的动物体内检测到。但国内目前还没有一种能够定量检测口蹄疫灭活抗原中nsps的方法，因此急需一种定量检测方法来评价口蹄疫灭活抗原中nsps的残留。

为了控制口蹄疫的传播，世界动物卫生组织(oie)规定在口蹄疫发生国家或疫苗免疫国家要想恢复口蹄疫无疫状态，必须通过检测动物体内无口蹄疫nsps抗体来证明该国无口蹄疫循环。因此oie对口蹄疫灭活疫苗的纯净度制定了准则，该准则需要口蹄疫生产厂家证明疫苗中缺乏nsps的免疫原性，并推荐评价疫苗纯净度的方法。该评价方法具体是：至少用8头牛免疫两次，首免后21-30天后进行第二次免疫，第二次免疫后的30-60天检测牛体内非结构蛋白抗体。其中有一头检测为nsps抗体阳性是可以接受的；若超过两头检测为nsps抗体阳性，则这批疫苗是不合格；若两头检测为nsps抗体阳性，厂家有权要求进行复检。然而，动物实验即费钱又费时，如果有一批疫苗不能满足纯度要求，厂家必须将整批苗弃掉。目前国内口蹄疫灭活疫苗的保存期多为1年，仅这一项nsps残留评价就需2-3月，这给生产厂家带来很大负担。因此目前亟待一种定量检测口蹄疫抗原中nsps的试剂盒，为口蹄疫生产厂家在抗原纯化以及制定标准化流程提供技术指导。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种定量检测口蹄疫灭活抗原中nsps残留的化学发光试剂盒，目的二在于提供所述试剂盒在口蹄疫灭活抗原中nsps残留定量检测方面的应用。所述试剂盒灵敏度高，能够对口蹄疫灭活抗原中非结构蛋白进行快速定量。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

定量检测口蹄疫灭活抗原中非结构蛋白残留的试剂盒，包括包被有3abc多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、血清稀释液、20×pbst洗涤液、化学发光液；

所述酶标单抗为标记hrp的识别3b蛋白的单克隆抗体；

所述抗原标准品中含有10ng/ml的3abc、质量分数为0.2％的bsa和体积分数为0.05％prolin300；

所述血清稀释液为含有质量分数为1％酪蛋白、体积分数为0.05％tween-20、体积分数为0.1％proclin-300、质量分数为2％蔗糖的磷酸盐缓冲液；

所述20×pbst为含有体积分数为1％tween-20的0.2m磷酸盐缓冲液；

所述化学发光液包括a液和b液；所述a液含有0.1mm的鲁米诺和0.07m发光增强剂ipp，所述b液为3mm的h2o2溶液。

本发明还提供所述试剂盒在口蹄疫灭活抗原中nsps残留定量检测方面的应用。

进一步地，所述试剂盒的操作步骤为：

1、标准品的稀释：用pbst将10ng/ml的抗原标准品稀释为若干个稀释度，pbst作为空白对照，用以建立标准曲线；

2、样品稀释：将待检抗原样品原液用pbst1:4稀释获得稀释样品；

3、加样：将稀释后的抗原标准品、空白对照、待测抗原样品原液以及稀释样品分别加入到化学发光板中，然后将化学发光板置于37℃反应30min，弃掉反应液，洗涤液洗板；

4、加入检测抗体：用血清稀释液将酶标抗体做10,000倍稀释，然后向每孔中加入100μl，37℃反应30min，弃掉反应液，洗涤液洗板；

5、检测：将化学发光液的a液和b液1:1混匀，每孔加入100μl，室温反应5min后用化学发光检测仪检测化学发光值；

6、检测结果的判定：

首先计算抗原标准品若干个稀释度的平均值和空白对照的平均值，以稀释度作为x轴，所测得的化学发光值为y轴，建立标准曲线和线性回归方程；

通过步骤5得出待检抗原样品原液和稀释样品的clia值，待检抗原样品原液中nsps含量的计算方法有以下三种情况：

a、若待检抗原样品原液和稀释样品的clia值均<10,000，那么待检抗原样品原液中nsps残留低于本试剂盒的检测限；

b、若待检抗原样品原液和稀释样品的clia值均>10,000，那么将稀释样品的clia值乘以4后代入回归方程计算出待检抗原样品原液中nsps的含量；

c、若待检抗原样品原液的clia值>10,000，而稀释样品的clia值<10,000，那么将待检抗原样品原液的clia值代入回归方程计算出待检抗原样品原液中nsps的含量。

有益效果：

1、本发明利用3abc多抗作为捕获抗体，识别3b的单抗作为检测抗体，能够对口蹄疫抗原中nsps残留进行定量检测，从而为疫苗生产厂家提供技术指导和疫苗中nsps的证明。

2、本发明所述试剂盒灵敏度高，检测限为0.02ng/ml，线性范围为0.1-10ng/ml，通过本发明所述的结果判定的方法，使计算结果更精确。

3、由于本发明是用3abc多抗作为捕获抗体，识别3b的单克隆抗体9e2-hrp作为检测抗体，因此检测抗原中nsps的量是3b、3ab以及3abc之和。

附图说明

图1是3abc蛋白纯化的sds-page图；

图2是单抗9e2识别3b的wb图；

图3是以3abc浓度为10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0ng/ml作为x轴，所测得的化学发光值为y轴，建立的标准曲线图。

具体实施方式

定量检测口蹄疫灭活抗原中nsps残留的化学发光试剂盒，包括包被有3abc多抗的化学发光板、酶标单抗(9e2-hrp)、抗原标准品、血清稀释液、20×pbst洗涤液、化学发光液(a液和b液)。

所述的包被有3abc多抗的化学发光板为白色可拆卸的聚苯乙烯96孔板，每孔包被3abc多抗。具体是用磷酸盐缓冲液(cbs，ph9.6)将3abc多抗稀释为0.5μg/ml，100μl/孔，4℃过夜包被；pbst洗三次后，向每孔中加入200μl封闭液进行封闭，37℃封闭2h。甩掉拍干后，于37℃干燥2h，装袋真空封闭，4℃保存。

所述的封闭液为含有体积分数为0.05％tween-20、质量分数为5％蔗糖、质量分数为1％鱼明胶、体积分数为0.1％proclin-300的磷酸盐缓冲液。

所述酶标单抗为9e2-hrp，该单抗识别3b蛋白。

所述的抗原标准品为含有10ng/ml的3abc，质量分数为0.2％的bsa和体积分数为0.05％prolin300。

所述血清稀释液为含有质量分数为1％酪蛋白、体积分数为0.05％tween-20、体积分数为0.1％proclin-300、质量分数为2％蔗糖的磷酸盐缓冲液；所述20×pbst为含有体积分数为1％tween-20的0.2m磷酸盐缓冲液(ph7.2-7.4)，经0.22μm滤膜除菌；所述化学发光a液含有0.1mm的鲁米诺和0.07m发光增强剂ipp，化学发光b液为3mm的h2o2溶液。

本发明方法的操作步骤为：

1、室温平衡：从4℃取出试剂盒，恢复到室温备用。

2、洗涤液准备：将20×pbst用去离子水或蒸馏水做20倍稀释即可。

3、标准品的稀释：在u型稀释板中，用pbst将10ng/ml的抗原标准品稀释为10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1ng/ml七个稀释度，pbst作为空白对照，即0ng/ml。

4、样品稀释：用pbst按照1:4的比例对待检抗原样品进行稀释(75μlpbst+25μl原液)，得稀释样品；

5、加样：将稀释后的抗原标准品、空白对照、待检抗原样品以及1:4稀释的稀释样品分别加入到化学发光板中，然后将化学发光板置于37℃反应30min。

6、洗板：弃掉反应液，每孔加入300μl的稀释后的洗涤液，洗涤5次，中间一次震荡洗涤30-60s，最后一次拍干。

7、加入检测抗体：用血清稀释液将9e2-hrp做10,000倍稀释，然后向每孔中加入100μl，37℃反应30min。

8、洗板：同步骤6。

9、检测：将化学发光a液和b液1:1混匀，每孔加入100μl，室温反应5min后用化学发光检测仪检测化学发光值。

检测结果的判定：

首先计算抗原标准品七个稀释度的平均值和空白对照的平均值，以10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0ng/ml作为x轴，所测得的化学发光值为y轴，建立标准曲线和线性回归方程。

1、若原液和1:4稀释后的clia值均<10,000，那么待检抗原样品中nsps残留低于本试剂盒的检测限；

2、若原液和1:4稀释后的clia值均>10,000，那么将1:4稀释后的clia值乘以4后代入回归方程计算出待检抗原样品中nsps的含量；

3、若原液的clia值>10,000，而1:4稀释后的clia值<10,000，那么将原液的clia值代入回归方程计算出待检抗原样品中nsps的含量。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例13abc单抗和多抗的制备

将原核表达的口蹄疫nsp3abc进行纯化(图1)，并对其进行梯度透析复性，然后将复性后的3abc免疫小鼠制备单抗，通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次亚克隆，筛选出反应性强的单克隆细胞，然后将筛选的细胞注入小鼠腹腔制备腹水。具体操作过程：将0.5ml弗氏不完全佐剂注入雌性balb/c小鼠腹腔中，3天后将约7.0×105的杂交瘤细胞注入腹腔。9-10天后，收集腹水并进行纯化。通过westernblot验证表明该单抗识别3b蛋白，wb结果也表明该单抗识别的是线性表位(图2)。

将复性后的3abc蛋白免疫兔子制备多抗。

实施例2检测口蹄疫非结构蛋白clia法的优化及标准曲线的建立

将3abc多抗稀释为0.5μg/ml作为捕获抗体，将3b单抗-hrp1:10,000，1:30,000，1:100,000倍稀释作为检测抗体，将原核表达的口蹄疫nsp3abc用pbst稀释为500，250，100，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0ng/ml作为标准抗原。综合考虑经济因素以及检测范围，最终确定捕获抗体的最佳包被浓度为0.5μg/ml，检测抗体最佳稀释度为1:10,000，最佳反应时间均为30min，并建立标准曲线。如图3所示，当3abc浓度为0.1-10ng/ml时，所测的化学发光强度与3abc浓度呈线性关系，线性方程为：y＝8252238x–67290。通过公式dl＝3.3sd/s计算最低检测限(其中sd为pbst对照的标准差，s为标准曲线的斜率)，检测限为0.02ng/ml。

实施例3待检口蹄疫灭活抗原样本最佳稀释倍数的确定

由于部分抗原中含有一些成分影响抗原抗体反应，因此将待检样本进行1:2，1:4，1:8梯度稀释后与原液的化学发光值(clia值)进行对比，从而确定最佳稀释度。通过对8种纯化不同次数的抗原(所用毒株不是一个)进行对比，可以发现有些抗原进行梯度稀释后，clia值成比例降低(如a，b，c，d)；而有些抗原进行梯度稀释后，clia值从1:4-1:8才开始成比例下降(如1，2)；而纯化两次的抗原中含有的nsps量已低于本方法的检测限，因此梯度稀释后，clia值变化不大(如i，ii)。通过本试验最终确定抗原最佳稀释度为1:4(表1)。

表1待检抗原样本最佳稀释倍数的确定

实施例4检测口蹄疫灭活抗原中nsps的实施

1、标准品：将10ng/ml的抗原标准品(含有10ng/ml的3abc，质量分数为0.2％的bsa，体积分数为0.05％prolin300)用pbst稀释为10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1ng/ml七个稀释度，pbst作为空白对照，即0ng/ml。

2、检测样品：细胞上清和营养液(1-6)、未纯化(7-11)、纯化一次(12-15)、纯化两次(16)的样本。

3、将稀释后的抗原标准品、空白对照、待测样本以及1:4稀释的待检样本加入到包被有3abc多抗的化学发光板中，然后将化学发光板置于37℃反应30min。用pbst洗涤5次后加入用血清稀释液10,000倍稀释的9e2-hrp，37℃反应30min。再用pbst洗涤5次，然后加入化学发光底物，5min后用化学发光分析检测仪器检测化学发光值。以抗原标准品七个稀释度10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0ng/ml作为x轴，所测得的化学发光值为y轴，建立标准曲线和线性回归方程。将待检样本进行1:4稀释后的化学发光值(clia值)与原液进行对比，若原液和1:4稀释后的clia值均<10,000，那么待检样品中nsps残留低于本方法的检测限；若原液和1:4稀释后的clia值均>10,000，那么将1:4稀释后的clia值乘以4后代入回归方程计算出抗原中nsps的含量；若原液的clia值>10,000，而1:4稀释后的clia值<10,000，那么将原液的clia值代入回归方程计算出抗原中nsps的含量(表2)。

表2抗原中nsps含量的检测

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。