用于诊断帕金森病的尿液蛋白标记物的制作方法

本发明涉及临床诊断的技术领域。具体地，本发明涉及用于诊断帕金森病的尿液蛋白标记物。具体而言，本发明涉及利用质谱分析蛋白组学技术获得的与人帕金森病相关的尿液蛋白标志物及其用途。

背景技术：

帕金森病是以渐进性运动和非运动障碍为特征的神经退行性疾病，参见deng,h.andl.yuan,geneticvariantsandanimalmodelsinsncaandparkinsondisease.ageingresearchreviews,2014.15:p.161-176。其主要病理特征是中脑黑质致密部中多巴胺能神经元进行性丢失，而在残存的多巴胺能神经元内出现α突触核蛋白(α-synuclein)为主要成分的嗜酸性包涵体，即路易小体。帕金森病严重影响患者及其家人的生活质量，造成巨大的社会经济负担，参见yang,y.x.,n.w.wood,andd.s.latchman,molecularbasisofparkinson'sdisease.neuroreport,2009.20(2):p.150-156；和delenclos,m.等人,biomarkersinparkinson'sdisease:advancesandstrategies.parkinsonism&relateddisorders,2016.22:p.s106-s110。

帕金森病的早期诊断对提高患者的生活质量、延缓疾病发展具有重大意义。目前没有治愈帕金森病的有效手段，只能通过药物治疗、手术治疗等方式延缓疾病的进展，又以药物治疗为主，但长期使用药物易出现疗效减弱和一些副作用。而帕金森病的临床诊断目前主要基于运动特征，当帕金森病的运动特征表现出来时，约60-70％的神经元已经丢失，参见mehta,s.h.andc.h.adler,advancesinbiomarkerresearchinparkinson’sdisease.currentneurologyandneurosciencereports,2015.16(1):p.7。由于帕金森病的早期症状轻微，并通常被认为是老化的结果，所以，目前帕金森病的早期诊断十分困难，且存在一定的误诊率，确诊时患者大多已出现较明显的行为障碍，累积病理变化。所以，为了给帕金森患者提供更好的临床治疗，帮助研究者发现新的治疗方法，迫切需要找到敏感的早期生物标志物。

生物标志物是能够客观反应正常生理、病理过程的一类指示物，参见strimbu,k.andj.a.tavel,whatarebiomarkers？curropinhivaids,2010.5(6):p.463-6。目前研究最多的生物标志物仍是存在于血液与脑脊液中。由于脑脊液和大脑之间没有屏障，因此脑脊液被认为是发现神经退行性疾病生物标志物的理想选择，但由于血脑屏障的存在，脑脊液较血液更加稳定，且更难以获得。而在病情发展过程中，由于内环境稳态调节，在达到失代偿的临界点之前，疾病引起的早期微小变化很可能被血液、脑脊液排除，而尿液没有稳态机制，所以，相对于比较稳定的脑脊液、血液，尿液能够容纳更多的变化，更有可能找到敏感的早期标志物，参见gao,y.,urine—anuntappedgoldmineforbiomarkerdiscovery？sciencechinalifesciences,2013.56(12):p.1145-1146；和adachi,j等人,thehumanurinaryproteomecontainsmorethan1500proteins,includingalargeproportionofmembraneproteins.genomebiology,2006.7(9):p.r80-r80。已有研究表明，尿液能够敏感反映神经退行性疾病发生发展的变化，例如，阿尔兹海默症转基因小鼠在未出现病理特征β淀粉样蛋白斑块时，尿液中就已有29种显著差异的蛋白被鉴定到，参见zhang,f.等人,earlycandidateurinebiomarkersfordetectingalzheimer'sdiseasebeforeamyloid-betaplaquedepositioninanapp(swe)/psen1de9transgenicmousemodel.jalzheimersdis,2018.66(2):p.613-637。帕金森病患者的尿液中有18种显著变化的代谢物与疾病阶段相关联，参见luan,h.等人,comprehensiveurinarymetabolomicprofilingandidentificationofpotentialnoninvasivemarkerforidiopathicparkinson'sdisease.scirep,2015.5:p.13888。

使用动物模型既可避免尿液受年龄，饮食、生理状况等多种因素的影响，参见wu,j.andy.gao,physiologicalconditionscanbereflectedinhumanurineproteomeandmetabolome.expertreviewofproteomics,2015.12(6):p.623-636，又可对早期病程进行监控。人α突触核蛋白a53t突变的过表达可概括帕金森病两种典型的神经病理异常，即黑质纹状体多巴胺能神经元的进行性丢失和α突触核蛋白包涵体形成，参见spillantini,m.g.等人,alpha-synucleininlewybodies.nature,1997.388(6645):p.839-40，广泛用于帕金森病的相关研究，参见chen,x.等人,longitudinalmetabolomicsprofilingofparkinson'sdisease-relatedalpha-synucleina53ttransgenicmice.plosone,2015.10(8):p.e0136612；zhang,s.,q.xiao,andw.le,olfactorydysfunctionandneurotransmitterdisturbanceinolfactorybulboftransgenicmiceexpressinghumana53tmutantalpha-synuclein.plosone,2015.10(3):p.e0119928；和rothman,s.m.等人,metabolicabnormalitiesandhypoleptinemiainalpha-synucleina53tmutantmice.neurobiolaging,2014.35(5):p.1153-61。

探索帕金森病的发生发展对尿液蛋白质组的影响，能够为帕金森病的早期诊断提供有意义的临床指标。

技术实现要素：

本发明人利用α突触核蛋白a53t转基因小鼠模型，分别收集小鼠2、4、6、8、10个月的尿液样本，基于数据非依赖性采集(dia)技术，通过液相色谱串联高分辨质谱(lc-ms/ms)进行定量分析。与2个月的尿液样本相比，共鉴定到17种人同源差异蛋白质，其中，9种蛋白质被报道与帕金森病相关，其中成蛋白-2、剪接因子3a亚基1、异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1在6、8、10月连续变化。通过以上实验与分析，尿液蛋白质组能够反映α突触核蛋白转基因小鼠发生发展的变化及早期生物标志物信息，并为帕金森病的临床早期诊断提供线索。

一方面，本发明提供了检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断所述受试者帕金森病的药物中的用途，其中所述尿液中蛋白质选自以下的一种或多种、或其组合：蛋白质topaz1、肌动蛋白、延伸因子1-α1、硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1、气味结合蛋白2a、剪接因子3a亚基1、pdzk1相互作用蛋白1、成蛋白-2、补体因子b、α-n-乙酰半乳糖苷酶、鸟苷酸环化酶激活剂2b、三肽基肽酶1、支链氨基酸氨基转移酶、锌转运体zip13、蛋白质leg1同源物和气味结合蛋白2a。

具体地，本发明提供了检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于早期诊断所述受试者帕金森病的药物中的用途，其中所述早期诊断定义为所述受试者没有明显的行为学异常，优选地所述尿液中蛋白质为蛋白质topaz1和肌动蛋白的组合。

进一步地，根据本发明提供的检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断所述受试者帕金森病的药物中的用途，其中所述尿液中蛋白质为异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1、剪接因子3a亚基1和成蛋白-2的组合；优选地，其中所述尿液中蛋白质进一步包含选自以下的一种或多种：蛋白质topaz1、肌动蛋白、延伸因子1-α1、硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、气味结合蛋白2a、pdzk1相互作用蛋白1、补体因子b、α-n-乙酰半乳糖苷酶、鸟苷酸环化酶激活剂2b、三肽基肽酶1、支链氨基酸氨基转移酶、锌转运体zip13、蛋白质leg1同源物和气味结合蛋白2a。

进一步地，根据本发明提供的用途，其中所述检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；优选地，其中所述检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂是单克隆抗体。

更进一步地，根据本发明提供的用途，其中所述受试者是哺乳动物，优选是人、小鼠、大鼠或伴侣动物。

进一步地，根据本发明提供的用途，其中与健康对照相比，肌动蛋白、延伸因子1-α1、硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、气味结合蛋白2a、pdzk1相互作用蛋白1、α-n-乙酰半乳糖苷酶、鸟苷酸环化酶激活剂2b、三肽基肽酶1、支链氨基酸氨基转移酶、锌转运体zip13、气味结合蛋白2a含量升高，和/或蛋白质topaz1、异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1、剪接因子3a亚基1、成蛋白-2、补体因子b、蛋白质leg1同源物含量降低，指示受试者患有帕金森病；优选地，所述健康对照是未患有帕金森病或其他疾病的健康受试者。

另一方面，本发明提供了一种用于早期诊断帕金森病的试剂盒或芯片，其包含检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂，其中所述尿液中蛋白质为以下蛋白质的组合：蛋白质topaz1、肌动蛋白、延伸因子1-α1、硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1、气味结合蛋白2a、剪接因子3a亚基1、pdzk1相互作用蛋白1、成蛋白-2、补体因子b、α-n-乙酰半乳糖苷酶、鸟苷酸环化酶激活剂2b、三肽基肽酶1、支链氨基酸氨基转移酶、锌转运体zip13、蛋白质leg1同源物和气味结合蛋白2a。

附图说明

图1显示th免疫组化结果；其中图2的a1至a3显示对照组1-3；b1至b4显示实验组1-4；图2的c表示th阳性细胞数目统计。

图2显示α-syn转基因小鼠不同时间点的差异蛋白数目。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。

实施例1α-syn(a53t)阳性转基因小鼠的转棒行为学检测

4周龄清洁级雄性α-syn(a53t)阳性转基因小鼠[c57bl/6j-tg(pdgf-α突触核蛋白a53t)ilas](n＝4)购自中国医学科学院医学实验动物研究所，动物许可证为scxk(京)2014-0011。动物实验遵循审查和批准(动物福利保证号：acuc-a02-2014-007)。所有动物饲养在12小时明暗循环的标准环境中(室温22±1℃，湿度65％-70％)。

转棒行为学检测用于评价小鼠四肢运动协调能力。转棒仪(中国医学科学院药物研究所研制)转速分别逐次设为恒速25rpm、30rpm、35rpm，每次间隔30min、限时2min。小鼠首次从杆上掉下来的时间记录为潜伏期，以此表示其运动协调能力。

每次实验开始前，先将小鼠置于运动学实验室环境中30min以上，避免搬运和灯光等改变对小鼠造成的短期影响，并以15rpm转速训练小鼠1min，以适应转棒仪。

数据采用平均值±sem表示，采用t检验分析组间差异，p<0.05为具有统计学差异。

转棒行为学检测结果显示，以2月龄α-syn转基因小鼠作为对照，在6个月时小鼠行为学出现显著差异，即表现出明显的运动障碍，与之前的研究(参见高宁,pdgf-h-α-synuclein转基因帕金森病小鼠模型的建立，2008,中国协和医科大学；以及文雯,化合物wyd1-8和wyd7-6改善α-synuclein转基因小鼠运动障碍的研究热休克蛋白70抑制星形胶质细胞介导炎症作用的研究，2016，北京协和医学院)在5个月左右开始出现运动障碍大致相符。而在9个月、10.5个月时未表现出行为学差异的原因推测可能为实验动物数较少。(表1)

表1：α-syn转基因小鼠在不同时间点的掉落潜伏期

实施例2对α-syn(a53t)阳性转基因小鼠的免疫组化染色

在末次行为学检测后，进行免疫组化染色。以同龄雄性c57bl/6小鼠作为对照(n＝3)。

麻醉小鼠后，先后用生理盐水和4％多聚甲醛对小鼠进行心脏灌注，将分离的脑固定在4％多聚甲醛24h后，将其转移到含30％蔗糖的4％多聚甲醛固中脱水，至脑组织沉入底部。取出脑组织，脱水包埋并切片，厚度为4μm。脱蜡至水后将切片置于edta缓冲液中微波修复，pbs缓冲液清洗后放入3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min，pbs缓冲液清洗后，加入5％bsa封闭20min，然后与th(1∶100)抗体4℃孵育过夜，加入二抗孵育50min。加入新鲜配制的dab溶液显色，加入纯化水终止显色反应。苏木素复染，1％盐酸酒精分化1s，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。切片经过梯度酒精(70-100％)1min一个梯度，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。取景扫描。记录小鼠中脑黑质区域th(酪氨酸羟化酶)免疫阳性细胞的数量。所有评估均由不熟悉实验设计的研究人员完成。

th是多巴胺合成的限速酶，α突触核蛋白包涵体通常与th共定位，故th阳性神经元的数量可反映多巴胺能神经元丢失的情况。免疫组化结果显示出实验组th阳性细胞数目减少的总体趋势，即多巴胺能神经元发生丢失。未显示出显著差异，这可能与个体差异及样本数较少有关。(图1)

实施例3尿液收集及样品制备

分别收集第2、4、6、8、10月的a53t小鼠尿液样本，以第2月收集的尿液样本作为对照组。将小鼠单独置于代谢笼中过夜(12h)，以收集尿液样本。尿液收集期间，不提供食物，可自由饮水，以避免尿液污染。

将收集到的尿液在4℃、3000×g条件下离心10min，以除去细胞及颗粒物沉淀，上清置于-80℃保存。在尿蛋白提取前，将尿液样本在4℃、12000×g条件下离心10min，以除去细胞碎片。使用四倍体积的预冷乙醇，于4℃沉淀上清液12h。将上述样品在4℃、12000×g条件下离心10min。将沉淀物重悬于裂解液(8mol/l尿素，2mol/l硫脲，25mmol/ldtt和50mmol/ltris)中。使用bradford法测定蛋白质浓度。

使用滤器辅助的蛋白质酶解方法(filter-aidedsamplepreparation，fasp)(参见j.r.等人,universalsamplepreparationmethodforproteomeanalysis.naturemethods,2009.6(5):p.359-362)对尿液蛋白质进行膜上辅助酶解。每个样本各取100ug蛋白质加到10kda滤膜(pall,portwashington,ny,usa)上。依次加入ua(8mol/l尿素，0.1mol/ltris-hcl，ph8.5)和50mmol/lnh4hco3溶液清洗蛋白质样品。加入20mmol/ldtt还原蛋白质(37℃、1h)，50mmol/liaa避光反应30min，使蛋白质二硫键烷基化。按照蛋白质量：酶质量＝1∶50加入胰蛋白酶((trypsingold,promega,fitchburg,wi,usa)，37℃孵育过夜。离心收集肽段，使用oasishlb固相萃取柱(waters,milford,ma)对肽段除盐。通过真空浓缩仪(thermofisherscientific,bremen,germany)进行干燥，并于-80℃保存。

使用高ph反相多肽分级法对混合肽段样本进行分级。使用高ph反相多肽分级试剂盒(84868,thermofisher,usa)将混合肽段样本装载到旋转小柱上。用乙腈浓度递增的梯度洗脱结合肽，共收集得到10个组分，包括1个流动组分、1个洗脱组分和8个梯度样本组分。分级后的样本使用真空浓缩仪进行干燥，并在20μl0.1％甲酸水中重新溶解。

实施例4lc-ms/ms分析

1)组分分级样本的dda数据库采集

使用easy-nlc1200超高效液相色谱搭载orbitrapfusionlumos高分辨质谱仪对分级肽段样品的数据采集。将溶于0.1％甲酸水中的肽段装载至预柱(75μm×2cm,3μm,c18,100a°)，将洗脱液装载至反相分析柱(50μm×250mm,2μm,c18,100a°)，洗脱梯度为5-30％流动相b(99.9％乙腈，0.1％甲酸，流速为0.3μl/min)，60min。为实现全自动、灵敏的信号处理，在所有样品中使用校准试剂盒(irtkit,biognosys,switzerland)，浓度为1:20v/v。

以dda-ms模式分析10个组分，参数设置如下：orbitrap的一级分辨率为60000、350-1550m/z进行全扫描，循环时间为3s(最高速度模式)，自动增益控制(agc)为1e6，最大注射时间为50ms。二级扫描在orbitrap中进行，分辨率为15000，筛选窗口为2da，碰撞能量为32％(hcd)。agc目标为5e4，最大进样时间为30ms。

2)实验样本的dia数据采集

以dia-ms模式分析20个实验样品。液相参数同dda数据库采集。质谱参数设置如下：以60000分辨率、350-1550m/z进行一级全扫描；接下来进行二级扫描，分辨率为30000，建立36个筛选窗口，hcd碰撞能量为32％，agc目标为1e6，最大注入时间为50ms。窗口计算方式：建库采集到的dda搜库结果，依据m/z将所有鉴定到的肽段数量进行排序，分成36组，每一组的m/z范围即为采集dia数据的窗口宽度。

3)数据分析

使用proteomediscoverer(2.3版,thermoscientific,germany)对组分样本进行数据处理，构建数据库。采用附加irt肽序列的swissprot小鼠数据库(2019年5月更新，包含17016个蛋白序列信息)进行搜库。搜索参数设置如下：母离子质量偏差为10ppm，碎片离子质量偏差为0.02da；固定修饰为半胱氨酸的脲基甲基化(+58.00da)，可变修饰为甲硫氨酸的氧化(+15.995da)，其他设置为默认参数。蛋白质和肽水平的错误发现率(fdr)设置为0.01。将上述搜库结果导入spectronautpulsar(biognosys,switzerland)，建立谱图库：665个蛋白质，29028张二级谱。

将dia-ms原始文件使用默认设置导入spectronautpulsar。基于所有二级碎片离子峰面积进行定量。以肽段水平q值<0.1，每个蛋白质至少鉴定到2条特异性肽段，鉴定高可信度蛋白质。差异蛋白质的筛选标准是：p值<0.01，蛋白质丰度变化倍数>2。

4)尿液蛋白质组变化

差异表达的蛋白质筛选标准：蛋白质丰度变化倍数在2倍以上，p值小于0.01。同时使用uniprot数据库寻找这些蛋白质所对应的人同源蛋白。

经dia定量分析，共鉴定513种高可信度蛋白。经筛选，与第2个月相比共鉴定到17种人同源的差异蛋白，其中第4个月共2种差异蛋白，1种上调，1种下调；第6个月共7种差异蛋白，4种上调，3种下调；第8个月共5种差异蛋白，1种上调，4种下调；第10月共10种差异蛋白，5种上调，5种下调。无连续变化蛋白。(参见图2、表2)。

表2：α-syn转基因小鼠的差异蛋白

5)差异蛋白分析

α-syn转基因小鼠在不同时间点均存在独特的差异蛋白，提示尿液蛋白质组具有反映a53t小鼠疾病进程的巨大潜力，具体分析如下。

第4个月，行为学、病理均未出现显著差异前，共有2种差异蛋白显著变化，其中，有1种被报道与帕金森病相关。肌动蛋白(actin,aorticsmoothmuscle)参与各种类型的细胞运动，α突触核蛋白与血影蛋白的相互作用会引发肌动蛋白细胞骨架的病理改变，这一点在关于α-syn转基因小鼠的研究中得到验证，参见ordonez,d.g.,m.k.lee,andm.b.feany,alpha-synucleininducesmitochondrialdysfunctionthroughspectrinandtheactincytoskeleton.neuron,2018.97(1):p.108-124.e6。

第6个月，刚出现运动障碍，共有7种差异蛋白显著变化，其中，有4种被报道与帕金森病直接或间接相关，有3种蛋白在6、8、10月连续变化，分别是成蛋白-2(formin-2)、剪接因子3a亚基1(splicingfactor3asubunit1)、异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1(isopentenyl-diphosphatedelta-isomerase1)。成蛋白-2(formin-2)在发育中的成年中枢神经系统中高度表达，参见leader,b.andp.leder,formin-2,anovelforminhomologyproteinofthecappuccinosubfamily,ishighlyexpressedinthedevelopingandadultcentralnervoussystem.mechdev,2000.93(1-2):p.221-31，作为肌动蛋白结合蛋白，参与肌动蛋白细胞骨架的组装和重组，参见pfender,s.等人,spire-typeactinnucleatorscooperatewithformin-2todriveasymmetricoocytedivision.currbiol,2011.21(11):p.955-60；azoury,j.等人,spindlepositioninginmouseoocytesreliesonadynamicmeshworkofactinfilaments.currbiol,2008.18(19):p.1514-9。另外，也有研究发现其在阿尔茨海默症患者脑组织中下调，参见agis-balboa,r.c.等人,formin2linksneuropsychiatricphenotypesatyoungagetoanincreasedriskfordementia.emboj,2017.36(19):p.2815-2828；异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1(isopentenyl-diphosphatedelta-isomerase1)是异戊烯二磷酸异构酶(idi)在人类中有两种同工型(idi1和idi2)之一，idi1和idi2可能与神经元中胆固醇代谢产物的产生有关，导致路易小体形成过程中α突触核蛋白聚集，参见nakamura,k.等人,isopentenyldiphosphateisomerase,acholesterolsynthesizingenzyme,islocalizedinlewybodies.neuropathology,2015.35(5):p.432-40；硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶(thioredoxin-dependentperoxidereductase,mitochondrial)参与抗氧化机制，在6-ohda诱导的帕金森动物模型纹状体组织中上调，参见lessner,g.等人,differentialproteomeofthestriatumfromhemiparkinsonianratsdisplaysvividstructuralremodelingprocesses.jproteomeres,2010.9(9):p.4671-87；延伸因子1-α1(elongationfactor1-alpha1)与人类lrrk2共免疫沉淀，而富含亮氨酸的重复激酶2(lrrk2)中的常染色体显性突变是帕金森病的最常见遗传原因，参见gillardon,f.,interactionofelongationfactor1-alphawithleucine-richrepeatkinase2impairskinaseactivityandmicrotubulebundlinginvitro.neuroscience,2009.163(2):p.533-9。

第8个月，共有5种差异蛋白显著变化，其中，有3种被报道与帕金森病直接或间接相关。除成蛋白-2(formin-2)、异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1(isopentenyl-diphosphatedelta-isomerase1)外，补体因子b(complementfactorb)同工型浓度在帕金森病患者脑脊液中低于正常受试者，脑脊液中的补体蛋白同工型可能是神经退行性疾病的生物标志物，参见finehout,e.j.,z.franck,andk.h.lee,complementproteinisoformsincsfaspossiblebiomarkersforneurodegenerativedisease.dismarkers,2005.21(2):p.93-101。

第10个月，共有10种差异蛋白显著变化，其中，有6种被报道与帕金森病直接或间接相关。除成蛋白-2(formin-2)、异戊烯二磷酸异构酶δ-异构酶1(isopentenyl-diphosphatedelta-isomerase1)、补体因子b(complementfactorb)外，锌转运体zip13(zinctransporterzip13)锌转运蛋白功能障碍与帕金森病中存在锌离子的动态平衡有关参见rolfs,a.andm.a.hediger,metaliontransportersinmammals:structure,functionandpathologicalimplications.jphysiol,1999.518(pt1):p.1-12，而锌转运蛋白的表达和功能的改变可能有助于神经退行性疾病的发病，参见leung,k.w.等人,expressionofzntandzipzinctransportersinthehumanrpeandtheirregulationbyneurotrophicfactors.investophthalmolvissci,2008.49(3):p.1221-31，细胞内zn2+含量的改变可能在与脑衰老相关的神经元功能障碍中起作用，参见mocchegiani,e.等人,brain,agingandneurodegeneration:roleofzincionavailability.progneurobiol,2005.75(6):p.367-90；三肽基肽酶1(tripeptidyl-peptidase1)在有5名tpp1突变患者出现帕金森病特征，参见digiacopo,r.等人,protractedlateinfantileceroidlipofuscinosisduetotpp1mutations:clinical,molecularandbiochemicalcharacterizationinthreesibs.jneurolsci,2015.356(1-2):p.65-71；simonati,a.等人,acln2genenonsensemutationisassociatedwithseverecaudateatrophyanddystoniainlincl.neuropediatrics,2000.31(4):p.199-201；le,n.m.ands.parikh,lateinfantileneuronalceroidlipofuscinosisanddopaminedeficiency.jchildneurol,2012.27(2):p.234-7；支链氨基酸氨基转移酶(branched-chain-amino-acidaminotransferase,cytosolic)在巨噬细胞功能中的调节作用，对炎性疾病具有治疗意义，参见papathanassiu,a.e.等人,bcat1controlsmetabolicreprogramminginactivatedhumanmacrophagesandisassociatedwithinflammatorydiseases.natcommun,2017.8:p.16040，而慢性、急性中枢神经系统炎症是导致帕金森病神经系统损伤的原因，参见mazzio,e.a.等人,naturalproducthtpscreeningforattenuationofcytokine-inducedneutrophilchemoattractants(cincs)andno2-inlps/ifngammaactivatedgliomacells.jneuroimmunol,2017.302:p.10-19，另外，帕金森病与氧化应激介导的线粒体功能障碍相关，而通过bcat1进行的bcaa分解代谢对于推动tca循环很重要，即bcat1与帕金森病存在一定关联，参见tonjes,m.等人,bcat1promotescellproliferationthroughaminoacidcatabolismingliomascarryingwild-typeidh1.natmed,2013.19(7):p.901-908。

将以上17个差异蛋白与衰老生物标志物(参见li,x.andy.gao,potentialurinaryagingmarkersof20-month-oldrats.peerj,2016.4:p.e2058)在丰度变化倍数大于2倍，p值小于0.01的条件下进行比较，未发现相同差异蛋白，提示α-syn转基因小鼠疾病进展的变化远大于衰老的变化，即本次筛选到的17个差异蛋白与α-syn转基因小鼠模拟的帕金森病更相关。

6)差异蛋白的生物功能分析

按照不同的变化倍数、p值，对每个时间点的样本分别进行随机分组，能够找到假阳性率最低的一组筛选条件，我们认为经此条件筛选得到的差异蛋白是更可信的。通常来说，筛选条件越严格，假阳性率越低，但严格的筛选条件也会造成得到的差异蛋白较少、筛掉假阴性蛋白。由于差异蛋白较少，使用在线免费软件david6.8(https://david.ncifcrf.gov/)无法对鉴定到的差异蛋白进行生物功能注释评估，因此，本实验以在“变化倍数大于1.5倍，p值小于0.05”条件下筛选得到的差异蛋白进行生物功能补充分析。(表3)

使用david对差异蛋白进行功能注释，展示每个时间点差异蛋白的生物过程、细胞组成和分子功能相关信息。使用ipa对差异蛋白进行通路分析。

经生物功能注释评估，能够发现，第8月开始出现炎症反应和维生素d代谢，而慢性、急性中枢神经系统炎症是导致帕金森病神经系统损伤的原因，参见mazzio,e.a.等人,naturalproducthtpscreeningforattenuationofcytokine-inducedneutrophilchemoattractants(cincs)andno2-inlps/ifngammaactivatedgliomacells.jneuroimmunol,2017.302:p.10-19，另外，维生素d参与钙、磷酸盐代谢，免疫反应和大脑发育的调节，据报道，维生素d是帕金森病和阿尔兹海默症的良好候选血清生物标志物，参见bivona,g.等人,non-skeletalactivitiesofvitamind:fromphysiologytobrainpathology.medicina(kaunas),2019.55(7)。对细胞组成分析，显示出差异蛋白为分泌蛋白，大多来自细胞外基质和膜。对分子功能，显示出蛋白大多具有酶活性。

通路分析，显示出不同时间点的通路具有各自的特点，且部分被报道与帕金森病有关。例如，在第4个月即出现炎症反应，如白细胞外渗信号(leukocyteextravasationsignaling)，而紧密连接信号(tightjunctionsignaling)、内吞作用被报道是与散发型帕金森病最可能相关的途径之二，参见hu,y.等人,apoolinggenome-wideassociationstudycombiningapathwayanalysisfortypicalsporadicparkinson'sdiseaseinthehanpopulationofchinesemainland.molneurobiol,2016.53(7):p.4302-18，上皮粘附连接的重塑(remodelingofepithelialadherensjunctions)、神经肌肉连接处的凝集素相互作用(agrininteractionsatneuromuscularjunction)是帕金森病受影响最大的通路之二，参见karim,s.等人,geneexpressionanalysisapproachtoestablishpossiblelinksbetweenparkinson'sdisease,cancerandcardiovasculardiseases.cnsneuroldisorddrugtargets,2014.13(8):p.1334-45。从第6月开始出现急性期反应信号(acutephaseresponsesignaling)和各类与氧化应激相关的信号，提示帕金森病与免疫疾病可能存在一定关系

表3：α-syn转基因小鼠的差异蛋白(p＜0.05)

本研究结果显示，尿液蛋白质组能够反映α-syn转基因小鼠疾病进程的变化。在未出现病理、行为学变化前，尿液中即可鉴定到显著变化的差异蛋白。在不同的时间点既存在连续变化的差异蛋白，也存在各自独特的差异蛋白，且超过半数差异蛋白被报道与帕金森病直接或间接相关，提示尿液具有早期诊断、提示帕金森病发生发展的巨大潜力，帕金森病的尿液蛋白质组研究具有巨大潜力。同时，使用标志物的不同组合能够为神经退行性疾病的早期诊断提供新思路、新线索，具有开展大规模临床研究的价值。