复方氨基酸注射液含量测定方法与流程

本发明属于氨基酸分析检测领域，涉及一种复方氨基酸注射液分析检测，具体地说涉及一种复方氨基酸注射液含量测定方法。

背景技术：

氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，复方氨基酸现已广泛地应用于医药行业。而氨基酸分析技术对复方氨基酸药品具有重要意义。其分析测定方法，按照检测方法可分为化学分析法、电化学分析法、分光光度法、氨基酸分离分析方法等。其中氨基酸分离分析方法按照衍生反应的先后，又分为柱前衍生和柱后衍生。

上述分析方法中，化学分析法、电化学分析法以及分光光度法的专属性差，不能实现多种氨基酸同时分离测定；

柱前衍生法，虽然可以使用自动进样器与色谱联用实现多种氨基酸的分离测定，但是衍生技术较为复杂，周期较长，衍生条件不易控制，重复性较差，难以推广；

柱后衍生法中比较准确的定量方法是离子交换色谱法，其中，较为普遍使用的有氨基酸分析仪和高效液相色谱；

高效液相色谱衍生技术较为复杂，周期较长，衍生条件不易控制，重复性较差，难以推广；

氨基酸分析仪虽然灵敏快速提供数据准确可靠、分辨率高操作简单分析周期短、体系稳定，但对于复方氨基酸注射液，需要重复进样测定氨基酸含量。

技术实现要素：

本发明的目的，是要提供一种复方氨基酸注射液含量测定方法，以解决现有技术所存在的需要重复进样测定氨基酸含量的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种复方氨基酸注射液含量测定方法，包括依次进行的以下步骤：

1)配液：

配制含有色氨酸的复方氨基酸标准液，得标准液；

稀释含有色氨酸的复方氨基酸注射液，得待测液；

2)分离测定：

分别取标准液或待测液进样于氨基酸分析仪进行分离测定，得到相应的标准液峰面积或相应的待测液峰面积；

3)计算：

按外标法代入标准液峰面积和待测液峰面积计算待测液中的氨基酸各组分的含量。

作为本发明的一种限定，步骤2)中，进样前在氨基酸分析仪内加入活化后的衍生液r；分离后的氨基酸各组分分别与衍生液r发生衍生化反应；

分别将标准液或待测液进样于氨基酸分析仪，随运行时间变化采用不同的流动相与衍生液r配合洗脱分离相应的标准液或相应的待测液中的氨基酸各组分，再分别经a通道或b通道测定相应的标准液或待测液中氨基酸各组分的峰面积；

其中，流动相是以三水合乙醇钠、乙醇、甲酸、乙酸、三氟乙酸、氢氧化钠、硼酸、edta二钠盐、辛酸、超纯水中的至少两种制成多种比例而得到；

氨基酸分析仪采用氨基酸阳离子分离柱；柱温随洗脱分离时间变化而变化。

作为本发明的进一步限定，氨基酸分析仪的进样量为20μl或40μl，流速为180-260μl/min；

a通道检测的波长为570nm，a通道检测脯氨酸之外的氨基酸各组分；

b通道检测的波长为440nm，b通道检测脯氨酸；

衍生化反应的温度为115℃。

作为本发明的更进一步限定，流动相按比例不同分为洗脱液c、洗脱液d、洗脱液e、洗脱液f、洗脱液g；

洗脱液c的ph值为2.56-2.87；洗脱液c的制备过程为：取体积份数0.1-0.2份数辛酸、体积份数40-60份乙醇、体积份数4-6份甲酸、体积份数8-12份乙酸、体积份数25-27份含50％三氟乙酸的水溶液和质量份数24.5-30份三水合乙酸钠，用超纯水溶解定容至体积份数1000份；其中，体积份数与质量份数的比例关系为ml：g；

洗脱液d的ph值为3.20-3.35；洗脱液d的制备过程为：取体积份数0.1-0.2份辛酸、体积份数4-6份甲酸、体积份数8-12份乙酸、体积份数18-20份含50％三氟乙酸的水溶液和质量份数24.5-30份三水合乙酸钠，用超纯水溶解定容至体积份数1000份；其中，体积份数与质量份数的比例关系为ml：g；

洗脱液e的ph值为3.90-4.05；洗脱液e的制备过程为：取体积份数0.1-0.2份辛酸、体积份数4-6份甲酸、体积份数8-12份乙酸和质量份数24.5-30份三水合乙酸钠，用超纯水溶解定容至体积份数1000份；其中，体积份数与质量份数的比例关系为ml：g；

洗脱液f的ph值为8.98-9.18；洗脱液f的制备过程为：取体积份数0.1-0.2份辛酸、体积份数2-4份甲酸、体积份数8-12份乙酸、体积份数10-14份含50％三氟乙酸的水溶液和质量份数61.2-75份三水合乙酸钠、质量份数14-18份氢氧化钠、质量份数5-7份硼酸、质量份数0.5-1份edta二钠盐，用超纯水溶解定容至体积份数1000份；其中，体积份数与质量份数的比例关系为ml：g；

洗脱液g制备过程为：取体积份数0.1-0.2份辛酸和质量份数6-10份氢氧化钠，用超纯水溶解定容至体积份数1000份；其中，体积份数与质量份数的比例关系为ml：g。

作为本发明的进一步限定，在洗脱分离过程中随运行时间变化对应不同的流动相。

作为本发明的进一步限定，衍生液r为茚三酮溶液。

作为本发明的更进一步限定，所述茚三酮溶液按照以下步骤制备：

71)取醋酸钾、冰醋酸溶于去离子水，醋酸钾与冰醋酸质量体积比为49g：41-44ml，制得醋酸钾缓冲液h；

72)取茚三酮溶于无水甲醇中，茚三酮与无水甲醇质量体积比为1g：25-35ml，加入苯酚，茚三酮与苯酚的质量比为10：1-2，溶解，制得溶液i；

73)溶液i中加醋酸钾缓冲液h，溶液i与醋酸钾缓冲液h的体积比为15-16：10，过滤，制得溶液j；

74)溶液j中加抗坏血酸，抗坏血酸与溶液j的质量体积比为1mg：2-3ml，混合，避光保存≥4h，制得衍生液r，即茚三酮溶液。

作为本发明的进一步限定，在洗脱分离过程中随运行时间变化对应不同的柱温。

作为本发明的进一步限定，步骤1)中，还包括配制空白溶液；

步骤2)中，还包括测定空白溶液峰面积。

作为本发明的更进一步限定，步骤3)中，标准液峰面积、待测液峰面积分别扣除空白溶液峰面积，得相对标准液峰面积和相对待测液峰面积，再以外标法计算氨基酸各组分的含量。

由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的进步在于：

本发明通过一次性进样分离测定含有色氨酸的复方氨基酸注射液中氨基酸各组分的含量，从而减少了氨基酸各组分含量测定过程中的操作步骤；经氨基酸分析仪的a通道测定除脯氨酸以外其他氨基酸各组分的色谱峰，包括测定色氨酸的色谱峰，b通道测定脯氨酸的色谱峰，各氨基酸峰分离度和峰形良好，计算结果准确。实现一次性检测含色氨酸在内的多种氨基酸的含量。本方法操作简便、快速、精密度高、准确度高、重复性好、成本低，能够实现一次性进样对含有色氨酸的复方氨基酸注射液的直接检测，大大减少了分析时间，适于工业快速分析。

本发明适用于测定复方氨基酸注射液中的氨基酸各组分的含量。

附图说明

图1是复方氨基酸标准液对应的分离图谱；

图2是待测液对应的分离图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

本发明采用型号为a300氨基酸分析仪；

待测样品为畜用复方氨基酸注射液(河北科星药业有些公司生产)；

对照品具体情况见表1：

表1对照品具体情况

实施例1复方氨基酸注射液含量测定方法

本实施例为一种复方氨基酸注射液含量测定方法，通过一次性进样分离测定含有色氨酸的复方氨基酸注射液中的氨基酸含量，包括依次进行的以下步骤：

1)配液：

配制空白溶液：用36.5％的盐酸溶液调节超纯水的ph＝2.2，得空白溶液；

配制含有色氨酸的复方氨基酸标准液：分别精密称取各氨基酸对照品(各氨基酸对照品具体量参见表2)至100ml量瓶中用50ml空白溶液溶解，稀释定容至刻度，配制成复方氨基酸标准溶液，其中，不同氨基酸各组分的浓度均为100nmol/ml；

配制待测液：精密移取1.00ml复方氨基酸注射液置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释定容，摇匀，0.45μm滤膜过滤，即得待测液。

表2各氨基酸对照品用量一览表

2)分离测定：

取200ml衍生液r加入到氨基酸分析仪内的茚三酮试剂瓶中；

衍生液r为茚三酮溶液，其配制方法为：

称取196.0g醋酸钾，加至150ml去离子水中，电磁搅拌至完全溶解，再加入170ml冰醋酸，溶解后，移至500ml容量瓶中，用10ml超纯水洗涤烧杯三次，合并洗涤液加入到容量瓶中，最后用超纯水定容至500ml，得醋酸钾缓冲溶液h；

称取10g茚三酮，加至300ml无水甲醇中，电磁搅拌至完全溶解，再加入1g苯酚，电磁搅拌至完全溶解，得溶液i；

量取200ml醋酸钾缓冲溶液h，加至溶液i中，电磁搅拌均匀，用0.22μm滤膜过滤后，得溶液j，避光保存；

衍生液r使用前，称取200mg抗坏血酸，加至溶液j中，混合均匀后，避光保存4小时，即为衍生液r。

分别量取20μl复方氨基酸标准液、待测液、空白溶液，分别进样于氨基酸分析仪，氨基酸分析仪运行时间为90min，进样量为20μl，流动相的流速为250μl/min，柱压随时间变化而变化；随运行时间变化采用不同流动相与衍生液r配合分别洗脱分离标准液、待测液或空白溶液中含有的氨基酸各组分，将分离后的氨基酸各组分分别经a通道或b通道测定峰面积，得到相应的标准液峰面积、待测液峰面积、空白溶液峰面积；

其中，a通道检测波长为570nm，用于检测除脯氨酸以外的其他氨基酸峰面积，包括色氨酸峰面积；

b通道检测波长为440nm，用于检测脯氨酸峰面积，

衍生化反应的温度为115℃；

流动相主要由三水合乙醇钠、乙醇、甲酸、乙酸、三氟乙酸、氢氧化钠、硼酸、edta二钠盐、辛酸、超纯水中的至少两种按不同比例配制而成，具体见表3：

表3流动相配制比例一览表

在洗脱分离过程中随运行时间不同对应流动相不同，具体时间对应的具体流动相见表4：

表4不同流动相对应运行时间一览表

其中，清洗液为超纯水；

氨基酸分析仪采用型号为氨基酸分析仪a300，离子柱采用型号为t548n的氨基酸阳离子分离柱；柱温随洗脱分离时间变化而变化，具体柱温见表5：

表5柱温变化参数一览表

3)计算：标准液峰面积、待测液峰面积分别扣除空白溶液峰面积，得相对标准液峰面积和相对待测液峰面积，再以外标法计算氨基酸各组分的含量。

由对照得出校正因子：

a：各对照峰面积

2nmol：对照品溶液进样摩尔质量

20ul:对照品溶液进样体积

a’：样品峰面积；cab：校正因子；fw：各氨基酸分子量；转化单位：10^-9ng为1g；

参见图1、2，计算结果为门冬氨酸含量105.35％、苏氨酸102.79％、丝氨酸100.75％、谷氨酸108.58％、甘氨酸105.71％、丙氨酸105.96％、缬氨酸104.41％、甲硫氨酸105.49％、异亮氨酸102.88％、亮氨酸109.21％、酪氨酸104.18％、苯丙氨酸105.65％、氨酪酸99.10％、盐酸组氨酸106.26％、盐酸赖氨酸99.80％、色氨酸105.90％、盐酸精氨酸101.73％、脯氨酸99.60％。

实施例2-6复方氨基酸注射液含量测定方法

实施例2-6分别为复方氨基酸注射液含量测定方法，其测定方法与实施例1相同，不同之处在于复方氨基酸注射液含量测定过程中的各项工艺参数不同，具体详见表6：

表6实施例2-6的各项工艺参数一览表

实施例2-6中所用的流动相的具体配制比例见表7-11：

表7实施例2的流动相配制比例一览表

表8实施例3的流动相配制比例一览表

表9实施例4的流动相配制比例一览表

表10实施例5的流动相配制比例一览表

表11实施例6的流动相配制比例一览表

实施例2-6的测试结果见表12：

表12实施例2-6的测试结果一览表

实施例7方法性能试验

a1)精密度试验

精密吸取复方氨基酸标准液1ml，以盐酸溶液(ph2.2)稀释并定容至100ml容量瓶中，平行处理6次，按实施例1的测定方法测定其含量，重复6次，试验结果见下表。

表13精密度试验测定的峰面积结果

由表13可知，相对标准偏差值rsd在0.63-2.00％，检测方法的精密度良好。

a2)准确度试验

按照本品处方量，分别配制各氨基酸含量为处方量的高(120％)、中(100％)、低(80％)共9份溶液，按实施例1的测定方法测定其含量，并计算回收率。各氨基酸回收率试验结果见表14-16。

表1480％氨基酸各组分回收率试验结果

表15100％氨基酸各组分回收率试验结果

表16120％氨基酸各组分回收率试验结果

由表14-16可知，除氨酪酸外氨基酸各组分回收率均达到90％以上，氨酪酸回收率为87.63％以上，略微偏低原因可能是实验人员称量标准品时产生误差。

a3)重复性试验

精密吸取复方氨基酸注射液1ml，以盐酸溶液(ph2.2)稀释并定容至100ml容量瓶中，平行处理6次，按实施例1的测定方法测定其含量，重复6次。

表17重复性试验测定结果

由表17可知，相对标准偏差值rsd在0.60-2.00％，检测方法的重复性良好。