本发明属于分离检测技术领域，具体涉及一种铁观音茶叶杀青物中茶香成分的分离方法。
背景技术：
铁观音属于中国传统名茶中青茶的代表之一，铁观音茶叶加工工艺由采青、晒青、做青、杀青、包揉、烘干等工序组成，每一道工艺都赋予铁观音茶叶特殊的香气特征。铁观音具有清香、花香、果香等香气特征，同时又具有苦味、涩感等味觉特征，这些不同的感官特征来源于不同的成分组群。尽管国内外对茶叶香味物质进行了大量研究，但目前多集中于茶叶香气物质的定性分析(张峰,陈小明,范坚强,等.铁观音杀青物香料的开发及其在卷烟中的应用[j].香精香料化妆品,2016,12(6):16-20；马宇平,岳田利,毛多斌,等.“湖南毛尖”香味成分的超临界co2萃取剂在烟草中的应用[j].烟草科技,2006,(6):30-34.)，对茶叶及茶叶制品中构成茶香特征的关键成分及其具体感官作用鲜见报道。
事实上，复杂体系中香味成分的感官贡献机制十分复杂，不同香气成分的混合，可能会导致香气强度甚至类型的巨大变化，而仅从化学物质层面看，这种香气成分间协同作用是不规律的。在大多数食品体系中，真正能够对食品香气特征产生作用的特征香气物质只占到总挥发性香气成分的3％以内(a.dunkel,m.steinhaus,m.kotthoff,b.nowak,d.krautwurst,p.schieberle,andt.hofmann,nature’schemicalsignaturesinhumanolfaction:afoodborneperspectiveforfuturebiotechnology,angew.chem.int.ed.2014,53,7124-7143.)。这一重要结论说明，并非所有食品挥发性成分都能对人产生香气刺激。仅仅关注占食品挥发性成分比例很小的特征香气成分就有可能模拟食品的香气特征。通过研究食物中特征香气的贡献值，并进行香气模型建立(aromamodeling)及消除实验(omissionexperiment)，研究者能够得到与食品香气轮廓非常相似的香气重组物(aromarecombinate)(s.l.guen,c.prostandm.demaimay,evaluationoftherepresentativenessoftheodorofcookedmusselextractsandtherelationshipbetweensensorydescriptorsandpotentodorants,j.agric.foodchem.2001(49)1321-1327；j.linandr.l.rouseff,characterizationofaroma-impactcompoundsincold-pressedgrapefruitoilusingtime–intensitygc–olfactometryandgc–ms,flavorfrag.j.2001(16)457–463.)。
因此，通过感官导向的方式，将化学分析手段与感官评价技术相结合，采用现代分析分离技术，对铁观音茶叶进行感官导向分离，直接定位出对茶香特征有贡献的关键化学组分，去除涩感、苦味能感官评价负面的组分，这对茶叶和茶叶制品的关键香味成分的认知以及茶叶及茶叶制品品质的提高具有重要作用。
因此，目前需要一种分离铁观音茶叶杀青物中茶香成分的方法。
技术实现要素：
发明人经过一系列对于铁观音茶叶杀青物进行分离的研究，定性得到了铁观音茶叶杀青物中具有茶香特征的化学成分。
本发明提供了一种铁观音茶叶杀青物中茶香成分的分离方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将铁观音茶叶杀青物进行水蒸气蒸馏，得到铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液，并将铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液进行干燥处理，得到干燥后的固体物质；
(2)将步骤(1)中所获得的固体物质溶解于溶剂中，过滤后进行凝胶渗透色谱分离，凝胶渗透色谱采用的流动相流速为1～8ml/min，例如1～7ml/min，例如1～6ml/min，例如1～5ml/min，例如包括2ml/min、3ml/min、4ml/min、5ml/min、6ml/min、7ml/min，每1～8分钟、例如1～7分钟、例如1～6分钟、例如1～5分钟，例如2、3、4、5、6、7分钟，收集得到一个流分，共得到一百个以上的流分；
(3)按照gb/t14454.2-2008“香料香气评定法”对步骤(2)中各个流分进行香气评定，确定具有茶香特征的流分；和
(4)将具有茶香特征的流分合并，并采用气相色谱-质谱(gc-ms)来检测合并的具有茶香特征的流分，得到检测谱图，结合谱图数据库和/或谱图文献以定性出该流分中的茶香成分。
在本发明的一些实施方案中，杀青物包括纯露、精油、净油、提取物等形式。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(1)中水蒸气蒸馏包括水中蒸馏、水上蒸馏和直通水蒸气蒸馏，优选直通水蒸气蒸馏，更优选水蒸气蒸馏的冷凝温度为10℃～25℃，例如15℃～25℃、10℃～25℃、10℃～20℃。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(1)中干燥处理包括自然蒸发干燥、真空蒸发干燥和冷冻干燥处理；优选地，干燥处理为冷冻干燥处理；更优选地，冷冻干燥处理包括将铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液置于冰箱中冷冻6～12小时(例如7、8、9、10、11小时)，和将冷冻后的所述馏出液进行干燥处理。
在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中溶剂选自乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、水及其中任意多种的组合，优选为乙醇。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(2)中凝胶渗透色谱所用的填料包括sephadexg-10、sephadexg-15、sepharose6b、sepharosecona、sephadexg-25和sephadexlh-20，优选sephadexg-10、sephadexg-15和sephadexlh-20。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(2)中凝胶渗透色谱所用的流动相包括乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、水及其中任意多种的组合，优选乙醇、水及其组合。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(2)中经过凝胶渗透色谱分离得到一百个以上的流分，例如约100～180个流分，例如约110～170个流分，例如约120～150个流分，例如约115～145个流分，例如117个、125个、133个、145个流分。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(3)中按照gb/t14454.2-2008“香料香气评定法”(例如其中的三角评析法)对通过凝胶渗透色谱分离得到的各个流分的嗅觉特征进行香气评定，确定具有茶香特征的流分，每次评价时评香人员不少于5人。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(4)中铁观音茶叶杀青物中茶香成分包括月桂烯、1-苯基-1,2-丙二酮、苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、橙花醇、香叶醇、2-苯基巴豆醛、吲哚、茉莉酮、丁酸苯乙酯、橙花叔醇、茉莉酸甲酯、茶香酮、氧化芳樟醇(吡喃型)、氧化芳樟醇(呋喃型)、正己醛、苯甲醛、正己酸乙酯、α-萜品烯、α-水芹烯、柠檬烯、苯甲醇、2-甲基丁酸丁酯、(z)-丙酸-3-己烯酯、对甲基苯异丙醇、柠檬醛、γ-癸内酯、2(5h)-呋喃酮、γ-丁内酯、γ-壬内酯、叶醇、苯乙醛、芳樟醇、水杨酸甲酯、4-萜烯醇、癸醛、二氢猕猴桃内酯、可卡醛。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(4)中气相色谱-质谱的条件在于如下(a)至(k)中的一项或多项：
(a)色谱柱选自db-5ms及其等效柱；
优选地，色谱柱的规格为60m×0.25mm×0.25μm；
(b)气相色谱采用的载气为氦气；
(c)气相色谱的载气流量为0.5～10ml/min；
(d)气相色谱的进样温度为280℃；
(e)气相色谱的升温程序为：以3℃/分钟的速度，从50℃升至300℃，在300℃保持1分钟；
(f)气相色谱采用不分流模式；
(g)质谱的传输线温度为280℃；
(h)质谱的ei离子源温度为230℃；
(i)质谱的四级杆温度为150℃；
(j)质谱的ei电离能为70ev；
(k)质谱的扫描模式为选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(4)中采用气相色谱-质谱(gc-ms)检测得到的检测谱图选自总离子色谱图和质量色谱图。
在本发明的一些实施方案中，在步骤(4)中谱图数据库为nist库检索，和通过保留时间和/或定性离子进行定性分析。
在本发明的一些实施方案中，铁观音茶叶杀青物中茶香成分、保留时间和定性离子的信息如表1所示。
表1铁观音茶叶杀青物中茶香成分、保留时间和定性离子的信息
在本发明的一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
(1)将铁观音茶叶杀青物进行水蒸气蒸馏，得到铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液，并将铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液进行干燥处理，得到干燥后的固体物质；
(2)将步骤(1)中所获得的固体物质溶解于溶剂如乙醇中，过滤后进行凝胶渗透色谱分离，其中凝胶渗透色谱分离的操作条件为填料为sephadexg-10，以乙醇为流动相，流动相的流速为1～8ml/min，例如1～6ml/min。每1～8分钟、例如1～6分钟收集得到一个流分，共得到一百个以上的流分；
(3)按照gb/t14454.2-2008“香料香气评定法”对步骤(2)中各个流分进行香气评定，确定具有茶香特征的流分；和
(4)将具有茶香特征的流分合并，并采用气相色谱-质谱(gc-ms)来检测合并的具有茶香特征的流分，得到检测谱图，结合谱图数据库和/或谱图文献以定性出该流分中的茶香成分，所述茶香成分包括苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、橙花醇、香叶醇、2-苯基巴豆醛、吲哚、茉莉酮、橙花叔醇、茉莉酸甲酯、茶香酮、氧化芳樟醇(吡喃型)、氧化芳樟醇(呋喃型)、正己醛、苯甲醛、正己酸乙酯、α-萜品烯、α-水芹烯、柠檬烯、苯甲醇、2-甲基丁酸丁酯、(z)-丙酸-3-己烯酯、对甲基苯异丙醇、柠檬醛、γ-癸内酯、2(5h)-呋喃酮、γ-丁内酯、γ-壬内酯、叶醇、苯乙醛、芳樟醇、水杨酸甲酯、4-萜烯醇、癸醛、二氢猕猴桃内酯、可卡醛；
其中，气相色谱的操作条件为：色谱柱为db-5ms(规格为60m×0.25mm×0.25μm)；载气为氦气；载气流量为1ml/min；进样温度为280℃；升温程序为：从50℃开始，以3℃/min升至300℃，在300℃保持1min；采用不分流模式；质谱的操作条件为：传输线温度为280℃；ei离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；ei电离能为70ev；扫描模式：选择离子扫描。
在本发明的一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
(1)将铁观音茶叶杀青物进行水蒸气蒸馏，得到铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液，并将铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液进行干燥处理，得到干燥后的固体物质；
(2)将步骤(1)中所获得的固体物质溶解于溶剂如乙醇中，过滤后进行凝胶渗透色谱分离，其中凝胶渗透色谱分离的操作条件为填料为sephadexg-10，以水为流动相，流动相流速为1～8ml/min，例如1～6ml/min。每1～8分钟、例如1～6分钟收集得到一个流分，共得到一百个以上的流分；
(3)按照gb/t14454.2-2008“香料香气评定法”对步骤(2)中各个流分进行香气评定，确定具有茶香特征的流分；和
(4)将具有茶香特征的流分合并，并采用气相色谱-质谱(gc-ms)来检测合并的具有茶香特征的流分，得到检测谱图，结合谱图数据库和/或谱图文献以定性出该流分中的茶香成分，所述茶香成分包括月桂烯、苯乙醇、1-苯基-1,2-丙二酮、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、橙花醇、香叶醇、2-苯基巴豆醛、吲哚、茉莉酮、丁酸苯乙酯、橙花叔醇、茉莉酸甲酯、茶香酮、氧化芳樟醇(吡喃型)、氧化芳樟醇(呋喃型)、正己醛、苯甲醛、正己酸乙酯、α-萜品烯、α-水芹烯、柠檬烯、苯甲醇、2-甲基丁酸丁酯、(z)-丙酸-3-己烯酯、对甲基苯异丙醇、柠檬醛、γ-癸内酯、γ-丁内酯、γ-壬内酯、叶醇、苯乙醛、芳樟醇、水杨酸甲酯、4-萜烯醇、癸醛、二氢猕猴桃内酯、可卡醛；
其中，气相色谱的操作条件为：色谱柱为db-5ms(规格为60m×0.25mm×0.25μm)；载气为氦气；载气流量为1ml/min；进样温度为280℃；升温程序为：从50℃开始，以3℃/min升至300℃，在300℃保持1min；采用不分流模式；质谱的操作条件为：传输线温度为280℃；ei离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；ei电离能为70ev；扫描模式：选择离子扫描。
术语解释：
本发明中，将铁观音鲜叶经一系列工序加工成铁观音成品茶叶的过程中得到的任意中间产物，包括但不限于铁观音茶叶采青物、晒青物、做青物、杀青物、包揉物、烘干物等，其中，在铁观音鲜叶经一系列工序制作铁观音成品茶叶过程中，杀青工序得到铁观音茶叶杀青物。
本发明中，术语“气相色谱”或“gc”是指将样品混合物蒸发并注射进通过包含固定相(由液体或颗粒固体组成)的柱运动的载气(如氮气或氦气)流、并根据化合物对固定相的亲合力分离成其各组成化合物的一种色谱分离方法。
本发明中，术语“质谱法”或“ms”是指通过化合物的质量鉴定化合物的分析技术。质谱的基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。ms技术通常包括(1)电离化合物以形成带电荷的化合物；和(2)检测带电荷的化合物的分子量和计算质荷比。化合物可被电离和通过任何适合的方法检测。“质谱仪”通常包括电离源和离子检测器。
本发明取得的有益效果包括但不限于：
1、本发明方法能够对铁观音茶叶杀青物中具有茶香特征的化学成分进行定性分析，可作为一种筛选茶叶及茶叶制品茶香成分的高效、便捷方法。
2、本发明方法针对于铁观音茶叶杀青物，将香料香气评定法(gb/t14454.2-2008)引入茶香成分的研究中，能够有利地指导铁观音茶叶杀青物茶香成分的凝胶渗透色谱分离。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的铁观音茶叶杀青物中茶香成分的分离方法，所述方法包括：
将铁观音杀青物放置于蒸馏釜内，采用直通水蒸气方式进行水蒸气蒸馏，冷凝器的温度控制在15℃～20℃。取获得的铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液100ml，置于冰箱中冷冻6小时，冷冻后的样品在冷冻干燥机中进行干燥处理，得到干燥后的固体。
将上述冷冻干燥的固体称重，并溶解于2ml乙醇中，充分震荡后过滤，过滤后的样品进行凝胶渗透色谱分离。凝胶渗透色谱分离的操作条件：填料为sephadexg-10，以乙醇为流动相，流动相的流速为3ml/min。通过流分收集器每3min收集一个流分，共收集117个流分，分别标记为f1、f2、f3、f4、f5、f6…f117。
按照gb/t14454.2-2008“香料香气评定法”，由六位评香员对上述117个流分分别进行香气评价，取平均结果。平均结果显示：流分f37～f50具有清新的茶香、花香，茉莉似香气，略带烤面包气息；流分f51～f57具有清新的茶香、花香，甜的、茉莉似气息；流分f58～f64同流分f51～f57接近，香气更弱；将流分f37～f50、流分f51～f57、流分f58～f64合并后嗅香评价结果为：清新的茶香、茉莉似花香、甜香气息，可以体现铁观音茶香特征。
将流分f51～f57、流分f58～f64合并后使用gc-ms定性分析，其中，气相色谱的操作条件为：色谱柱为db-5ms(规格为60m×0.25mm×0.25μm)；载气为氦气；载气流量为1ml/min；进样温度为280℃；升温程序为：从50℃开始，以3℃/min升至300℃，在300℃保持1min；采用不分流模式；质谱的操作条件为：传输线温度为280℃；ei离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；ei电离能为70ev；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。
根据总离子色谱图和质量色谱图，结合nist库检索，通过文献查阅和分析，同时购买标样进行保留时间比对和嗅觉特征评价，共定性出36种对铁观音杀青物茶香特征产生直接贡献的成分，其名称和嗅觉特征如表2所示。
表2定性出的36种对茶香有直接贡献的成分
实施例2
本实施例的铁观音茶叶杀青物中茶香成分的分离及检测方法，所述方法包括：
将铁观音茶叶杀青物放置于蒸馏釜内，采用水上蒸馏方式进行水蒸气蒸馏，冷凝器的温度控制在15℃～20℃。取铁观音茶叶杀青物水蒸气馏出液500ml，置于冰箱中冷冻12小时，冷冻后的样品在冷冻干燥机中进行干燥处理，得到干燥后的固体。
将上述冷冻干燥的固体称重，并溶解于10ml乙醇中，充分震荡后过滤，过滤后的样品进行凝胶渗透色谱分离。凝胶渗透色谱分离的操作条件：填料为sephadexg-10，以水为流动相，流动相流速为4ml/min。通过流分收集器每3min收集一个流分，共收集145个流分，分别标记为f1、f2、f3、f4、f5、f6…f145。
按照gb/t14454.2-2008“香料香气评定法”，由六位评香员对上述145个流分进行香气评价，取平均结果、平均结果显示：流分f42～f58具有清新的茶香、花香，茉莉似香气，略带烤面包气息；流分f59～f67具有清新的茶香、花香，甜的、茉莉似气息；流分f68～f80同流分f42～f58接近，香气更弱；将流分f42～f58、流分f59～f67、流分f68～f80合并后嗅香评价结果为：清新的茶香、茉莉似花香、甜香气息，可以体现铁观音茶香特征。
将流分f42～f58、流分f59～f67、流分f68～f80合并后使用gc-ms定性分析，其中，气相色谱的操作条件为：色谱柱为db-5ms(规格为60m×0.25mm×0.25μm)；载气为氦气；载气流量为1ml/min；进样温度为280℃；升温程序为：从50℃开始，以3℃/min升至300℃，在300℃保持1min；采用不分流模式；质谱的操作条件为：传输线温度为280℃；ei离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；ei电离能为70ev；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。
根据总离子色谱图和质量色谱图，结合nist库检索，通过文献查阅和分析，同时购买标样进行保留时间比对和嗅觉特征评价，共定性出38种对铁观音茶叶杀青物茶香特征产生直接贡献的成分，其名称和嗅觉特征如表3所示。
表3定性出的38种对茶香有直接贡献的成分
对比例1
凝胶渗透色谱分离的操作条件中，流动相的流速为10ml/min，通过流分收集器每0.5min收集得到一个流分，共得到60个流分，其余与实施例1相同。
结果发现：不同流分之间的香气差异不明显，无法有效筛选出具有茶香香韵的流分用于后续分析。
对比例2
gc-ms操作条件中，采用全扫描模式，其余与实施例1相同。
结果发现：定性出的茶香成分数量较少。造成这一结果的原因可能是：基线噪音较大，导致低含量物质的检测峰强度过低，甚至不出峰，这直接影响了茶香成分的定性结果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。