萎缩性胃炎稀土检测试纸条、检测卡、试剂盒及制备方法与流程

本发明涉及一种萎缩性胃炎稀土检测试纸条、检测卡、试剂盒及制备方法。

背景技术：

胃蛋白酶原(pepsinogen，pg)由375个氨基酸组成，分子量约为42kda，主要由胃黏膜组织合成分泌，可在胃酸刺激下活化为具备消化功能的胃蛋白酶。pgⅰ和pgⅱ的来源不同，pgⅰ主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；而pgⅱ几乎来源于所有的胃腺细胞，如胃贲门腺、胃底腺、胃窦幽门腺细胞，甚至还包括远端十二指肠brunner腺细胞。正常情况下，大部分已合成的pg直接进入胃腔，只有少数(约1％)会透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，且保持稳定。血清pg水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能pgⅰ是检测胃泌酸腺细胞功能的指针,胃酸分泌增多pgⅰ升高,分泌减少或胃粘膜腺体萎缩pgⅰ降低；pgⅱ与胃底粘膜病变的相关性较大(相对于胃窦粘膜),其升高与胃底腺管萎缩、肠上皮化生或假幽门腺化生、异型增生有关；pgr进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关.因此,联合测定pgⅰ和pgⅰ/pgⅱ比值(pgr)可起到胃底腺粘膜“血清学活检”的作用。

胃蛋白酶原与萎缩性胃炎的发生密切相关，萎缩性胃炎可导致胃黏膜主细胞缺失，从而影响其分泌功能。其中，在胃体黏膜发生萎缩时，胃黏膜主细胞和腺细胞数量随之减少，从而导致血清pgⅰ水平下降；因pgⅱ尚可由胃窦和十二指肠腺细胞分泌，故pgⅱ水平尚可处于相对稳定的状态。因此，pgⅰ/pgⅱ比值(pgr)降低，如胃黏膜萎缩程度继续进展，范围扩大累及全胃时，则pgⅰ和pgⅱ含量均降低，由于pgⅰ下降程度较pgⅱ更加明显，故pgr亦随之下降。国外学者dimario等研究发现低水平的pgⅰ和pgr与胃体萎缩性胃炎具有显著相关性。而国内学者陈洁等的研究亦表明，萎缩性胃炎患者血清pgⅰ水平和pgr值显著降低，并且与病变程度呈负相关。由此可知，血清pgⅰ和pgr水平降低可作为判断胃黏膜萎缩的重要血清学指标。经r℃曲线统计分析显示，在诊断萎缩性胃炎时，pgⅰ水平特异性较高，可达80％，而pgr比值敏感性较高，达75％，诊断价值更高。

现有技术中测定pgⅰ/pgⅱ蛋白的方法主要有免疫比浊法、化学发光法、酶联免疫法、免疫层析法、乳胶增强免疫比浊法等。乳胶增强免疫比浊法(letia)操作简单、省时，但需采用全自动大型生化分析仪完成；酶联免疫法(elisa)灵敏度高，样品量大可定量检测，但操作时间长且自动化低；免疫比浊法(tia)和化学发光法(cl)较为敏感、准确，可应用于全自动生化仪，但需要仪器且耗时较长，适合处理大量样本，无法满足快速检测的目的。

时间分辨荧光分析法(trfia)是上个世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段。时间分辨荧光免疫分析是建立在层析技术、抗原一抗体特异性免疫反应与荧光标记技术结合起来一项新兴免疫检测技术。目前，在时间分辨荧光分析法中，已经报道了许多应用到的时间分辨荧光探针的稀土纳米材料，但依然存在很大的改进空间。如与稀土配合物溶胀合成的时间分辨荧光微球存在稀土配合物易泄露、易受光漂白等缺点；解离增强法(delfla)虽然具有灵敏度高，但必须加入增强液才可以检测荧光；有些荧光微球存在荧光强度弱等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的是为了改善现有技术的不足，而提供一种能够快速萎缩性胃炎稀土检测试纸条、检测卡、试剂盒及制备方法。

实现本发明目的的技术方案是：一种萎缩性胃炎稀土检测试纸条，包括底衬，以及沿长度方向顺次搭接在底衬上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫上喷涂标记有单克隆抗体pgⅰ、单克隆抗体pgⅱ和兔igg抗体的稀土纳米荧光微球；所述硝酸纤维膜上通过单克隆抗体pgⅰ、单克隆抗体pgⅱ、羊抗兔抗体相对应的单克隆抗体依次划线，分别作为第一检测线、第二检测线和质控线；所述第一检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水纸。

进一步地，所述稀土纳米荧光微球为铕掺杂氟化钆镥，化学式为nagdxlu1-y-xf4:yeu，其中nagdxlu1-y-xf4为基质，掺杂离子为铕，x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数。x的范围为20％～70％，优选为40％，y的范围为0-30％，优选为20％，粒径为50nm～150nm。

进一步地，所述稀土纳米荧光微球的制备方法包括以下步骤：

步骤一，在100ml三口圆底烧瓶中，加入3-6ml油酸和7-14ml1-十八烯，再按摩尔比例，加入x份gd的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，y份eu的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，1-x-y份的lu的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，其中x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～70％，y的范围为0-30％；

步骤二，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；

步骤三，自然冷却至50℃，释放真空，加入1-2mmolnaoh和1.6-3.4mmol氟化铵甲醇混合溶液，反应30min；

步骤四，升温至100℃，抽气换气3-4次，通入氮气，升温至300℃，反应1-2小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3-4次，分散于环己烷中；

步骤五，利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性nagdxlu1-y-xf4:yeu稀土纳米荧光微球。

进一步地，所述稀土纳米荧光微球在基态下稳定，在250nm～380nm的激发光源作用下发射出波长范围在600nm～620nm的荧光。

进一步地，所述稀土纳米荧光微球的粒径为50nm～150nm。

进一步地，所述底衬的尺寸为80nm×4mm，样品垫尺寸为18nm×4mm，结合垫尺寸为15nm×4mm，硝酸纤维素膜尺寸为25nm×4mm，吸水纸尺寸为28nm×4mm。

本发明还提供一种萎缩性胃炎稀土检测卡，包括卡壳和设置于卡壳内部的试纸条；所述试纸条采用上述萎缩性胃炎稀土检测试纸条；所述卡壳上设有加样孔和观察窗，加样孔的位置于试纸条的样品垫相对应，观察窗的位置与硝酸纤维膜上的划线位置相对应。

进一步地，所述卡壳包括相互卡接的塑料上壳和塑料下壳；所述加样孔和观察窗设置于塑料上壳上。

本发明还提供一种萎缩性胃炎稀土检测试剂盒，包括检测卡、样品稀释液和含有定标曲线的id卡；所述检测卡采用上述萎缩性胃炎稀土检测卡。

上述萎缩性胃炎稀土检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，制备稀土纳米荧光微球；

步骤二，活化稀土纳米荧光微球；

步骤三，稀土纳米荧光微球标记pgⅰ、pgⅱ相对应的单克隆抗体和兔igg；

步骤四，制备样品垫；

步骤五，制备包被膜；

步骤六，在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，再切割成试纸条。

步骤七，将试纸条组装在卡壳中；

步骤八，配置样本稀释液；

步骤九，制备含有标准曲线的id卡。

采用了上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：本发明利用稀土纳米荧光微球检测技术，可避免样本本身荧光干扰，荧光微球为稀土氟化物发光纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，本发明的检测结果可帮助医生在早期准确地诊断萎缩性胃炎。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为本发明的试纸条的结构示意图。

图2为本发明实施例1的试剂盒的pgⅰ的标准曲线图；

图3为本发明实施例1的试剂盒的pgⅱ的标准曲线图；

图4为发明实施例1的试剂盒与雅培化学发光微粒子免疫检测法检测pgⅰ试剂盒检测结果相关性比较。

图5为发明实施例1的试剂盒与雅培化学发光微粒子免疫检测法检测pgⅱ试剂盒检测结果相关性比较。

附图中的标号为：

样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、第一检测线31、第二检测线32、质控线33、吸水纸4。

具体实施方式

(实施例1)

本实施例的萎缩性胃炎稀土检测试剂盒，包括检测卡、样品稀释液和含有定标曲线的id卡。

检测卡包括卡壳和设置于卡壳内部的试纸条。见图1，试纸条包括底衬，以及沿长度方向顺次搭接在底衬上的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4；所述结合垫2上喷涂标记有pgⅰ、pgⅱ和兔igg抗体的稀土纳米荧光微球；所述硝酸纤维膜上通过pgⅰ、pgⅱ、兔igg抗体相对应的单克隆抗体依次划线，分别作为第一检测线31、第二检测线32和质控线33，其中，第一检测线31靠近结合垫2，质控线33靠近吸水纸4。

底衬的尺寸为80nm×4mm，样品垫1尺寸为18nm×4mm，结合垫2尺寸为15nm×4mm，硝酸纤维素膜3尺寸为25nm×4mm，吸水纸4尺寸为28nm×4mm。

稀土纳米荧光微球为铕掺杂氟化钆镥，化学式为nagdxlu1-y-xf4:yeu，其中nagdxlu1-y-xf4为基质，掺杂离子为铕，x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数。x的范围为20％～70％，优选为40％，y的范围为0-30％，优选为20％，粒径为50nm～150nm。稀土纳米荧光微球在基态下稳定，在250nm～380nm的激发光源作用下发射出波长范围在600nm～620nm的荧光。

卡壳包括相互卡接的塑料上壳和塑料下壳；塑料上壳上设有加样孔和观察窗，加样孔的位置于试纸条的样品垫1相对应，观察窗的位置与硝酸纤维膜上的划线位置相对应。

以nagd0。4lu0.4f4:0.2eu稀土纳米荧光微球为例，本实施例的萎缩性胃炎稀土检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，制备nagd0。4lu0.4f4:0.2eu稀土纳米荧光微球，包括以下步骤：

s1.1，在100ml三口圆底烧瓶中，加入4.5ml油酸和12.5ml1-十八烯，再按摩尔比例，加入1.6mmol醋酸钆，1.6mmol醋酸镥和0.8mmol醋酸铕；

s1.2，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；

s1.3，自然冷却至50℃，释放真空，加入1mmolnaoh和1.6mmol氟化铵甲醇混合溶液，反应30min；

s1.4，升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至300℃，反应1.5小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中；

s1.5，利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性nagd0。4lu0.4f4:0.2eu稀土纳米荧光微球。该稀土纳米荧光微球直径为100nm，且形貌均一，发光性能好。

步骤二，活化稀土纳米荧光微球。具体为：超声波处理稀土纳米荧光微球2min后，取200μl稀土纳米荧光微球以14000rpm高速离心15min后，沉淀物用100mm，ph为6.0的mes溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入50μl的100mg/ml碳二亚胺，混匀5min，再加入100μl的100mg/mln-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀15min后14000rpm高速离心15min，沉淀用ph为6.0的mes溶液洗涤至1ml。

步骤三，制备稀土纳米荧光微球标记pgⅰ、pgⅱ相对应的单克隆抗体和兔igg。具体为：取200μl固含量1％，粒径0.20μm微球至圆底离心管中，加入100μg的pgⅰ抗体，做好标识；取200μl固含量1％，粒径0.20μm微球至圆底离心管中，加入100μg的pgⅱ抗体，做好标识；取200μl固含量1％，粒径0.20μm微球至圆底离心管中，加入120μg的兔igg抗体，做好标识；置于室温避光偶联2h后封闭1h，用保存液清洗2次，14000rpm离心15min，沉淀物即为pgⅰ-yg、pgⅱ-yg和兔igg-yg。

步骤四，制备样品垫1。具体为：用样品垫1处理液(含0.5％nacl、0.5％tween、0.1％bsa的20mm、ph＝8.0的tris-hcl)在底衬上靠近样品垫1的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为4ul液量/cm样品垫1，在样品垫1靠近包被膜一侧将稀土纳米荧光微球标记的单克隆抗体pgⅰ和单克隆抗体pgⅱ以及兔igg抗体用微球稀释液(含0.5％bsa、25％蔗糖的20mmtris-盐酸缓冲液)按8％、8％、3％的比例稀释后均匀喷涂一条线(即微球线)，用量为4ul液量/cm样品垫1。置于烘箱中，37℃烘干过夜。

步骤五，制备包被膜。具体为：分别用包被缓冲液(含0.85％nacl、0.05％proclin300的10mmph8.0pb缓冲液)将单克隆抗体pgⅰ、单克隆抗体pgⅱ和羊抗兔抗体分别调整浓度到1.0mg/ml、1.0mg/ml、0.8mg/ml用量为1ul包被液量/cm膜，分别作为第一检测线31、第二检测线32和质控线33平行划于硝酸纤维素膜3上进行包被，质控线33、检测线间隔4mm，在湿度<30％，温度37℃烘箱中晾干10h，封袋，备用。

步骤六，在底衬(尺寸为80mm×300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫1(尺寸为18mm×300mm，玻璃纤维棉材质)、结合垫2(尺寸为15mm×300mm，聚酯膜)、包被膜(尺寸为25mm×300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸4(尺寸为28mm×300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的试纸条。

步骤七，将试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳卡接而成的卡壳中。

步骤八，配置样本稀释液，为含1％tween-20、1％tween-100、0.3％ph8.0tris-盐酸缓冲液，以180ul/管分装于离心管中。样本稀释液用于层析样品。

步骤九，制备含有标准曲线的id卡(同批次标准曲线相同)，通过检测卡测定不同浓度的质控品，以质控品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入id卡并生成二维码，通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。

标准曲线的绘制过程为：在检测卡中加入不同浓度pgⅰ抗原质控品(200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、70ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、2ng/ml和pgⅱ抗原质控品(100ng/ml、70ng/ml、35ng/ml、10ng/ml、7ng/ml、3ng/ml、1ng/ml)共7个浓度，每个浓度设三个重复，pgⅰ和pgⅱ抗原用小牛血清分别稀释得到1000ng/ml的质控品母液，再用小牛血清稀释到不同质控品浓度，加入样本稀释液，层析15min后，通过广州蓝勃生物科技有限公司生产的afs-1000型干式荧光免疫分析仪读取c、t线荧光信号及c/t值，实验结果及分析如下表所示：

然后，以pgⅰ和pgⅱ质控品浓度和样本信号t1/c和t2/c平均值分别绘制标准曲线，曲线数据见上表，标准曲线如图4所示。其中pgⅰr1值(相关性)为0.9966，pgⅱr2值为0.9954，通过该标线对样品中所含pgⅰ和pgⅱ浓度进行浓度定量测定。

本实施例的检测卡的性能测试如下：

最低检出限：用零值样本进行重复测定20次，计算20次结果的均值m与标准差sd，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限(m+2sd)，pgⅰ结果为0.92ng/ml，符合灵敏度1.0ng/ml。pgⅱ结果为0.86ng/ml，符合灵敏度1.0ng/ml。线性范围：pgⅰ取2.0-200.0ng/ml之间7个浓度值，每个浓度重复测量三次，将测定浓度平均值与理论浓度进行线性分析，得到线性方程y＝0.961x+1.2197，r＝0.9986，本发明试剂盒在2.0-200.0ng/ml线性范围内相关性很好。pgⅱ取1.0-100.0ng/ml之间7个浓度值，每个浓度重复测量三次，将测定浓度平均值与理论浓度进行线性分析，得到线性方程y＝1.0251x+0.0518，r＝0.9971，本发明试剂盒在1.0-100.0ng/ml线性范围内相关性很好。

精密度：取三批实施例1中所制时间分辨荧光定量检测pgⅰ/pgⅱ试剂盒，pgⅰ质控品分别检测70、20ng/ml重复性质控品，每批试剂盒用重复性质控品平行检测10次，70ng/ml浓度三批批内cv分别为4.03％、6.01％、4.93％，三批批间cv为5.14％，20ng/ml浓度三批批内cv分别为6.39％、7.83％、5.54％，三批批间cv为6.42％，均在10％以内。pgⅱ质控品分别检测35、7ng/ml重复性质控品，每批试剂盒用重复性质控品平行检测10次，35ng/ml浓度三批批内cv分别为5.45％、6.01％、6.98％，三批批间cv为5.98％，7ng/ml浓度三批批内cv分别为3.69％、8.38％、8.96％，三批批间cv为7.36％，均在10％以内。

准确度：pgⅰ选择浓度为10ng/ml的质控物为检测样本，分为体积相同3份，在其中2份样本中分别加入150ng/ml和70ng/ml的准确度质控品，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶液，制成基础样本。对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算。计算回收率＝(分析样品浓度-基础样品浓度)/加入浓度×100％。回收样本150ng/ml的回收率为99.65％，70ng/ml的回收率为102.28％，平均回收率为100.96％。偏差在10％以内。pgⅱ选择浓度为5ng/ml的质控物为检测样本，分为体积相同3份，在其中2份样本中分别加入50ng/ml和20g/ml的准确度质控品，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。回收样本50ng/ml的回收率为102.55％，20ng/ml的回收率为106.36％，平均回收率为104.46％。偏差在10％以内。

本实施例的试剂盒的临床样本检测结果如下：

采集医院检测pgⅰ和pgⅱ的血浆样本各200份，用本发明的试剂盒分别和雅培化学发光微粒子免疫检测法检测pgⅰ、pgⅱ试剂盒进行检测比较。本发明试剂盒中，取血浆样本20ul加入样本稀释液，混匀后取80ul加入到检测卡加样孔中，层析15min后通过广州蓝勃生物科技有限公司生产的afs-1000型干式荧光免疫分析仪读取浓度，同一样本分别采用对比系统雅培化学发光微粒子免疫检测法检测pgⅰ、pgⅱ试剂盒进行浓度检测。两种方法检测结果进行线性分析，如图5所示，其相关性很好，pgⅰr＝0.9925，p>0.05，平均相对偏差小于10％，pgⅱr＝0.9856，p>0.05，平均相对偏差小于10％，结果符合临床分析要求，适合用于临床检测。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。