本发明属于药物检测技术领域，具体涉及红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法。
背景技术：
猕猴桃(actinidinchinesispianch)，又名藤梨、羊桃等，为猕猴桃科植物猕猴桃的果实,猕猴桃的药食应用历史悠久。《本草拾遗》记载“主骨接风，瘫痪不遂，长年白发、痔疮、调中下气。”《食疗本草》记载“取瓤和蜜，去烦热，主黄疸，止消渴”。现代研究表明，猕猴桃果具降血脂、保肝护肝等作用，是基于其内含多种有效成份，包括多糖、多酚、黄酮等。同时还证实猕猴桃尚含有皂苷成份，中药活性成分皂苷具有降血糖、血脂，抗炎，抗衰老，抗氧化以及调节免疫等作用等生物活性作用。
原产于中国的猕猴桃共有59个种，主要有绿心猕猴桃、红心猕猴桃和黄心猕猴桃，其中新品种红心猕猴桃，属中华猕猴桃中的红肉猕猴桃变种，是特早熟红心品种，其果实较大，果肉细腻、甜度高，深受广大消费者欢迎，而且红心猕猴桃含有的维生素c、黄铜多酚类化合物、皂苷类化合物以及膳食纤维等营养物质都比常见的绿心猕猴桃、黃心猕猴桃高，所以对红心猕猴桃深加工产品的开发研究更具有经济价值。
为了能更好的开展红心猕猴桃深加工产品的研究，首先需要对其所含有效成分进行提取和测定，而目前只有提取和检测红心猕猴桃中维生素c、黄酮类化合物等有效成分的技术方法，未见有测定红心猕猴桃总皂苷含量的方法。
技术实现要素：
针对上述不足，本发明公开了红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法，有助于对红心猕猴桃产品的深入开发，为制定红心猕猴桃深加工产品质量标准提供依据。
本发明是采用如下技术方案实现的：
红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法，其包括以下步骤：
（1）溶液配制：称取香草醛5.00g放置100ml容量瓶中，加入纯的冰醋酸溶解，并定容至刻度，摇匀即得溶液a；取1ml溶液a，然后加入4ml纯的高氯酸溶液混匀得到溶液b；称取三七皂苷对照品20.5mg，然后加入甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，得浓度为2.05mg/ml的三七皂苷对照品溶液；
（2）样品处理：称取红心猕猴桃干燥果粉5.0g，加蒸馏水300ml在90℃下水浴回流2h，过滤，滤液合并后将滤液减压浓缩至50ml得到提取物溶液，然后5ml取提取物溶液稀释至10ml,定容、摇匀，得到样品液；将5ml的注射器垂直固定，以3︰1的比例装填d101大孔树脂与中性氧化铝制成吸附柱，先用25ml的乙醇溶液洗脱柱子，弃去洗脱液，再用25ml蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，然后向吸附柱加入0.5ml的样品液，接着用25ml的蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，再用乙醇溶液洗脱柱子，收集洗脱液并置于蒸发皿中蒸干，得到供试品；
（3）标准曲线绘制：分别吸取20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl的三七皂苷对照品溶液，置于不同的具塞试管中，然后挥干，在每个具塞试管中加入1ml的溶液b，摇匀后密塞，在60℃下水浴加热15min，然后取出具塞试管立即置于冰水中冷却，接着在每个具塞试管中加入5ml的冰醋酸，摇匀，以蒸馏水作空白，于560mn处测定吸收值，绘制标准曲线，以三七皂苷质量（μg）为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线；
（4）样品测定：将步骤（2）中得到的供试品加入1ml的溶液b置于具塞试管中，摇匀后密塞，在60℃下水浴加热15min，然后取出具塞试管立即置于冰水中冷却，接着加入5ml的冰醋酸，摇匀，以蒸馏水作空白，于560mn处测定吸收值，根据绘制的标准曲线计算求出供试品中总皂苷的含量。
进一步的，步骤（2）中所述减压浓缩是在压力为0.08～0.09mpa的条件下进行的。本发明控制合适的压力，可以防止物料过度鼓泡膨胀导致冲料而使得物料流失。
进一步的，步骤（2）中所述减压浓缩是在温度为60～70℃的条件下进行的。严格控制减压浓缩温度是针对猕猴桃有效成分提取液中溶剂和溶质的沸点，温度过高容易造成猕猴桃有效成分蒸发流失，温度过低延长浓缩时间，增加生产能耗，影响浓缩效率。
进一步的，步骤（3）中所述挥干是在60℃的水浴条件下进行的。
进一步的，步骤（2）中所述乙醇溶液的体积分数为70%。
进一步的，步骤（3）中绘制的标准曲线的回归方程为y=0.0048x-0.0651，相关系数r=0.9994。
上述三七皂苷对照品是由中国食品药品检定研究院提供的批号为110745-201820的三七皂苷r1。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
1.本发明采用热回流法提取红心猕猴桃的水提物，再用紫外分光光度法测定红心猕猴桃水提物的总皂苷含量，其中使用香草醛、冰醋酸和高氯酸按比例配制合适的显示剂；对红心猕猴桃的果粉采用热回流法提取，控制提取温度保证有效成分能完全提取，然后再用d101大孔树脂与中性氧化铝制成合适的吸附柱，用于将水提物中的红心猕猴桃总皂苷全部从水提物中提取分离，提高测定的准确性。
2.本发明方法简便，结果准确，重现性好，可用于测定红心猕猴桃的总皂苷含量，为制定红心猕猴桃深加工产品质量标准提供依据。
3.本发明采用三七皂苷对照品作为对照品，是因为猕猴桃果实存在齐墩果酸、乌苏酸等三萜成份，而三七皂苷同属三萜皂苷，与猕猴桃皂苷的结构相似，并且三七皂苷对照品易得、稳定，本发明使用三七皂苷作为对照品，绘制的标准曲线线性良好，用于计算猕猴桃总皂苷的准确性及重现性均良好。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法，其包括以下步骤：
（1）溶液配制：称取香草醛5.00g放置100ml容量瓶中，加入纯的冰醋酸溶解，并定容至刻度，摇匀即得溶液a；取1ml溶液a，然后加入4ml纯的高氯酸溶液混匀得到溶液b；称取三七皂苷对照品20.5mg，然后加入甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，得浓度为2.05mg/ml的三七皂苷对照品溶液；
（2）样品处理：称取红心猕猴桃干燥果粉5.0g，加蒸馏水300ml在90℃下水浴回流2h，过滤，滤液合并后将滤液减压浓缩至50ml得到提取物溶液，然后5ml取提取物溶液稀释至10ml,定容、摇匀，得到样品液；将5ml的注射器垂直固定，以3︰1的比例装填d101大孔树脂与中性氧化铝制成吸附柱，先用25ml的体积分数为70%的乙醇溶液洗脱柱子，弃去洗脱液，再用25ml蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，然后向吸附柱加入0.5ml的样品液，接着用25ml的蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，再用体积分数为70%的乙醇溶液洗脱柱子，收集洗脱液并置于蒸发皿中蒸干，得到供试品；所述减压浓缩是在压力为0.085mpa和温度为65℃的条件下进行的；
（3）标准曲线绘制：分别吸取20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl的三七皂苷对照品溶液，置于不同的具塞试管中，然后在60℃的水浴条件下挥干，在每个具塞试管中加入1ml的溶液b，摇匀后密塞，在60℃下水浴加热15min，然后取出具塞试管立即置于冰水中冷却，接着在每个具塞试管中加入5ml的冰醋酸，摇匀，以蒸馏水作空白，于560mn处测定吸收值，绘制标准曲线，以三七皂苷质量（μg）为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线，回归方程为y=0.0048x-0.0651，相关系数r=0.9994；
（4）样品测定：将步骤（2）中得到的供试品加入1ml的溶液b置于具塞试管中，摇匀后密塞，在60℃下水浴加热15min，然后取出具塞试管立即置于冰水中冷却，接着加入5ml的冰醋酸，摇匀，以蒸馏水作空白，于560mn处测定吸收值，根据绘制的标准曲线计算求出供试品中总皂苷的含量。
按照本实施例所述方法，对红心猕猴桃干燥果粉进行处理后，平行称取3份25.0mg的供试品进行红心猕猴桃总皂苷的含量测定，测定结果见表1；
表1红心猕猴桃总皂苷的含量
由表1可见红心猕猴桃总皂苷的含量为4.454mg/g。
实施例2：加样回收率实验
按照实施例1所述的红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法制取得到红心猕猴桃的样品液，然后将样品液稀释一倍后平行移取9份，每份移取0.5ml，然后分成3组，每组3份，3个组中分别加入三七皂苷对照品溶液，每组中三七皂苷对照品溶液的加入量分别为试样中总皂苷含量（以三七皂苷计）的50%，100%，150%，按照实施例1所述的红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法进行测定，平行测试6次，计算加样回收率及rsd，具体结果见表2；
表2加样回收率及rsd
由上述低、中、高3个浓度水平的加样回收试验可见，回收率分别96.98%，100.52%，94.84%，rsd分别为3.8%，3.7%，4.3%，说明本发明所述方法满足定量分析的要求。
实施例3：稳定性实验
按照本实施例1所述红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法制备红心猕猴桃的供试品一份并进行总皂苷的含量测定，在560nm波长处，分别测定0min、10min、20min、40min、60min的吸光度，说得到的结果分别0.471、0.462、0.478、0.465、0.459,平均值0.467，rsd为1.62%，由此可以表明本发明在60min内显色稳定。
实施例4：
红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法，其包括以下步骤：
（1）溶液配制：称取香草醛5.00g放置100ml容量瓶中，加入纯的冰醋酸溶解，并定容至刻度，摇匀即得溶液a；取1ml溶液a，然后加入4ml纯的高氯酸溶液混匀得到溶液b；称取三七皂苷对照品20.5mg，然后加入甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，得浓度为2.05mg/ml的三七皂苷对照品溶液；
（2）样品处理：称取红心猕猴桃干燥果粉5.0g，加蒸馏水300ml在90℃下水浴回流2h，过滤，滤液合并后将滤液减压浓缩至50ml得到提取物溶液，然后5ml取提取物溶液稀释至10ml,定容、摇匀，得到样品液；将5ml的注射器垂直固定，以3︰1的比例装填d101大孔树脂与中性氧化铝制成吸附柱，先用25ml的体积分数为70%的乙醇溶液洗脱柱子，弃去洗脱液，再用25ml蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，然后向吸附柱加入0.5ml的样品液，接着用25ml的蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，再用体积分数为70%的乙醇溶液洗脱柱子，收集洗脱液并置于蒸发皿中蒸干，得到供试品；所述减压浓缩是在压力为0.08mpa和温度为60℃的条件下进行的；
（3）标准曲线绘制：分别吸取20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl的三七皂苷对照品溶液，置于不同的具塞试管中，然后在60℃的水浴条件下挥干，在每个具塞试管中加入1ml的溶液b，摇匀后密塞，在60℃下水浴加热15min，然后取出具塞试管立即置于冰水中冷却，接着在每个具塞试管中加入5ml的冰醋酸，摇匀，以蒸馏水作空白，于560mn处测定吸收值，绘制标准曲线，以三七皂苷质量（μg）为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线，回归方程为y=0.0048x-0.0651，相关系数r=0.9994；
（4）样品测定：将步骤（2）中得到的供试品加入1ml的溶液b置于具塞试管中，摇匀后密塞，在60℃下水浴加热15min，然后取出具塞试管立即置于冰水中冷却，接着加入5ml的冰醋酸，摇匀，以蒸馏水作空白，于560mn处测定吸收值，根据绘制的标准曲线计算求出供试品中总皂苷的含量。
按照本实施例所述方法，对红心猕猴桃干燥果粉进行处理后，平行称取3份25.0mg的供试品进行红心猕猴桃总皂苷的含量测定得到总皂苷含量为4.539mg/g。
实施例5：
红心猕猴桃总皂苷含量的测定方法，其包括以下步骤：
（1）溶液配制：称取香草醛5.00g放置100ml容量瓶中，加入纯的冰醋酸溶解，并定容至刻度，摇匀即得溶液a；取1ml溶液a，然后加入4ml纯的高氯酸溶液混匀得到溶液b；称取三七皂苷对照品20.5mg，然后加入甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，得浓度为2.05mg/ml的三七皂苷对照品溶液；
（2）样品处理：称取红心猕猴桃干燥果粉5.0g，加蒸馏水300ml在90℃下水浴回流2h，过滤，滤液合并后将滤液减压浓缩至50ml得到提取物溶液，然后5ml取提取物溶液稀释至10ml,定容、摇匀，得到样品液；将5ml的注射器垂直固定，以3︰1的比例装填d101大孔树脂与中性氧化铝制成吸附柱，先用25ml的体积分数为70%的乙醇溶液洗脱柱子，弃去洗脱液，再用25ml蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，然后向吸附柱加入0.5ml的样品液，接着用25ml的蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，再用体积分数为70%的乙醇溶液洗脱柱子，收集洗脱液并置于蒸发皿中蒸干，得到供试品；所述减压浓缩是在压力为0.09mpa和温度为70℃的条件下进行的；
（3）标准曲线绘制：分别吸取20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl的三七皂苷对照品溶液，置于不同的具塞试管中，然后在60℃的水浴条件下挥干，在每个具塞试管中加入1ml的溶液b，摇匀后密塞，在60℃下水浴加热15min，然后取出具塞试管立即置于冰水中冷却，接着在每个具塞试管中加入5ml的冰醋酸，摇匀，以蒸馏水作空白，于560mn处测定吸收值，绘制标准曲线，以三七皂苷质量（μg）为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线，回归方程为y=0.0048x-0.0651，相关系数r=0.9994；
（4）样品测定：将步骤（2）中得到的供试品加入1ml的溶液b置于具塞试管中，摇匀后密塞，在60℃下水浴加热15min，然后取出具塞试管立即置于冰水中冷却，接着加入5ml的冰醋酸，摇匀，以蒸馏水作空白，于560mn处测定吸收值，根据绘制的标准曲线计算求出供试品中总皂苷的含量。
按照本实施例所述方法，对红心猕猴桃干燥果粉进行处理后，平行称取3份25.0mg的供试品进行红心猕猴桃总皂苷的含量测定得到总皂苷含量为4.556mg/g。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。