一种那非类医药中间体的高效液相色谱-质谱检测方法与流程

本发明涉及药物检测领域，特别是涉及一种那非类医药中间体的高效液相色谱-质谱检测方法。

背景技术：

目前国家食品药品监督管理总局已出台了多项食品、保健食品中常见非法添加壮阳类药物的补充检验方法。但在高压打击之下，不法分子投机取巧，添加现行标准检测范围之外的其他类似物如顺式-(1r,3r)-1,2,3,4-四氢-1-(3,4-亚甲二氧基苯基)-9h-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯盐酸盐(简称：四氢咔啉盐酸盐，化学式：c20h19cln2o4，cas号：171752-68-4)，该物质是一种新型他达拉非类衍生物，是合成他达拉非的关键中间体，在我国尚未批准上市，国内外均未见相关检测方法。

以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种那非类医药中间体的高效液相色谱-质谱检测方法，以解决目前国内没有医药中间体四氢咔啉盐酸盐相关检测方法的技术问题。

为此，本发明提出以下方案：

一种那非类医药中间体的高效液相色谱-质谱检测方法，包括以下步骤：

s1：取固态样品研磨粉碎混匀，精密称取1g，精确至0.001g，制备固态试样备用；

s2：取软胶囊试样内容物适量混匀，精密称取1g，精确至0.001g，制备含油脂类试样备用；

s3：制备空白试样：即不加试样分别按步骤s1、2同法处理，制得两个空白溶液；

s4：准确称取四氢咔啉盐酸盐标准物质10mg，制备标准储备液；准确吸取标准储备液0.1ml，制备标准中间液；吸取浓度为1μg/ml的标准中间液于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为系列标准曲线溶液；

s5：进行高效液相色谱-串联质谱法检测，所用仪器为：高效液相色谱-串联质谱仪，并配有电喷雾离子源；

s6：通过s5所得的标准物质特征离子的提取离子流图鉴定医药中间体四氢咔啉盐酸盐。

优选地，所述步骤s1中，制备固态试样步骤为：取固态样品研磨粉碎混匀，精密称取1g试样，精确至0.001g，于50ml容量瓶，准确加入甲醇40ml，超声提取15min，放至室温，用甲醇定容至刻度；转移至100ml离心管，5000r/min离心5min，上清液用0.22μm有机相型滤膜过滤，根据实际浓度用50％甲醇水溶液稀释至线性范围即可。

优选地，所述步骤s2中，制备油脂类试样步骤为：取软胶囊试样内容物适量混匀，精密称取1g，精确至0.001g，置于50ml容量瓶中，加乙酸乙酯5ml，振摇，使其分散，加甲醇40ml，超声提取15min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，转移至100ml离心管中，5000r/min离心5min，用0.22μm有机相型滤膜过滤，根据实际浓度用50％甲醇水溶液适当稀释至线性范围内。

优选地，所述步骤s4制备标准储备液步骤为：准确称取四氢咔啉盐酸盐标准物质10mg,用甲醇溶解并稀释至20ml，摇匀，制成浓度为500μg/ml标准储备液；

优选地，所述步骤s4制备标准中间液步骤为：准确吸取标准储备液0.1ml，用甲醇稀释至50ml，摇匀，制成1μg/ml的标准中间液。

优选地，所述步骤s4制备系列标准曲线溶液步骤为：吸取浓度为1μg/ml的标准中间液0.010ml、0.020ml、0.050ml、0.100ml、0.200ml、0.500ml、1.00ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为系列标准曲线溶液，浓度2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml，溶液临用新制或依仪器响应情况配制适当浓度的标准工作溶液。

优选地，所述步骤s5高效液相色谱-串联质谱法检测中，液相色谱条件为：色谱柱：agilenteclipseplusc18，2.1mm×100mm，1.8μm；流动相：a相为0.1％甲酸水溶液，b相为0.1％甲酸乙腈溶液；流速：400μl/min，梯度洗脱；柱温：40℃；进样量：5μl。

优选地，所述梯度洗脱方式为：0～1min时，a相体积百分比的变化为95％→90％；1～3.5min时，a相体积百分比的变化为90％→50％；3.5～6min时，a相体积百分比的变化为50％→10％；6～9min时，a相体积百分比的变化为10％→95％。

优选地，所述步骤s5高效液相色谱-串联质谱法检测中，质谱条件为：以1μg/ml的标准中间液用针泵连续直接进样，在离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测；；扫描方式：正离子模式扫描；雾化气：n2、碰撞气：he的条件下对质谱参数进行优化。

优选地，所述优化条件为：毛细管电压：3.0kv；源温度：150℃；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量：1000l/hr；锥孔气流量：150l/hr；碰撞气流量：0.15ml/min。

本发明与现有技术对比的有益效果包括：

1.目前国内没有中医药中间体四氢咔啉盐酸盐的相关检测方法，本发明填补国了内该化合物分析检测方法的空白。

2.本发明是以超高效液相色谱串联质谱法测定食品中四氢咔啉盐酸盐，兼具超高效液相色谱超强分离能力，以及质谱的专属性与高分辨，能够快速准确地对目标化合物进行定性定量分析。检测结果准确可靠，从而为食品和保健食品中非法添加化学药物的监管提供更可靠的确证依据。

附图说明

图1是本发明中的顺式-(1r,3r)-1,2,3,4-四氢-1-(3,4-亚甲二氧基苯基)-9h-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯盐酸盐(即：四氢咔啉盐酸盐)标准物质特征离子的提取离子流图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式并对照附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

参照以下附图，将描述非限制性和非排他性的实施例，其中相同的附图标记表示相同的部件，除非另外特别说明。

实施例1

一种那非类医药中间体的高效液相色谱-质谱检测方法，包括以下步骤：

(1)固态试样制备

取适量固态样品研磨粉碎混匀，精密称取1g试样(精确至0.001g)于50ml容量瓶，准确加入甲醇40ml，超声提取15min，放至室温，用甲醇定容至刻度。转移至100ml离心管，5000r/min离心5min，上清液用0.22μm有机相型滤膜过滤，根据实际浓度用50％甲醇水溶液适当稀释至线性范围内，备用。

(2)含油脂类试样制备

取软胶囊试样内容物适量混匀，精密称取1g(精确至0.001g)置于50ml容量瓶中，加乙酸乙酯5ml，振摇，使其分散，加甲醇40ml，超声提取15min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，转移至100ml离心管中，5000r/min离心5min，用0.22μm有机相型滤膜过滤，根据实际浓度用50％甲醇水溶液适当稀释至线性范围内，备用。

(3)制备空白试样：即不加试样分别按步骤(1)、(2)同法处理，制得两个空白溶液；

(4)标准曲线溶液

准确称取四氢咔啉盐酸盐标准物质(分子式：c20h19cln2o4，cas号:171752-68-4，纯度≥98％)10mg,用甲醇溶解并稀释至20ml，摇匀，制成浓度为500μg/ml标准储备液。标准储备液在-20℃下避光贮存，有效期3个月。

准确吸取标准储备液0.1ml，用甲醇稀释至50ml，摇匀，制成1μg/ml的标准中间液。标准中间液临用新制。

吸取浓度为1μg/ml的标准中间液0.010ml、0.020ml、0.050ml、0.100ml、0.200ml、0.500ml、1.00ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为系列标准曲线溶液，浓度2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml，临用新制或依仪器响应情况配制适当浓度的标准工作溶液。

(5)高效液相色谱-串联质谱法检测

a.仪器：高效液相色谱-串联质谱仪(watersacquityuplch-class_xevotqd)：配有电喷雾离子源(esi源)。

a.液相色谱条件

色谱柱：agilenteclipseplusc18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：a为0.1％甲酸水溶液，b为0.1％甲酸乙腈溶液。流速：400μl/min，梯度洗脱如表1所示。柱温：40℃；进样量：5μl。

表1液相色谱条件中梯度洗脱模式

为了提高待测物的分离效果和检测灵敏度，分别考察色谱柱agilenteclipseplusc18(2.1mm×100mm，1.8μm)、zorbaxsb-c18色谱柱(2.1×100mm，3.5μm)、acquityuplchsst3(2.1×100mm，1.8μm)三种色谱柱的分离效果，结果表明三种色谱柱均可以有效分离目标物质，其中agilenteclipseplusc18峰形更好，柱效更高。由于食品基质复杂，为保护色谱柱、提高分离效率，方法采用梯度洗脱模式。

b.质谱条件

检测以1μg/ml的标准中间液用针泵连续直接进样，在离子源：电喷雾离子源(esi源)；检测方式：多反应监测(mrm)；；扫描方式：正离子模式扫描；雾化气：n2、碰撞气：he的条件下对质谱参数进行优化，优化条件如下：

毛细管电压：3.0kv；源温度(sourcetemperature)：150℃；脱溶剂温度(desolvationtemperature)：500℃；脱溶剂气流量(desolvationgasflow)：1000l/hr；锥孔气流量(conegasflow)：150l/hr；碰撞气流量(collisiongasflow)：0.15ml/min。以上所述食品中四氢咔啉盐酸盐的检测方法，所述质谱条件如表2所示。

表2四氢咔啉盐酸盐检测质谱条件

注：*为定量离子对

以上所述食品中四氢咔啉盐酸盐的检测方法，为所述质谱定性方法为当试样中检出与该标准溶液色谱峰保留时间一致的色谱峰(变化范围在±2.5％之内)，并且试样色谱图中所选择的定性离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度一致，偏差不超过表3规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物，本发明实施例检测结果具体如图1所示。

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

本发明的检测方法中以标准工作溶液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，按照外标法以峰面积计算四氢咔啉盐酸盐的含量，空白试验应无干扰。

以上所述食品中四氢咔啉盐酸盐的检测方法，当称样量为1g，定容体积为50ml时，检出限为50μg/kg。由于hplc-ms/ms法具有特异性好和灵敏度高的特点，一直作为鉴定那非类物质的最重要判定依据。该方法的定性定量依赖于特征母离子、子离子及特征峰保留时间。因此，该方法可用于检测食品中四氢咔啉盐酸盐的含量，达到打击非法添加违法行为，确保人民群众食品、保健食品安全的目的。

特异性考察：选择具有代表性的基质：颗粒、牡蛎蛋白粉等食品以及软胶囊保健食品作为空白基质，按照本标准确定的前处理方法和检测方法进行分析，同时在3种空白基质中分别准确加入0.05ml0.25ml0.5ml三水平标准中间溶液，按照本标准确定的前处理方法操作，制得低、中、高三浓度水平：2ng/ml、5ng/ml10ng/ml的加标溶液，按本检测方法进行分析，考察各基质中存在的物质是否对被测组分存在干扰。结果显示，对于目标物质空白基质和溶剂基本无干扰，该方法特异性良好，三水平回收率在80％～105％，相对标准偏差rsd为0.5％～2.8％，准确度和精密度良好。