一种人血浆中花生四烯酸及其代谢产物检测方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种准确高效提取并检测人血浆中十五种花生四烯酸及其代谢产物的方法。

背景技术：

花生四烯酸是人体大脑和视神经发育的重要物质，对提高智力，改善记忆力和增强视敏度具有重要作用。花生四烯酸也具有降低胆固醇、增加血管弹性、抑制血小板聚集、降低血液粘度，调节血细胞功能等一系列生理活性。花生四烯酸有3条代谢通路：(1)环氧酶cox；(2)脂氧合酶lox；(3)细胞色素p450酶(cytochromep450，cyp)代谢途径,是合成前列腺素(prostaglandins)，血栓烷素(thromboxanes)和白细胞三烯(leukotrienes)等二十碳衍生物的直接前体，这些生物活性物质参与炎症反应和免疫系统的调控，调节血管张力和血小板的聚集，调控肿瘤细胞的生长，影响内分泌系统的激素合成和释放，并且对中枢神经系统的发育以及视网膜神经的发育发挥着十分重要的功能和作用，因此与动脉粥样硬化、高血压、过敏、关节炎等多种疾病有关。

然而，目前对这类物质存在着前处理制备方法成本较高、提取耗费时间较长且样品得率少导致检测困难等问题。因此如何开发一种低成本、快捷、能够提高目标产物的得率，提高质谱检测限、降低检测噪声的方法是现有技术有待解决的关键技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种人血浆中花生四烯酸及其代谢产物检测方法，其先向生物样品加入同位素花生四烯酸作为内标，再通过液-液萃取法提取样品混合物中的花生四烯酸，使用高效液相将样本中的花生四烯酸分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析，具有选择性好、灵敏度高、分析时间短和质谱信噪比低等优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种人血浆中花生四烯酸及其代谢产物检测方法，包括如下步骤：

步骤s1，用甲醇溶解同位素内标品花生四烯酸，并配制成混合内标工作液，再用甲醇水溶液溶解标准品花生四烯酸，并配制成标准品混合液；

步骤s2，用乙醇将步骤s1中获得的标准品混合液分梯度浓度稀释成多个浓度梯度的系列浓度标准品混合液，所述的浓度梯度大于三个；再分别向每梯度浓度标准品混合液中加入步骤s1中的混合内标工作液和含有1％fa的甲醇，冰浴超声波处理，低温离心后取上清进行液-液萃取，得萃取后的洗脱的滤液，备用；

步骤s3，取待检测样品，以步骤s2相同的操作方法向待检测样品中加入混合内标工作液和含有1％fa的甲醇，冰浴超声波处理，低温离心后取上清进行液-液萃取，得萃取后的滤液，备用；

步骤s4，将步骤s2和步骤s3中获得的萃取后的样品进行高效液相色谱-串联质谱分析，所述的高效液相色谱条件为4℃进样，柱温35℃，流速为400μl/min，进样量2μl；液相梯度如下:0-1min，b相维持在30％；1-7min，b相从30％线性变化至80％；7-9min，b相从80％线性变化至90％；9-11min，b相维持在90％；11-11.2min，b相从90％线性变化至30％；11.2-14min，b相维持在30％；

所述的质谱检测为多反应监测模式，离子源条件是，离子源温度(sourcetemperature):500℃；雾化气压(ionsourcegas1):50；辅助气压(ionsourcegas2)：50；气帘气(curtaingas)：30；喷雾电压(ionsaparyvoltagefloating)：-4500v。

根据以上方案，所述的步骤s1中的同位素内标品花生四烯酸包括血栓素b2-d4(thromboxaneb2-d4)、白三烯b4-d4(leukotrieneb4-d4)、白三烯d4-d5(leukotriened4-d5)、前列腺素f2α-4(prostaglandinf2α-4)、8-异前列腺素f2α-d4(8-iso-prostaglandinf2α-d4)、6-酮-前列腺素f1α-d4(6-keto-prostaglandinf1α-d4)、12羟二十烷四烯酸-d8(12s-hete-d8)、花生四烯酸-d8(arachidonicacid-d8)、前列腺素d2-d4(prostaglandind2-d4)、(9s,10e,12z)-9-羟基十八碳-10,12-二烯酸-d4(9s-hode-d4)、(9z,11e)-13-羟基-9,11-十八碳二烯酸-d4(13s-hode-d4)、15羟二十烷四烯酸-d8(15s-hete-d8)和二十二碳六烯酸-d5(docosahexaenoicacid-d5)，用甲醇溶解各成分混合，再加水稀释成各成分在混合液中的终浓度都是200ng/ml的混合内标工作液；所述的标准品花生四烯酸包括血栓素b2(thromboxaneb2)、白三烯b4(leukotrieneb4)、白三烯d4(leukotriened4)、前列腺素e2(prostaglandine2)、8-异前列腺素f2α(8-iso-prostaglandinf2α)、前列腺素f2α(prostaglandinf2α)、6-酮-前列腺素f1α(6-keto-prostaglandinf1α)、前列腺素d2(prostaglandind2)、(9s,10e,12z)-9-羟基十八碳-10,12-二烯酸(9s-hode)、(9z,11e)-13-羟基-9,11-十八碳二烯酸(13s-hode)、14,15-环氧二十碳四烯酸(14(15)-epete)、12羟二十烷四烯酸(12s-hete)、15羟二十烷四烯酸(15s-hete)、花生四烯酸(arachidonicacid)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid)，用50％甲醇水溶液溶解各成分混合，并配制成各成分在混合液中的终浓度都是1000ng/ml的标准品混合溶液。

根据以上方案，所的步骤s2和s3中的含有1％fa的甲醇中还含有抗氧化剂；所述的冰浴超声波处理为在冰浴中500w超声波处理30min；所述的低温离心为以14000g，4℃离心10min。

根据以上方案，所述的抗氧化剂为2,6-二叔丁基对甲酚，配制方法如下，称取2,6-二叔丁基对甲酚，按2.32mg/ml的比例加入甲醇溶解，再加入1/100甲醇体积的甲酸，混合均匀。

根据以上方案，所的步骤s2和s3中的液-液萃取具体为使用oasishlb固相萃取96孔板(96-wellplate)，分3次加入3ml甲醇活化孔板，每次加入1ml；再分3次加入3ml纯水平衡孔板，每次加入1ml；再将步骤s2或者s3中制备的上清液加入到孔板中；分2次加入2ml清洗液a(washingsolutiona)，每次加入1ml；分2次加入2ml清洗液b(washingsolutiona)，每次加入1ml；最后加入1ml甲醇洗脱样本，得洗脱的滤液。

根据以上方案，所述的清洗液a(washingsolutiona)是按体积比19：1＝水：抗氧化剂(2,6-二叔丁基对甲酚溶液)的比例混合而成；所述的清洗液b(washingsolutionb)是按体积比10000：1＝清洗液a：甲酸混合制成。

本发明的有益效果是：

1)通过液-液萃取对样品进行预处理，样品预处理简单而且快速。

2)对体液类样本只需要简单的液-液萃取就可以完成样本的预处理步骤，使用watersacquityuplci-class系统能够有效分离15种花生四烯酸，通过13种位素内标进行定量，能够准确检测人血浆中的重要花生四烯酸及其代谢产物，方法精密度和准确度较高，可用于临床多种样本的定量分析，而且实验操作简单、实验周期短，为临床上花生四烯酸水平的健康评估提供了一种可靠的检测方法，为科研提供了一种有效的研究手段。

附图说明

图1是实施例中的花生四烯酸及其代谢产物标准品xic图。

图2是实施例中的dha标准曲线结果图。

两幅附图均为仪器分析的结果显示图，仅为显示当次实验的结果，会根据每次实际实验的不同而发生变化，图中的文字不影响本专利方案的重复实施。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。

一种人血浆中花生四烯酸及其代谢产物检测方法，包括如下步骤：

步骤s1，配制混合内标工作液：用甲醇溶解同位素内标品花生四烯酸，包括血栓素b2-d4、白三烯b4-d4、白三烯d4-d5、前列腺素f2α-4、8-异前列腺素f2α-d4、6-酮-前列腺素f1α-d4、12羟二十烷四烯酸-d8、花生四烯酸-d8、前列腺素d2-d4、(9s,10e,12z)-9-羟基十八碳-10,12-二烯酸-d4、(9z,11e)-13-羟基-9,11-十八碳二烯酸-d4、15羟二十烷四烯酸-d8和二十二碳六烯酸-d5，再加水稀释成各成分在混合液中的终浓度都是200ng/ml的混合内标工作液；

配制标准品混合液：用50％甲醇水溶液溶解各种标准品花生四烯酸，包括花生四烯酸包括血栓素b2、白三烯b4、白三烯d4、前列腺素e2、8-异前列腺素f2α、前列腺素f2α、6-酮-前列腺素f1α、前列腺素d2、(9s,10e,12z)-9-羟基十八碳-10,12-二烯酸、(9z,11e)-13-羟基-9,11-十八碳二烯酸、14,15-环氧二十碳四烯酸、12羟二十烷四烯酸、15羟二十烷四烯酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸，按下表1的成分比例混合，制成各成分在混合液中的终浓度都是1000ng/ml的标准品混合溶液；

表1花生四烯酸15种标准品混合溶液配制成分浓度表。

步骤s2，用乙醇将步骤s1中获得的标准品混合液分梯度浓度稀释成10个浓度梯度的系列浓度标准品混合液，如下表2。

表2花生四烯酸标准品溶液梯度稀释表

再分别向每梯度浓度标准品混合液中加入20μl步骤s1中的混合内标工作液和500μl含有1％fa的甲醇，在冰浴中500w超声波处理30min，以14000g，4℃离心10min，取上清进行液-液萃取，具体液-液萃取步骤为使用oasishlb固相萃取96孔板，分3次加入3ml甲醇活化孔板，每次加入1ml；再分3次加入3ml纯水平衡孔板，每次加入1ml；再将步骤s2或者s3中制备的上清液加入到孔板中；分2次加入2ml清洗液a，每次加入1ml；分2次加入2ml清洗液b，每次加入1ml；最后加入1ml甲醇洗脱样本，得洗脱的滤液，将洗脱的滤液用氮气吹干，备用；

步骤s3，将血浆样品在4℃下解冻，取200μl样品，加入20μl步骤s1中的混合内标工作液和500μl含有1％fa的甲醇，在冰浴中500w超声波处理30min，以14000g，4℃离心10min，取上清进行液-液萃取，具体液-液萃取步骤为使用oasishlb固相萃取96孔板，分3次加入3ml甲醇活化孔板，每次加入1ml；再分3次加入3ml纯水平衡孔板，每次加入1ml；再将步骤s2或者s3中制备的上清液加入到孔板中；分2次加入2ml清洗液a，每次加入1ml；分2次加入2ml清洗液b，每次加入1ml；最后加入1ml甲醇洗脱样本，得洗脱的滤液，将洗脱的滤液用氮气吹干，备用；

步骤s4，将步骤s2和步骤s3中获得的样品用100ul乙腈：水：甲酸溶液(80：19：1，v/v/v)复溶，进行高效液相色谱-串联质谱分析，上样量4ul，采用watersacquityuplci-class系统进行色谱分离，4℃进样，柱温35℃，流速为400μl/min，进样量2μl；液相梯度如下:0-1min，b相维持在30％；1-7min，b相从30％线性变化至80％；7-9min，b相从80％线性变化至90％；9-11min，b相维持在90％；11-11.2min，b相从90％线性变化至30％；11.2-14min，b相维持在30％；

采用5500qtrap质谱仪(sciex)在负离子模式下进行质谱分析，采用多反应监测模式，离子源条件是，离子源温度:500℃；雾化气压:50；辅助气压：50；气帘气：30；喷雾电压：-4500v。

各离子对及其对应的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数如下表3。

表3质谱分析离子对的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数表。

作为优选实施例，步骤s2和s3中的含有1％fa的甲醇中还含有抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚溶液，配制方法如下，称取11.6mg的2,6-二叔丁基对甲酚，加入5ml甲醇溶解，再加入50μl的甲酸，混合均匀。

作为优选实施例，所述的清洗液a是量取38ml纯水，加入2ml的2,6-二叔丁基对甲酚混合而成；所述的清洗液b是量取20ml清洗液a，加入200μl甲酸混合制成。

对本实施例的检测结果作进一步的分析，以验证本发明专利提供的方法可行性：

采用同位素内标定量法，以花生四烯酸标准品浓度为x轴，花生四烯酸标准品峰面积与内标物峰面积比为y轴，建立标准曲线。根据该曲线计算血浆中花生四烯酸的浓度，结果如下：

15种花生四烯酸在各自浓度线性范围内呈良好的线性关系，满足定量要求，且能快速、方便、稳定和准确地定量检测血浆中的花生四烯酸。

以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。