本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种法维拉韦分子印迹糊电极传感器的制备方法，用于检测样品中的法维拉韦。
背景技术：
法维拉韦(又称“法匹拉韦”)，是一种新型rna依赖的rna聚合酶(rdrp)抑制剂，属于广谱抗流感病毒药物，用于治疗新型和复发型流感。研究表明，除流感病毒外，该药还对多种rna病毒展现出良好的抗病毒作用，如埃博拉病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、狂犬病毒等。据科技部2020年2月15日公布的消息，法匹拉韦是治疗新冠肺炎三个临床试验西药之一，对治疗新冠肺炎初步显示了较明显的疗效和较低的不良反应。法维拉韦有望成为covid-19肺炎抗病毒治疗的新选择。研究简单、快速、准确、高灵敏测定法维拉韦的方法对其药物的性能十分重要。目前，检测法维拉韦的方法主要有高效液相色谱，这些方法的准确度受到一定限制、而且仪器比较贵需要专业人员操作，检测周期长，也限制了其应用。另外，由于法维拉韦在生物样品中含量比较低、共存物质互相干扰，准确检测法维拉韦很困难。因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便用于的检测法维拉韦的方法具有重要使用价值。
分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注。依据此技术制备的分子印迹传感器，应用于药物分析、生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上。建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对药品、生物样品中的法维拉韦含量准确定量测定十分必要。
磷化镓的晶体结构为闪锌矿型，晶格常数5.447±0.06埃，化学键是以共价键为主的混合键，其离子键成分约为20%，300k时能隙为2.26ev，属于间接跃迁型半导体。磷化镓与其他宽带隙ⅲ-ⅴ族化合物半导体(如gaas、inp)相同，可通过引入深中心使费米能级接近带隙中部。石墨烯作为一类新型的超级电容器电极材料，石墨烯表现出以下众多的优势：超高的比表面积、良好的导电性能、优异的稳定的化学性能以及宽的电势窗口。单层石墨烯的容量可达21μf/cm2，但是很多情况下石墨烯都是多层叠加在一起，层与层之间的面积没有得到有效利用，其实际容量比单层石墨烯容量低，将石墨烯与其他纳米结构复合也抑制石墨烯片层的重叠。将高容量的过渡金属氮化物或导电聚合物与石墨烯进行叠层复合，一方面石墨烯被其他物质隔离开，能够减少团聚，增加电解液的流动性，另一方面，石墨烯为复合后的赝电容物质提供了电子传导的三维网络。基于石墨烯的复合材料表现出协同效应，在获得高容量的同时保持有良好的倍率性能。
碳量子点(carbonquantumdots,cqds)是最近发现的一类具有突出荧光性的新型碳纳米材料，由尺寸小于10nm的准离散球形碳纳米粒子组成，是一种兼具优异水溶性、高生物相容性和低毒性的环境友好材料。研究表明出诸多优势：cqds具有上转换光致发光特性，可激发半导体形成更多光生电子空穴对；③cqds具有较强的电子传输性能，可有效转移和存储光生电子，达到改善电荷分离效率的效果。因而将cqds与半导体复合，是改善导电性能的重要途径。
本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种法维拉韦分子印迹糊电极传感器的制备方法，主要是以四乙烯五胺和2-氨基吡咯为功能单体，三羟甲基丙烷三缩水甘油醚为交联剂，偶氮二异庚腈为引发剂，法维拉韦为模板，在磷化镓碳量子点糊电极表面通过修饰，提高了传感器的灵敏度，采用滴涂法构建法维拉韦分子印迹电化学传感器。
技术实现要素：
仪器与试剂
chi660b电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，ag/agcl为参比电极（sce），玻碳电极（gce）为工作电极；kq-250e型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
纳米磷化镓，氧化石墨烯，四乙烯五胺，2-氨基吡咯，三羟甲基丙烷三缩水甘油醚，偶氮二异庚腈，法维拉韦，碳量子点，1-乙基甲基醚-3-甲基咪唑磷酸盐，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，甘油，乙醇，n,n-二甲基甲酰胺，缓冲溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
一种法维拉韦分子印迹糊电极传感器的制备方法，特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）磷化镓/量子点糊电极的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米磷化镓：44~48%，氧化石墨烯：16~20%，1-乙基甲基醚-3-甲基咪唑磷酸盐：12~16%，碳量子点：4~6%，甘油：8~12%，乙醇：6~10%，各组分质量百分比之和为百分之百，研磨均匀，即得混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为φ5mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得磷化镓/量子点糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，乙醇：70~74%，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：26~30%，各组分质量百分比之和为百分之百，搅拌溶解，将抛光后的氮化镓糊电极放入，室温浸泡4h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极；
（3）法维拉韦分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，乙醇：66~72%，四乙烯五胺：8~12%，2-氨基吡咯：6~10%，法维拉韦：4~8%，三羟甲基丙烷三缩水甘油醚：4~8%，偶氮二异庚腈：1.0~3.0%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通氩气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应2~4h，固液分离，将得到的产物用加醇：醋酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得法维拉韦分子印迹聚合物；
（4）法维拉韦分子印迹糊电极传感器的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，n,n-二甲基甲酰胺：95~97%，乙烯树脂：1.0~3.0%，法维拉韦分子印迹聚合物：1.0~3.0%，各组分含量之和为百分之百，加热溶解，制得法维拉韦分子印迹聚合物修饰液；然后将上述溶液20~30μl滴加到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得法维拉韦分子印迹糊电极传感器。
在步骤（1）中所述的碳量子点为油溶性碳量子点。
在步骤（3）中所述的四乙烯五胺与2-氨基吡咯的摩尔为1：2。
在步骤（3）中所述的无氧氛围为聚合反应过程一直通入氩气。
本发明的优点及效果是：
本发明将印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，在碳量子点掺杂磷化镓糊电极成功地研制了一种法维拉韦分子印迹糊电极传感器，通过与未掺杂碳量子点的分子印迹电极的响应进行比较，本发明制备的法维拉韦分子印迹糊电极传感器的响应大大提高，选择性好，灵敏度高。该印迹传感器对法维拉韦表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与法维拉韦的浓度在2.0×10-8~8.0×10-6mol/l范围内呈良好的线性关系，检测限为8.32×10-8mol/l将本发明制备的一种法维拉韦分子印迹糊电极传感器成功用于样品中法维拉韦的检测中，回收率在95.12~104.56%之间，因此本发明制备的一种法维拉韦分子印迹糊电极传感器可广泛应用于药品、生物、环保检测等相关领域。
本发明制备一种法维拉韦分子印迹糊电极传感器在制备的过程中不使用有毒的试剂，环保绿色，制备工艺简单。
具体实施方式
实施例1
（1）磷化镓/量子点糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米磷化镓：46g，氧化石墨烯：18g，1-乙基甲基醚-3-甲基咪唑磷酸盐：14g，碳量子点：5g，甘油：10g，乙醇：9ml，研磨均匀，即得混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为φ5mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得磷化镓/量子点糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极制备：在反应器中，分别加入，乙醇：91ml，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：28g，搅拌溶解，将抛光后的氮化镓糊电极放入，室温浸泡4h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极；
（3）法维拉韦分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：86ml，四乙烯五胺：10g，2-氨基吡咯：8g，法维拉韦：6g，三羟甲基丙烷三缩水甘油醚：6g，偶氮二异庚腈：2g，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应2~4h，固液分离，将得到的产物用加醇：醋酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得法维拉韦分子印迹聚合物；
（4）法维拉韦分子印迹糊电极传感器的制备：在反应器中，分别加入，n,n-二甲基甲酰胺：10ml，乙烯树脂：0.1g，法维拉韦分子印迹聚合物：0.3g，加热溶解，制得法维拉韦分子印迹聚合物修饰液；然后将上述溶液25μl滴加到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得法维拉韦分子印迹糊电极传感器。
实施例2
（1）磷化镓/量子点糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米磷化镓：22g，氧化石墨烯：10g，1-乙基甲基醚-3-甲基咪唑磷酸盐：8g，碳量子点：2g，甘油：4g，乙醇：5ml，研磨均匀，即得混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为φ5mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得磷化镓/量子点糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极制备：在反应器中，分别加入，乙醇：47ml，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：13g，搅拌溶解，将抛光后的氮化镓糊电极放入，室温浸泡4h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极；
（3）法维拉韦分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：44ml，四乙烯五胺：6g，2-氨基吡咯：5g，法维拉韦：2g，三羟甲基丙烷三缩水甘油醚：2g，偶氮二异庚腈：0.5g，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应2~4h，固液分离，将得到的产物用加醇：醋酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得法维拉韦分子印迹聚合物；
（4）法维拉韦分子印迹糊电极传感器的制备：在反应器中，分别加入，n,n-二甲基甲酰胺：11ml，乙烯树脂：0.1g，法维拉韦分子印迹聚合物：0.2g，加热溶解，制得法维拉韦分子印迹聚合物修饰液；然后将上述溶液30μl滴加到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得法维拉韦分子印迹糊电极传感器。
实施例3
（1）磷化镓/量子点糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米磷化镓：48g，氧化石墨烯：16g，1-乙基甲基醚-3-甲基咪唑磷酸盐：12g，碳量子点：6g，甘油：12g，乙醇：8ml，研磨均匀，即得混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为φ5mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得磷化镓/量子点糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极制备：在反应器中，分别加入，乙醇：88ml，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：30g，搅拌溶解，将抛光后的氮化镓糊电极放入，室温浸泡4h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极；
（3）法维拉韦分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：45ml，四乙烯五胺：4g，2-氨基吡咯：3g，法维拉韦：4g，三羟甲基丙烷三缩水甘油醚：5g，偶氮二异庚腈：0.8g，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应2~4h，固液分离，将得到的产物用加醇：醋酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得法维拉韦分子印迹聚合物；
（4）法维拉韦分子印迹糊电极传感器的制备：在反应器中，分别加入，n,n-二甲基甲酰胺：10ml，乙烯树脂：0.3g，法维拉韦分子印迹聚合物：0.2g，加热溶解，制得法维拉韦分子印迹聚合物修饰液；然后将上述溶液20μl滴加到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得法维拉韦分子印迹糊电极传感器。
实施例4
（1）磷化镓/量子点糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米磷化镓：23g，氧化石墨烯：9g，1-乙基甲基醚-3-甲基咪唑磷酸盐：6g，碳量子点：2g，甘油：6g，乙醇：7ml，研磨均匀，即得混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为φ5mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得磷化镓/量子点糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极制备：在反应器中，分别加入，乙醇：91ml，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：28g，搅拌溶解，将抛光后的氮化镓糊电极放入，室温浸泡4h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极；
（3）法维拉韦分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：42ml，四乙烯五胺：6g，2-氨基吡咯：4g，法维拉韦：3g，三羟甲基丙烷三缩水甘油醚：4g，偶氮二异庚腈：2g，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应2~4h，固液分离，将得到的产物用加醇：醋酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得法维拉韦分子印迹聚合物；
（4）法维拉韦分子印迹糊电极传感器的制备：在反应器中，分别加入，n,n-二甲基甲酰胺：10ml，乙烯树脂：0.2g，法维拉韦分子印迹聚合物：0.1g，加热溶解，制得法维拉韦分子印迹聚合物修饰液；然后将上述溶液28μl滴加到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰磷化镓/量子点糊电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得法维拉韦分子印迹糊电极传感器。
实施例5
将上述实施例1~4所制备的法维拉韦分子印迹糊电极传感器，用于法维拉韦的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的法维拉韦标准溶液，底液为ph7.0的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作曲线绘制：将ag/agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的法维拉韦分子印迹糊电极传感器为工作电极组成三电极系统，连接chi660b电化学工作站，在k3[fe(cn)6]溶液中，采用循环伏安法在-1.0~1.2v电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为i0，含有不同浓度的法维拉韦标准溶液的响应电流即为ii，响应电流降低的差值为△i=i0-ii，△i与法维拉韦标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△i~c工作曲线；
（3）法维拉韦的检测：用待测样品代替步骤（1）中的法维拉韦标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△i和工作曲线，得到待测样品中法维拉韦的含量；
所述k3[fe(cn)6]溶液的浓度为4.0mmol/l；
所述ph7.0的磷酸盐缓冲溶液的浓度在0.05mol/l。