一种控制美洲大蠊乙醇提取物质量的方法与流程

1.本发明涉及康复新液/美洲大蠊乙醇提取物质量控制方法，具体的说是涉及应用lc/ms总离子色谱图控制康复新液/美洲大蠊乙醇提取物质量的方法。


背景技术：

2.康复新液收载于中华人民共和国卫生部药品标准中成药第十九册及ws3-b-3674-200(z)。康复新液为美洲大蠊乙醇提取物制成的单方溶液制剂，具有抗炎、抗消化性溃疡、抗肿瘤、调节免疫、抗氧化等多种药理活性。临床上康复新液应用广泛，外用于金疮、外伤、溃疡、瘘管、烧伤、烫伤、褥疮之创面等；内服可用于治疗胃溃疡、胃痛出血及十二指肠溃疡，以及阴虚肺痨，肺结核的辅助治疗。
3.目前，康复新液/美洲大蠊乙醇提取物的质量评价多以总氨基酸的测定、氨基酸和尿嘧啶的鉴别为主，以上方法均无法较好的对康复新液/美洲大蠊乙醇提取物质量进行控制。另外，有专利(中国专利：200810116771.1；201610688619.5；201711432276.7)利用hplc技术对康复新液/美洲大蠊乙醇提取物中的某几种化学成分指纹图谱的质量测定方法进行了相关研究。虽然hplc由于其仪器自动化、普及化程度高，已成为最常用的仪器之一；同时由于hplc仪器绝大多数与uv或dad检测器相联结，只能对单个及少数几种化学成分色谱峰提供保留时间及之外图谱等信号，而无法对样品多种未知成分物质和样品整体情况提供相关信息。液质联用(lc/ms)是指液相色谱与质谱串联起来，将hplc的高分辨效能与ms的强大结构测定功能组合起来，在相应的时间内能对样品内绝大部分物质成分的离子强度进行整体地体现，从而在一定程度上对样品整体质量进行检测，达到控制质量的目的。该技术方法是中药学成分分析、品种鉴别及质量标准研究等方面一个非常重要的技术。
4.因此，有必要利用lc/ms分析技术方法，研究开发出一种快速简便能够全面控制康复新液/美洲大蠊乙醇提取物总体质量的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对康复新液/美洲大蠊乙醇提取物质量控制的不足，提供一种应用lc/ms总离子色谱图控制美洲大蠊乙醇提取物质量的方法。
6.本发明提供了一种控制美洲大蠊乙醇提取物质量的方法，其特征在于，包括如下步骤:
7.(1)样品的预处理：准备同一生产工艺不同批次的美洲大蠊乙醇提取物样品；加入dtt溶液使其终浓度为10mmol/l，于37℃水浴中还原4h，加入iaa溶液使其终浓度为50mmol/l，避光反应40min，用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥发溶剂；
8.(2)样品总离子流色谱图的采集：将上述预处理样品进行lc/ms分析测定，经过样品重复性测试，确定在该工艺条件下样品特征总离子流色谱图；
9.(3)研究确定图谱相似度及结果判定：根据步骤(3)获得的总离子流色谱图，利用matlab中的matrix laboratory数据分析软件进行相似性关系计算评价方法，首先用欧拉
距离计算各个样品之间的差异度，再用模糊相关性分析计算样品之间的相似性数值，分析相同生产工艺条件下不同批次样品间的相似度；根据研究结果确定美洲大蠊乙醇提取物质量的最低合格限值，计算值低于最低合格限值的为质量不合格样品。
10.进一步的，所述的lc/ms中：
11.毛细管液相色谱条件为：预柱：300μm i.d.
×
5mm，acclaim pepmap rplc c18填充，5μm，分析柱：150μm i.d.
×
150mm，acclaim pepmap rplc c18填充，1.9μm，流动相a：0.1％甲酸，2％acn；流动相b：0.1％甲酸，80％acn；采用梯度洗脱：0-5min，4％b-10％b；5min-85min，10％b-22％b；85min-110min，22％b-40％b；110min-115min，40b％-95％b；115min-120min，95％b-95％b；分析时间：120min。
12.质谱条件：一级质谱参数：resolution：70000；agctarget：3e6；maximumit：40ms；scanrange：300-1400m/z；二级质谱参数：resolution：75000；agctarget：1e5；maximumit：60ms；topn：20；nce/steppednce：27。
13.进一步的，步骤(4)所述的美洲大蠊乙醇提取物质量的最低合格限值不小于80％。
14.进一步的，所述的美洲大蠊乙醇提取物为康复新液。
15.本发明的有益效果：
16.1.本发明通过lc/ms技术，测样品与同一生产工艺条件下多个批次的美洲大蠊乙醇提取物样品特征总离子流色谱图的相似度，能对样品中绝大部分物质成分的离子强度进行整体地体现，从而对样品整体质量进行检测，达到全面控制康复新液/美洲大蠊乙醇提取物质量的目的，从而控制康复新液的临床用药安全。
附图说明
17.图1为同一生产工艺下10个批次中1个样品的美洲大蠊乙醇提取物样品总离子色谱图；
18.图2为同一生产工艺下1个批次的美洲大蠊乙醇提取物样品经过酶切处理后的总离子色谱图。
具体实施方式
19.实施例1
20.(1)样品准备：同一生产工艺下10个批次美洲大蠊乙醇提取物样品：b190217、b190218、b190220、b190302、b190307、b190309、b190310、b190311、b190522、b190524，来自四川好医生攀西药业有限责任公司。
21.(2)样品前处理：样品还原烷基化及脱盐处理：于样品中加入dtt溶液使其终浓度为10mmol/l，于37℃水浴中还原4h；加入iaa溶液使其终浓度为50mmol/l，避光反应40min；使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥发溶剂。
22.(3)样品总离子流色谱图的采集：对同一生产工艺下经过预处理后的10个批次美洲大蠊乙醇提取物逐一进行毛细管液相色谱-质谱联用仪(lc-ms)进行分析测定，并对每个样品总离子色谱图相关信息(相对峰形、峰数目、峰高、峰面积、保留时间等技术参数)以确定在该工艺条件下每个美洲大蠊乙醇提取物样品总离子色谱图以及在该生产工艺条件下10个批次的美洲大蠊乙醇提取物样品平均总离子色谱图，如图1所示。
23.毛细管液相色谱分析：色谱条件为：预柱：300μm i.d.
×
5mm，acclaim pepmap rplc c18，5μm，分析柱：150μm i.d.
×
150mm，acclaim pepmap rplc c18，1.9μm，流动相a：0.1％甲酸，2％acn；流动相b：0.1％甲酸，80％acn；流速：600nl/min；每个组分分析时间：120min，见表1。
24.表1.毛细管液相色谱分析时间
[0025][0026][0027]
质谱分析：质谱条件为：一级质谱参数：resolution：70000；agctarget：3e6；maximumit：40ms；scanrange：300to-1400m/z。二级质谱参数：resolution：75000；agctarget：1e5；maximumit：60ms；topn：20；nce/steppednce：27。
[0028]
(4)研究确定总离子色谱图最低相似性数值：根据步骤(3)获得同一生产工艺下10个不同批次的美洲大蠊乙醇提取物样品的总离子色谱图，利用matlab(matrix laboratory)数据分析软件进行相似性关系计算评价方法(首先用欧拉距离计算各个样品之间的差异度，再用模糊相关性分析计算样品之间的相似性数值)分析得出这10个不同批次样品之间的最低相似度为85.85％，最高相似度为89.38％；各批次样品与该工艺条件下10个批次样品的平均图谱的最低相似度为86.34％。由于液质联用(lc/ms)是在相应的时间内对样品中绝大部分成分离子强度进行分析，与hplc只对几个相应的化学成分进行分析不同。因此，通过不同批次的样品之间通过液质联用(lc/ms)的总离子色谱图相似度要比hplc分析色谱图的相似度要低。
[0029]
根据研究结果可确定在美洲大蠊乙醇提取物的最低相似度为80％。因此，根据该最低合格限值就可以控制美洲大蠊乙醇提取物的质量。
[0030]
实施例2
[0031]
(1)样品准备：以实施例1中10个批次美洲大蠊乙醇提取物为试验样品，进行酶切处理，得到相应的10个批次美洲大蠊乙醇提取物酶切后试验样品，来自好医生药业集团有限公司中药研究所。
[0032]
(2)样品前处理：样品进行还原烷基化及脱盐处理同实施例1步骤(2)。
[0033]
(3)样品总离子流色谱图的采集：同实施例1，其中一个样品总离子色谱图如图2所示。
[0034]
毛细管液相色谱分析和质谱分析条件同实施例1步骤(3)。
[0035]
(4)结果判定：利用matlab(matrix laboratory)数据分析软件进行相似性关系计算评价方法(首先用欧拉距离计算各个样品之间的差异度，再用模糊相关性分析计算样品之间的相似性数值)，对本次10个批次美洲大蠊乙醇提取物酶切后样品和实施例1中10个批次的美洲大蠊乙醇提取物样品的平均总离子流色谱图进行相似度评价。结果：本次10个样
品的总离子色谱图与10个批次的美洲大蠊乙醇提取物样品的平均总离子流色谱图最低相似度为51.77％，最高相似度为68.22％，远远小于设定的80％的阈值。因此，可判定测定样品为质量不合格样品。
[0036]
最后，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。