本发明属于蛋白染料技术领域，具体涉及一种蛋白胶快速染色试剂。
背景技术：
蛋白质组学是指以基因组编码的所有蛋白质为研究对象，从细胞水平及整体水平上研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入认识有机体的各种生理和病理，与传统蛋白质研究比较，蛋白质组学研究体现了全面性、整体性、高通量、大规模的特点，蛋白质组学的研究对于已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析具有无法替代的重要作用，更重要的是蛋白质组分析无需依赖基因组研究，利用蛋白质研究有望从蛋白质的表达规律中找到序列分析难以处理的没有任何同源序列的“孤儿”基因的生物功能线索，进而揭示出它在整个功能网络的地位，蛋白质组学技术较为复杂，包括蛋白质分离、鉴定和信息分析三方面的内容，其中，凝胶电泳是与分离和鉴定相对应的核心技术之一。
蛋白质染色是蛋白质在完成凝胶电泳后的重要步骤，目前国内常用的蛋白质染色试剂分为以考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色，考马斯亮蓝染色法具有成本低、质谱兼容性好等特点，传统的蛋白质染色剂对蛋白质进行染色是需要进行清洗，固定，脱色,整个过程持续下来需要1-2小时，有时甚至需要过夜处理，大大降低了蛋白质的染色效率，并且在染色过程中需要用甲醇等有毒试剂，就需要使用通风橱或溶剂处理来进行蛋白质染色，进而增加了蛋白质染色成本，传统的蛋白质染色在对染色后的蛋白质灵敏度较低，且残留有大量的甲基化，进而影响蛋白质的质谱检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蛋白胶快速染色试剂。
本发明要解决的技术问题：
传统的蛋白质染色剂对蛋白质进行染色是需要进行清洗，固定，脱色,整个过程持续下来需要1-2小时，有时甚至需要过夜处理，大大降低了蛋白质的染色效率，并且在染色过程中需要用甲醇等有毒试剂，就需要使用通风橱或溶剂处理来进行蛋白质染色，进而增加了蛋白质染色成本，传统的蛋白质染色在对染色后的蛋白质灵敏度较低，且残留有大量的甲基化，进而影响蛋白质的质谱检测。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种蛋白胶快速染色试剂，由如下步骤制备：
步骤s1：称取如下重量份原料：第一染色剂0.5-1份、第二染色剂0.5-1份、乙酸10-20份、乙醇10-15份、蒸馏水3-5份；
步骤s2：将第一染色剂和乙醇加入搅拌釜中，在转速为1000-1500r/min的条件下，进行搅拌5-15min，制得第一染液；
步骤s3：将第二染色剂和乙酸加入搅拌釜中，在转速为1000-1500r/min的条件下，进行搅拌5-15min，制得第二染液；
步骤43：将步骤s2制得的第一染液、步骤s3制得的第二染液、蒸馏水加入搅拌釜中，在转速为1000-1500r/min的条件下，进行搅拌3-5min，制得蛋白胶快速染色试剂产品。
进一步，所述的第一染色剂由如下步骤制成：
步骤a1：将四乙基米氏酮和乙醇加入反应釜中，在温度为30-35℃，转速为800-1000r/min的条件下，进行搅拌5-10min，至四乙基米氏酮完全溶解后，加入液态一氯甲烷和无水三氯化铝，在温度为30-35℃的条件下，进行反应30-50min，制得中间体e1；
反应过程如下：
步骤a2：将步骤a1制得的中间体e1和乙醇加入反应釜中，在温度为30-35℃，转速为800-1000r/min的条件下，进行搅拌5-10min，至中间体e1完全溶解后，加入液溴，在光照条件下，进行反应15-30min，制得中间体e2；
反应过程如下：
步骤a3：将碳酸钾和去离子水加入反应釜中在温度为30-35℃，转速为800-1000r/min的条件下，进行搅拌5-10min，至碳酸钾全溶解后，加入四乙基溴化铵、中间体e2、乙醇，在转速300-500r/min的条件下，进行搅拌5-10min，至中间体e2完全溶解，升温至温度达到120-150℃，进行回流反应1.5-2h，制得中间体e3；
反应过程如下：
步骤a4：将n,n-二乙基苯胺加入反应釜中，在转速为300-500r/min的条件下,进行搅拌并加入中间体e3和三氯氧磷加入反应釜中，在温度为95-100℃的条件下，进行反应3-4h后加入氢氧化钠溶液，进行搅拌1-1.5h后，加入盐酸溶液，在温度为90-95℃的条件下，保温2-3h制得第一染色剂。
反应过程如下：
进一步，步骤a1所述的四乙基米氏酮、液态一氯甲烷、无水三氯化铝的用量质量比为1：1：0.3，步骤a2所述的中间体e1和液溴的用量质量比为3：1，步骤a3所述的碳酸钾、四乙基溴化铵、中间体e2的用量比为10g：3ml：15g,步骤a4所述的n,n-二乙基苯胺、中间体e3、三氯氧磷、氢氧化钠溶液、盐酸溶液的用量质量比为2.3：1.5：1：7：0.8，氢氧化钠溶液的质量分数为30-35％，盐酸溶液的质量分数为30-35％。
进一步，所述的第二染色剂由如下步骤制成：
步骤b1：将对氨基苯磺酸和氢氧化钠水溶液，加入反应釜中，在转速为800-1000r/min的条件下，进行搅拌5-10min，至对氨基苯磺酸完全溶解后加入加入液态一氯甲烷和无水三氯化铝，在温度为40-50℃的条件下，进行反应1-1.5h，制得中间体f1；
反应过程如下：
步骤b2：将步骤b1制得的中间体f1和氢氧化钠水溶液，加入反应釜中，在转速为800-1000r/min的条件下，进行搅拌5-10min，至中间体f1完全溶解后通入氯气，至氯气充满反应釜，在光照条件下，进行反应50-60min后，加入碳酸钠，在温度为70-80℃的条件下，进行反应6-8h，制得中间体f2；
反应过程如下：
步骤b3：将步骤b2制得的中间体f2和氢氧化钠水溶液加入反应釜中，在转速为800-1000r/min的条件下，进行搅拌5-10min，至中间体f1完全溶解后，加入硝酸钠，混合均匀后加入浓盐酸，在冰水域的条件下，保温15-20min后，加入n,n-二甲基苯胺和冰醋酸，在转速为300-500r/min的条件下，进行搅拌10-15min，加入体积分数10％的氢氧化钠溶液，进行加热至反应液沸腾，进行反应30-50min，制得第二染色剂。
反应过程如下：
进一步，步骤b1所述的对氨基苯磺酸、液态一氯甲烷、无水三氯化铝的质量比为2：1：0.3，步骤b2所述的中间体f1和碳酸钠的用量质量比为100:0.05，步骤b3所述的中间体f2、硝酸钠、浓盐酸、n,n-二甲基苯胺、冰醋酸、体积分数10％的氢氧化钠溶液的用量比为10g：4g：13ml：5ml：5ml：70ml,步骤b1、步骤b2、步骤b3所述的氢氧化钠水溶液的质量分数为15-20％。
进一步，一种蛋白胶快速染色试剂的使用方法包括如下步骤：
将电泳后的蛋白质凝胶放入烧杯中加入染色试剂，至染色试剂能够充分覆盖凝胶，将烧杯置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动1-2min后蛋白质条带开始显色，继续摇动3-5分钟蛋白质条带条带颜色加深，取出蛋白质凝胶用蒸馏水冲洗30-60s，完成蛋白质染色。
本发明的有益效果：本发明在制备一种蛋白胶快速染色试剂的过程中制备了一种第一染色剂和第二染色剂，该第一染色剂分子为阳离子染色剂，能够与蛋白质链上带负电荷的羧基相结合进而达到染色效果，且该染色剂上含有大量的醇羟基，能够使细胞内的蛋白质转变不溶性物质，以保持生前的形态，在对蛋白胶进行染色时，不需要加入甲醇对蛋白进行固定，第二染色剂分子为为阴离子染色剂，在二染色剂和第一染色剂共同使用的条件下，染料以阴阳离子的形式存在，使得离子染料和游离染料之间形成动态平衡，进而提高了游离染料分子和蛋白质的结合效率，进而提升了蛋白质的染色速率,且第二染色剂分子上含有两个醛基，在对蛋白质进行染色时，醛基与蛋白质上的氨基、巯基、羟基形成共价键，提高了蛋白质染色效果，加速了蛋白质染色速度，两种染色剂的混合使用提升了蛋白质的质谱兼容性和染液灵敏度，该染色剂未添加任何有毒试剂，不需使用通风橱或溶剂处理对蛋白质进行染色，进而降低了蛋白质染色的成本，同时保护了操作人员身体健康不受到伤害，染色步骤简单，蛋白质染色过程不超过10min，大大缩短了蛋白质染色时间。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种蛋白胶快速染色试剂，由如下步骤制备：
步骤s1：称取如下重量份原料：第一染色剂0.5份、第二染色剂0.5份、乙酸10份、乙醇10份、蒸馏水3份；
步骤s2：将第一染色剂和乙醇加入搅拌釜中，在转速为1000r/min的条件下，进行搅拌5-15min，制得第一染液；
步骤s3：将第二染色剂和乙酸加入搅拌釜中，在转速为1000-1500r/min的条件下，进行搅拌5min，制得第二染液；
步骤43：将步骤s2制得的第一染液、步骤s3制得的第二染液、蒸馏水加入搅拌釜中，在转速为1000r/min的条件下，进行搅拌3min，制得蛋白胶快速染色试剂产品。
所述的第一染色剂由如下步骤制成：
步骤a1：将四乙基米氏酮和乙醇加入反应釜中，在温度为30℃，转速为800r/min的条件下，进行搅拌5min，至四乙基米氏酮完全溶解后，加入液态一氯甲烷和无水三氯化铝，在温度为30℃的条件下，进行反应30min，制得中间体e1；
步骤a2：将步骤a1制得的中间体e1和乙醇加入反应釜中，在温度为30℃，转速为800r/min的条件下，进行搅拌5min，至中间体e1完全溶解后，加入液溴，在光照条件下，进行反应15min，制得中间体e2
步骤a3：将碳酸钾和去离子水加入反应釜中在温度为30℃，转速为800r/min的条件下，进行搅拌10min，至碳酸钾全溶解后，加入四乙基溴化铵、中间体e2、乙醇，在转速300r/min的条件下，进行搅拌10min，至中间体e2完全溶解，升温至温度达到120℃，进行回流反应2h，制得中间体e3；
步骤a4：将n,n-二乙基苯胺加入反应釜中，在转速为300r/min的条件下,进行搅拌并加入中间体e3和三氯氧磷加入反应釜中，在温度为95℃的条件下，进行反应3-4h后加入氢氧化钠溶液，进行搅拌1h后，加入盐酸溶液，在温度为90℃的条件下，保温2h制得第一染色剂。
所述的第二染色剂由如下步骤制成：
步骤b1：将对氨基苯磺酸和氢氧化钠水溶液，加入反应釜中，在转速为800r/min的条件下，进行搅拌5min，至对氨基苯磺酸完全溶解后加入加入液态一氯甲烷和无水三氯化铝，在温度为40℃的条件下，进行反应1h，制得中间体f1；
步骤b2：将步骤b1制得的中间体f1和氢氧化钠水溶液，加入反应釜中，在转速为800r/min的条件下，进行搅拌10min，至中间体f1完全溶解后通入氯气，至氯气充满反应釜，在光照条件下，进行反应50min后，加入碳酸钠，在温度为70℃的条件下，进行反应6h，制得中间体f2；
步骤b3：将步骤b2制得的中间体f2和氢氧化钠水溶液加入反应釜中，在转速为800r/min的条件下，进行搅拌10min，至中间体f1完全溶解后，加入硝酸钠，混合均匀后加入浓盐酸，在冰水域的条件下，保温20min后，加入n,n-二甲基苯胺和冰醋酸，在转速为500r/min的条件下，进行搅拌10min，加入体积分数10％的氢氧化钠溶液，进行加热至反应液沸腾，进行反应30min，制得第二染色剂。
实施例2
一种蛋白胶快速染色试剂，由如下步骤制备：
步骤s1：称取如下重量份原料：第一染色剂0.8份、第二染色剂0.8份、乙酸15份、乙醇13份、蒸馏水4份；
步骤s2：将第一染色剂和乙醇加入搅拌釜中，在转速为1300r/min的条件下，进行搅拌10min，制得第一染液；
步骤s3：将第二染色剂和乙酸加入搅拌釜中，在转速为1300r/min的条件下，进行搅拌10min，制得第二染液；
步骤43：将步骤s2制得的第一染液、步骤s3制得的第二染液、蒸馏水加入搅拌釜中，在转速为1300r/min的条件下，进行搅拌4min，制得蛋白胶快速染色试剂产品。
实施例3
一种蛋白胶快速染色试剂，由如下步骤制备：
步骤s1：称取如下重量份原料：第一染色剂1份、第二染色剂1份、乙酸20份、乙醇15份、蒸馏水5份；
步骤s2：将第一染色剂和乙醇加入搅拌釜中，在转速为1500r/min的条件下，进行搅拌15min，制得第一染液；
步骤s3：将第二染色剂和乙酸加入搅拌釜中，在转速为1500r/min的条件下，进行搅拌15min，制得第二染液；
步骤43：将步骤s2制得的第一染液、步骤s3制得的第二染液、蒸馏水加入搅拌釜中，在转速为1500r/min的条件下，进行搅拌5min，制得蛋白胶快速染色试剂产品。
对比例1
本对比例为传统的考马斯亮蓝染色剂。
对比例2
本对比例为质量分数为0.1％的硝酸银溶液。
对比例3
本对比例为钼酸铵染料。
对比例4
本对比例为尼罗红染料。
对实施例1-3和对比例1-4制备的染料对蛋白质进行染色；
实施例1-3蛋白质染色的步骤如下：
将电泳后的蛋白质凝胶放入烧杯中加入染色试剂，至染色试剂能够充分覆盖凝胶，将烧杯置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动1-2min后蛋白质条带开始显色，继续摇动3-5分钟蛋白质条带条带颜色加深，取出蛋白质凝胶用蒸馏水冲洗30-60s，完成蛋白质染色。
对比例1蛋白质染色步骤如下：
将电泳后的蛋白质凝胶浸泡在固定液中(500ml甲醇、100ml冰醋酸、400ml蒸馏水)中30min，将固定后的蛋白质凝胶放入烧杯中加入考马斯亮蓝染色剂，至考马斯亮蓝染色剂能够充分覆盖凝胶，将烧杯置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时，倒出考马斯亮蓝染色剂并加入考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液能够充分覆盖凝胶，将烧杯置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，直至凝胶背景颜色脱尽，完成蛋白质的染色。
对比例2蛋白质染色步骤如下：
将电泳后的蛋白质凝胶浸泡在固定液中(500ml乙醇、100ml冰醋酸、400ml蒸馏水)中30min，将固定后的蛋白质凝胶用去离子水进行浸泡3次每次10min后，将蛋白质凝胶浸泡在致敏剂(75ml乙醇、17g乙酸钠、0.5g硫代硫酸钠加入去离子水到体积250ml)中30min，将致敏后的蛋白质凝胶用去离子水进行浸泡3次每次10min后，将蛋白质凝胶浸泡在0.1％的硝酸银溶液中30min后，用去离子水冲洗蛋白质凝胶3次每次20s，将蛋白质凝胶浸泡在显色液(6.25g碳酸钠和50μl体积分数为37％甲醇溶液加入去离子水到体积250ml)中15min后，将蛋白质凝胶取出浸泡在终止液(3.65gedta钠盐加入去离子水至体积250ml)中10min，完成蛋白质的染色。
对比例3蛋白质染色步骤如下：
将电泳后的蛋白质凝胶浸泡在固定液中(500ml乙醇、100ml冰醋酸、400ml蒸馏水)中30min，将固定后的蛋白质凝胶浸用去离子水进行洗涤2次每次5min后，将蛋白质凝胶浸泡在平衡液(体积分数50％的甲醇水溶液)中10min，蛋白质凝胶浸泡在钼酸铵染料15min后，用去离子水进行清洗3min，完成蛋白质染色。
对比例4蛋白质染色步骤如下：
将电泳后的蛋白质凝胶浸泡在固定液中(500ml乙醇、100ml冰醋酸、400ml蒸馏水)中30min，将固定后的蛋白质凝胶浸用去离子水进行洗涤2次每次5min后，将蛋白质凝胶浸泡在尼罗红染料中将烧杯置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动5min后，将蛋白质凝胶用蒸馏水冲洗30s，在紫外透视仪下显色。
由上述实施例1-3和对比例1-4制备的染色试剂进行蛋白质染色的步骤可知，实施例1-3制备的染色试剂的染色方法最为简单，蛋白质染色过程不超过10min，大大缩短了蛋白质染色时间，增加了蛋白质染色效率，且不需要甲醇等有毒试剂进行固定，进而使得蛋白质染色不需使用通风橱或溶剂处理对蛋白质进行染色，进而降低了蛋白质染色的成本，同时保护了操作人员身体健康不受到伤害。
对上述实施例1-3和对比例1-4制备的染色试剂，染色的蛋白质进行检测比较，比较结果如下表1；
表1
由上表1可知实施例1-3制备的染色试剂染色时间只需要8min，远远小于对比例1-4制备的染色试剂，实施例2-3制得染色试剂染色灵敏度虽然高于实施例1-3制备的染色试剂，但在蛋白质染色过程中存在残留甲基化，进而影响样品的质谱检测。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。