![制备检测IGFBP4/SHBG双指标免疫层析试剂盒的制作方法](http://img.xjishu.com/img/zl/2021/10/19/bghn50ypg.jpg)
制备检测igfbp4/shbg双指标免疫层析试剂盒
技术领域
1.本发明属于免疫学领域,具体涉及制备出igfbp4抗体-荧光微球和shbg抗体-荧光微球,建立检测 igfbp4/shbg免疫层析试剂盒过程。
背景技术:2.异常胎盘发育与妊娠相关疾病的发生密切相关,包括先兆子痫(preeclampsia,pe),妊娠糖尿病 (gestational diabetes mellitus,gdm),宫内生长受限(intrauterine growth restriction,iugr) 及胎儿早产(preterm birth,ptb)等。研究发现,绒毛外滋养细胞病理性侵入到母体蜕膜及子宫螺旋动脉构建缺陷,导致胎盘功能不全。胎盘组织表达胰岛素类生长因子(insulin-like growth factors,igfs), igfs对胎盘的正常发育起着重要作用,igfs可增进表浅绒毛外滋养细胞侵润,运送营养成分,促进胎儿生长发育。igfs生物活性学受到胰岛素样生长因子结合蛋白(igf-binding proteins,igfbps)的调控,胎盘中主要表达igfbp1和igfbp4。胎盘中妊娠相关蛋白a(pregnancy associated plasma protein a, papp-a)是igfbp4的蛋白水解酶,降解igfbp4而释放出生物活性igfs。igfbp4是6种igfbp1-6之一, igfbps具有高度保守结构,包括n-端富含半胱氨酸区域、高度变异链接区和c-端gcgccxxc。igfbp4高亲和力结合igfs,延长igfs半衰期,改变igfs与细胞表面受体的相互作用,并影响igfs功能。孕早期血循环中igfbp4水平升高的孕妇,其后pf,iugr及ptb的发病率明显增高,血液中igfbp4水平升高与妊娠相关疾病发生密切相关。
3.妊娠糖尿病(gdm)是一种常见的妊娠并发症,与增加产后妇女糖尿病发病率有关。对gdm患者进行早期诊断和治疗,改善gdm预后十分重要。对gdm诊断是用口服葡萄糖耐受试验。这种测试需要禁食至少8小时,需要3-4血液抽样,并要求2-3小时完成,需要开发一个简单,快速血液检测方法,预测gdm发生。研究发现,正常孕妇组血液中igfbp4水平为22.78ng/ml,而gdm组血液中igfbp4水平下降至14.79ng/ml,两组间有显著差异,p<0.001,血液中igfbp4水平下降与gdm发生有明显的相关性。
4.shbg是由肝脏产生的糖蛋白,结合循环中的性激素,如雌二醇,二氢睾酮和睾丸激素,调节睾丸激素和雌二醇的生物利用度,影响葡萄糖代谢。循环中shbg水平受雄激素/雌激素平衡状况、甲状腺激素、胰岛素和饮食因素的调节。
5.胰岛素和胰岛素样生长因子导致抑制shbg分泌、在胰岛素抵抗状态下,检测到低水平shbg,shbg已被认为是胰岛素抵抗的标志物。流行病学研究发现男性血清睾丸激素降低与随后中央性肥胖、胰岛素浓度升高、代谢综合征和糖尿病之间存在关联,而女性血液中睾丸激素升高与葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗密切相关,向糖尿病方向发展。研究表明,在肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征和t2md病人群中,shbg水平降低,循环中shbg浓度成为是t2dm发展的潜在预测因子。
6.研究发现,胰岛素抵抗是gdm发生的危险信号,gdm和胰岛素治疗妇女shbg水平较低,此外,妊娠前三个月shbg浓度降低孕妇,在妊娠后期,患gdm风险明现增加。一项前瞻性研究表明,评估15周269例孕妇几个生物标志物,表明低水平shbg与gdm风险增加有关,而独
立于其他危险因素,如bmi,吸烟和血压。使用211.5mm/l截止值,检测shbg预测gdm发生灵敏度为85%,特异性为37%。检测血液中shbg水平可帮助预测gdm发生。
7.同时检测igfbp4和shbg双指标,可同时预测pe,gdm,iugr及ptb的发生的危险性,需要开发简单,快速,定量检测血液中igfbp4/shbg的试剂盒。
8.本发明建立检测igfbp4/shbg免疫层析试剂盒,测定血液中igfbp4和shbg水平,用于pe,gdm,iugr及 ptb发生风险的评估。
技术实现要素:9.本发明公开了一种检测血液中igfbp4和shbg免疫层析试剂盒,主要成分试纸条,由pvc底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成,看图1。结合垫上吸附igfbp4抗体-微球和shbg 抗体-微球;硝酸纤维素膜设有固定igfbp4抗体检测线1(t1线),固定shbg抗体检测线2(t2线) 和固定抗igg抗体(c线)。
10.层析液:20-200mm tris,ph7.0-8.0,0.1-1.0%bsa,100-400mm nacl,0.1-1.0%tween-20。
11.所述的微球可以是荧光微球,彩色微球,金标微球,磁性微球及上转换发光微球的一种,本发明选用铕螯合物(europium chelate)荧光微球,激发光波长360-420nm,发射光波长600-650nm。
12.所述荧光微球,表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种,优选为羧基修饰过荧光微球。选用荧光微球直径范围是100-300nm,优选为直径100nm和200nm荧光微球。
13.本发明公开了igfbp4抗体和shbg抗体偶联荧光微球制备过程,步骤如下:
14.(1)5-20mm碳二亚胺(edc)和10-40mm n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-mhs)活化羧基修饰荧光微球;(2) 加入igfbp4抗体或shbg抗体进行偶联反应;(3)加入100-400mm tris缓冲液终止偶联反应;(4)洗涤后,将用tris缓冲液复溶igfbp4抗体-荧光微球或shbg抗体-荧光微球,2-8℃,保存备用。
15.本发明公开了一种结合垫吸附有igfbp4抗体-荧光微球和shbg抗体-荧光微球的制备过程:
16.用tris缓冲液稀释igfbp4抗体-荧光微球浓度到0.05-0.5mg/ml,shbg抗体-荧光微球浓度到 0.1-0.5mg/ml,用4-10ul/cm速度,将上述荧光微球喷涂到结合垫上,25-37℃,烘干4-12小时,干燥密封,备用。
17.本发明公开了一种硝酸纤维素膜上t线和c线的制备过程:
18.用磷酸盐缓冲液稀释igfbp4抗体浓度到0.5-2.5mg/ml,shbg抗体浓度到0.5-2.5mg/ml和抗igg抗体浓度到0.5-2.5mg/ml,用0.4-1.0ul/cm速度,将上述抗体液分别喷涂到硝酸纤维素膜上,形成t1线,t2 线和c线,间隔为4-6mm,25-37℃,烘干4-12小时,干燥密封,备用。
19.本发明公开了一种试纸条组装过程:
20.在pvc底板中间粘贴硝酸纤维素膜,一端粘贴吸水纸,位于硝酸纤维素膜上方,重叠2-3mm;另一端粘贴结合垫,位于硝酸纤维素膜上方,重叠2-3mm;在结合垫另一端粘贴样品垫,位于样品垫上方,重叠2-5mm,形成试纸板,切割成宽3-5mm试纸条。
21.本发明公开了一种试纸卡组装过程:
22.本发明含有外壳,由壳面和壳底座两部分构成。将上述试纸条置于壳底座上,合上壳面,形成试纸卡。所述壳面上对应于硝酸纤维膜位置设有检测窗口,壳面上对应于样品垫位置设有样品孔,看图2。
23.本发明用双抗体夹心免疫层析原理:样品中igfbp4和shbg通过层析作用向前移动,与结合垫吸附igfbp4 抗体-荧光微球或shbg抗体-荧光微球结合,形成igfbp4-igfbp4抗体-荧光微球复合物或shbg-shbg抗体-荧光微球复合物;在毛细动力作用下,shbg-shbg抗体-荧光微球复合物,其荧光微球直径为100nm,先进入硝酸纤维素膜,通过t1线,与硝酸纤维素膜t2线固定shbg抗体结合,而形成荧光微球-shbg抗体
ꢀ-
shbg-shbg抗体复合物,聚集在t2线;igfbp4-igfbp4抗体-荧光微球复合物,其荧光微球直径为200nm,后进入硝酸纤维素膜,与硝酸纤维素膜t1线固定igfbp4抗体结合,而形成荧光微球-igfbp4抗体-igfbp4
-ꢀ
igfbp4抗体复合物,聚集在t1线;游离igfbp4抗体-荧光微球或shbg抗体-荧光微在t1线或t2线处不结合,继续向前移动,并与c线固定抗igg抗体结合,未结合成分继续移动到吸水纸位置。t1线捕获的荧光微球量与样品中igfbp4浓度成正相关,t2线捕获的荧光微球量与样品中shbg浓度成正相关,而c线捕获的荧光微球,表明完成免疫层析过程。通过免疫荧光分析仪对t1线、t2线和c线信号进行扫描,根据t1线信号强度与样品中igfbp4浓度成正相关,获得样品中igfbp4浓度;根据t2线信号强度与样品中 shbg浓度成正相关,获得样品中shbg浓度。
24.免疫荧光分析仪,其特征在于:激发光波长为350-430nm,接收波长为600-650nm。用此分析仪对试纸卡结果进行判读,可实现自动化,提供简单、快速、可靠的检测结果。
25.将igfbp4和shbg校准品加到igfbp4/shbg试纸卡样品孔中,反应5-20分钟,用免疫荧光分析仪,测定试纸卡上t1线,t2线和c线荧光强度,制备igfbp4和shbg浓度标准曲线,获得igfbp4和shbg浓度与荧光强度单位相关参数后,设立免疫荧光分析仪自动检测igfbp4和shbg浓度系统,进一步检测样品中 igfbp4和shbg浓度。
26.本发明建立检测igfbp4/shbg免疫层析试剂盒,操作简单,快速,特异性高,定量测定出血液中igfbp4 和shbg浓度,能满足临床检验要求。
附图说明
图1免疫层析试纸条示意图图2免疫层析试纸卡正面图3 igfbp4浓度与rfu相关曲线图4 shbg浓度与rfu相关曲线
具体实施方式
27.结合具体实验,对本发明原理和结果作进一步说明,以下列出本发明多步骤实验过程。
28.一.制备检测igfbp4/shbg免疫层析试纸条
29.(一)igfbp4抗体偶联到铕螯合物荧光微球上
30.本发明实施例中,选用铕螯合物(europium chelate)荧光标记羧基修饰微粒(europium chelate ps-cooh),购于bangs laboratories inc.可选用铕螯合物荧光标记
羧基修饰微粒直径为100-300nm。
31.本发明实施例中,用edc和sulfo-nhs把igfbp4单克隆抗体,购于hytest,偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上,步骤如下:
32.1.取0.1ml europium chelate ps-cooh,浓度为10mg/ml,直径200nm,加入1.5ml离心管中,离心, 15000rpm,15分钟,去除上清液。
33.2.再加1.2ml 20mm mes缓冲液,ph6.0,到离心管中,悬浮微球。
34.3.离心,15000rpm,15分钟,去除上清液。
35.4.加0.2ml上述mes缓冲液含5mm edc和10mm sulfo-mhs到离心管中,混均,25℃,反应30分钟。
36.5.再加1.2ml上述mes缓冲液到离心管中。
37.6.离心,15000rpm,15分钟,去除上清液。
38.7.加0.2ml ph7.0 pbs含50ug igfbp4单克隆抗体到上述离心管中,25℃,反应2小时。
39.8.加20ul 200mm tris,ph7.4到离心管中,25℃,反应30分钟。
40.9.加1.2ml tris缓冲液,20mm tris,ph7.0 0.2%bsa,0.01%tween-20到离心管中。
41.10.离心,15000rpm,15分钟,去除上清液。
42.11.用上述tris缓冲液悬浮igfbp4抗体-荧光微球,4℃储存,备用。
43.(二)shbg抗体偶联到铕螯合物荧光微球上
44.本发明实施例中,shbg单克隆抗体,购于medix biochemical,偶联到europium chelate ps-cooh上,步骤如下:
45.1.取0.1ml europium chelate ps-cooh,浓度为10mg/ml,直径100nm,加入1.5ml离心管中,离心, 20000rpm,20分钟,去除上清液。
46.2.加1.2ml 20mm ph6.0 mes缓冲液到离心管中,悬浮荧光微球。
47.3.离心,20000rpm,20分钟,去除上清液。
48.4.加0.2ml上述mes缓冲液含4mm edc和10mm sulfo-nhs到离心管中,混均,25℃,反应30分钟
49.5.再加1.2ml上述mes缓冲液到离心管中。
50.6.离心,20000rpm,20分钟,去除上清液。
51.7.加0.2ml ph7.0 pbs含50ug shbg单克隆抗体到上述离心管中,25℃,反应2小时。
52.8.加20ul 200mm tris,ph7.4到离心管中,25℃,反应30分钟。
53.9.加1.2ml tris缓冲液,20mm tris,ph7.0,0.2%bsa,0.01%tween-20到离心管中。
54.10.离心,20000rpm,20分钟,去除上清液。
55.11.用上述tris缓冲液悬浮shbg抗体-荧光微球,4℃储存,备用。
56.(三)处理样品垫和结合垫
57.本发明选用玻璃纤维mf1样品垫,购于ge healthcare,浸泡在样品垫处理液,20mm tris,ph7.4,0.5% bsa,0.2%tween-20,0.01nan3,室温下,1小时,再30℃,烘干8小时,干
燥封闭,备用。
58.本发明选用玻璃纤维gfdx结合垫,购于emd millipore,浸泡在结合垫处理液,20mm tris,ph7.0,0.5% bsa,0.1%pvp,5%sucrose,0.2%tween-20,0.01%nan3,室温下,1小时,再30℃,烘干6小时,干燥封闭,备用。
59.(四)喷涂结合垫和硝酸纤维素膜
60.1.用tris缓冲液,20mm tris,ph 7.0,10mm nacl,1.0%bsa,10%sucrose,0.5%pvp,0.5%tween20,稀释igfbp4抗体-铕螯合物荧光微球到0.1mg/ml,稀释shbg抗体-铕螯合物荧光微球到0.15mg/ml,用xyz 三维划膜喷金仪(hm3035),购于上海金标科技生物有限公司,微定量喷头方式,8ul/cm速度,将igfbp4 抗体-荧光微球和shbg抗体-荧光微球喷涂到gfdx结合垫上,30℃,烘干6小时,干燥封存,备用。
61.2.用磷酸缓冲液,10mm napo4,ph7.0,1%trehalose,0.1%pvp,igfbp4抗体购于hytest,稀释到 1.5mg/ml,shbg抗体购于medix biochemical,稀释到2.0mg/ml,抗鼠igg抗体稀释到1.5mg/ml,将硝酸纤维素膜放在xyz三维划膜喷金仪(hm3035)上,用微定量划线方式,0.8ul/cm速度,将上述3个抗体液喷涂到硝酸纤维素膜上形成t1线,t2线和c线,两线间距5mm,30℃,烘干8小时,干燥封存备用。
62.(五)组装免疫层析试纸卡
63.试纸条组装在湿度小于30%,25-37℃房间进行。免疫层析试纸条,看图1,包括pvc底板及沿底板长度方向顺次粘覆于底板上的22mm样品垫、10mm结合垫、25mm硝酸纤维素膜、30mm吸水纸;其中,硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位,其上有相间隔igfbp4抗体涂层形成t1线、shbg抗体涂层形成t2线和由抗鼠 igg抗体涂层形成c线;结合垫喷涂有igfbp4抗体-铕螯合物荧光微球和shbg抗体-铕螯合物荧光微球。本发明实施例中,t1线与t2线平行设置,t1线与t2线之间的距离为5mm,t2线与c线平行设置,t2线与c线之间的距离为5mm。
64.吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近c线一端,与硝酸纤维素膜部分重叠,重叠长度为2mm;吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。
65.结合垫位于硝酸纤维素膜靠近t1线一端;与硝酸纤维素膜部分重叠,重叠长度为2mm;结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。
66.样品垫位于结合垫的外侧,并与结合垫部分重叠,重叠长度为3mm;样品垫重叠在结合垫上方。
67.将上述每组部分组装成试纸板,切割成宽度为4mm试纸条。
68.将上述试纸条装入壳底座中,合上壳面,构成试纸卡,如图2,壳面上设置有加样孔(9)检测窗口(10),露出试纸条局部区域;加样孔开口于样品垫(2)上部,露出部分样品垫区域;检测窗口开口于硝酸纤维素膜(4)上部,以露出全部t1线(5),t2线(6)和c线(7)。
69.二.免疫荧光分析仪检测igfbp4和shbg浓度过程
70.(一)igfbp4/shbg免疫层析试剂盒操作过程
71.用igfbp4/shbg免疫层析试纸卡进行定量检测血液中igfbp4和shbg时,在样品孔上加入10uligfbp4/shbg校准品液或10ul血清/浆,再加100ul层析液,20mm tris,ph7.4,100mm nacl,0.5%bsa, 0.5%tween-20,到样品孔中,反应10-15分钟,t1线,t2线和c线产生相应的荧光信号,使用免疫荧光分析仪进行检测。
72.(二)建立免疫荧光分析仪检测igfbp4和shbg浓度系统
73.1.建立igfbp4和shbg浓度标准曲线
74.用pbs,ph7.4,含0.5%bsa稀释igfbp4和shbg蛋白,igfbp4浓度为0,5,10,20,40,80ng/ml,shbg 浓度为0,10,20,40,80,160mm/l,制备成igfbp4/shbg校准品。加10ul igfbp4/shbg校准品到 igfbp4/shbg免疫层析试纸卡样品孔中,再加100ul层析液到样品孔中,进行膜层析反应,10-15分钟后,用免疫荧光分析仪,选定激发波长365nm,检测波长610nm,测定试纸条卡t1线,t2线及c线相对荧光强度单位(relative fluorescence units,rfu)。以igfbp4校准品浓度为纵坐标,t1线rfu为横坐标,制备igfbp4校准品浓度标准曲线,得到方程式,y=0.0021x-2.6082,r2=0.9869,看图3,通过此标准曲线得到igfbp4浓度标准卡,作为对样品中所含igfbp4浓度进行定量分析依据。以shbg校准品浓度为纵坐标,t2线rfu为横坐标,制备shbg校准品浓度标准曲线,得到方程式,y=0.0022x-3.6342,r2=0.9954,看图4,通过此标准曲线得到shbg浓度标准卡,作为对样品中所含shbg浓度进行定量分析依据。
[0075][0076][0077]
输入上述标准卡到免疫荧光分析仪,建立免疫荧光分析仪自动显示检测样品中igfbp4和shbg浓度系统。
[0078]
2.测定igfbp4/shbg免疫层析试剂盒重复性和准确度
[0079]
制备成20ng/ml的igfbp4和50mm/l shbg校准品作为样本,用上述免疫层析试剂盒重复测定igfbp4/shbg 样本15次,分别计算平均值(m)和标准差(sd),sd/m x100%=变异系数(cv),(1-m/样本浓度)x 100%=相对偏差(bias),结果见下表。
[0080]
sampleigfbp4 shbg 19.45 48.52 18.95 47.73 19.22 49.36 18.71 48.34 20.45 49.51 17.96 50.78 19.75 48.73 19.45 47.48 18.64 50.68 19.23 48.38 18.48 51.17
ꢀ
20.65 48.94 19.71 48.85 18.54 51.64 19.45 48.53m19.24267 49.24267sd0.731 1.27cv3.70% 2.60%bias1.80% 1.50%
[0081]
igfbp4的cv为3.7%,bias为1.8%,shbg的cv为2.6%,bias为1.5%,说明此igfbp4/shbg免疫层析试剂盒重复性和准确度良好。
[0082]
3.用igfbp4/shbg免疫层析试剂盒检测血清中igfbp4和shbg浓度
[0083]
10ul血清加到igfbp4/shbg免疫层析试纸卡加样孔中,再加100ul层析液到样品孔中,进行膜层析反应, 10-15分钟后,用免疫荧光分析仪自动检测igfbp4和shbg浓度,结果如下:
[0084]
血清样品12345678910rfu1189410751729013667157218421109601818269354371igfbp422.4ng/ml20ng/ml12.7ng/ml26ng/ml30.4ng/ml15ng/ml20.4ng/ml35.6ng/ml12ng/ml6.6ng/mlrfu36793421762376518776314561514237458104462657848756shbg77mm/l89mm/l44mm/l38mm/l66mm/l30mm/l78.8mm/l19mm/l55mm/l104mm/l