非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体筛选和检测用试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体鉴定用elisa试剂盒及其检测方法和制备方法。属于生物医药领域，具体属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域。
背景技术：
：非洲猪瘟(英文名称：africanswinefever，简称：asf)是由非洲猪瘟病毒(英文名称：africanswinefevervirus，简称：asfv)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似。非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链dna病毒。其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链dna，病毒基因组全长为170kb-190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(rafacl，yancz，javierm，etal.analysisofthecompletenucleotidesequenceofaficanswinefevervirus[j].virology，1995，208：249-279)。asfv形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72、p54和p30构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定(liuetal.2019.cryo-emstructureoftheafricanswinefevervirus.cellhost&microbe26(6):836-843.e3.)非洲猪瘟病毒在中国《动物病原微生物分类名录》中归属于一类动物病原微生物。目前，只有几个国家级科研机构可以使用非洲猪瘟病毒进行科研试验。为了能够研究和制备用于非洲猪瘟病毒检测用的单克隆抗体，我们使用分子生物学技术克隆表达p30蛋白，并以此为基础研究针对p30蛋白的单克隆抗体，但在大规模筛选和评价针对p30蛋白的单克隆抗体时，发现没有合适的方法和试剂盒，因为常规的方法需要使用非洲猪瘟病毒进行评价。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种不使用非洲猪瘟病毒但可以大规模筛选针对非洲猪瘟病毒特异性蛋白的单克隆抗体筛选方法；优选地的非洲猪瘟病毒蛋白为p30蛋白，优选地方法是建立一种针对非洲猪瘟病毒p30蛋白的elisa试剂盒。为了实现本发明的目的，本发明一方面提供了一种非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体鉴定用elisa试剂盒，所述试剂盒包括抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、羊抗鼠酶标抗体、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液和说明书，其中：所述的抗原包被板为包被有p30蛋白的酶标板；所述的样品稀释液为含有1％bsa的1×pbst溶液；所述的浓缩洗涤液为25×pbst溶液，在使用前稀释到1×pbst溶液；所述的羊抗鼠酶标抗体为使用样品稀释液将酶标二抗稀释10000倍后所得；所述的阳性对照为od450nm值在0.9～1.2之间的阳性血清；所述的阴性对照为od450nm值＜0.2的阴性血清；所述的显色液为tmb单组分显色液；所述的终止液为2mh2so4。优选地，本发明所述的抗原包被板上p30蛋白的包被浓度为200ng/孔/100μl。优选地，本发明所述的阳性对照od450nm值为1.1。优选地，本发明所述的阴性对照od450nm值为＜0.1。优选地，本发明所述的阳性对照od450nm值均≥0.6，阴性对照od450nm值均＜0.2时，试验成立，结果有效。另一方面，本发明还提供了使用本试剂盒对待检样本进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：1)样本稀释：用样品稀释液将待检样本进行1:100倍稀释；1)加样本：加入稀释好的样本、阴性对照和阳性对照，其中，阳性对照和阴性对照均做2个重复，100μl/孔，37℃孵育1小时，1×pbst洗涤3次，每孔300μl，每次3分钟，最后一次拍干；3)加羊抗鼠酶标抗体：每个反应孔中加入羊抗鼠酶标抗体，100μl/孔，37℃孵育1小时，1×pbst洗涤5次，每孔300μl，每次3分钟，最后一次拍干；4)加显色液：每个反应孔中加100μl显色液，37℃避光显色10分钟；5)加终止液：每个反应孔中加50μl终止液，并在10分钟内测定结果。6)检测：在酶标仪上测定各孔od450nm值；7)试验有效性判定：当阳性对照od450nm值均≥0.6，阴性对照od450nm值均＜0.2时，试验成立，结果有效；8)s/p值计算：9)试验结果判定：当待检样品s/p值≥0.4判为阳性，待检样品s/p值＜0.4判为阴性。再一方面，本发明还提供了一种制备该试剂盒的方法，所述的方法包括抗原包被板的制备、样品稀释液的配制与分装、浓缩洗涤液的配制与分装、羊抗鼠酶标抗体的配制与分装、阳性对照的制备、阴性对照的制备、显色液的分装、终止液的配制与分装。优选地，本发明所述的抗原包被板的制备包括以下步骤：1)包被：使用包被缓冲液将纯化的非洲猪瘟病毒p30重组蛋白稀释到2μg/ml，混匀后加入酶标板，100μl/孔，在2～8℃下作用12～15小时；2)洗涤：用1×pbst洗涤3次，每次3分钟，每孔300μl，最后一次拍干；3)封闭：加含1％bsa的pbs，200μl/孔，37℃封闭2小时；4)洗涤：用1×pbst洗涤3次，每孔300μl，每次3分钟，拍干；5)加保护剂：加入10％的海藻糖，37℃孵育2小时，拍干，加干燥剂并抽真空保存。优选地，本发明所述的阳性对照的制备包括以下步骤：1)免疫：取30只6-8周龄的雌性balb/c小鼠，以纯化的p30蛋白为免疫原(100μg/ml)，皮下多点注射免疫，每次免疫量为50μg/只；免疫2次，间隔2周，方法剂量同上，首次免疫使用弗氏完全佐剂，再次加强免疫使用弗氏不完全佐剂；2)血清采集：二免后21天，用眼球摘除法采集血液，分离血清，-20℃保存备用；3)使用权利要求6所述的方法对采集的血清进行检测，将od450nm值大于0.9小于1.2的血清混和作为阳性对照，分装为50μl/支，-20℃保存。优选地，本发明所述的阴性对照的制备包括以下步骤：1)血清采集：30只6-8周龄的spf级雌性balb/c小鼠，体表消毒，通过眼眶取血，3000g离心30min，分离血清，-20℃保存备用；2)使用权利要求6所述的方法对采集的血清进行检测，将od450nm值小于0.2的血清混和作为阴性对照血清，分装为50μl/支，-20℃保存。本发明所提供的试剂盒能够在不使用非洲猪瘟病毒的前提下用于非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体大规模筛选和检测，能够克服没有病毒用于筛选和检测时的困难，对显著提高非洲猪瘟病毒单克隆抗体的筛选效率，尤其是针对p30蛋白的单克隆抗体。另外，本发明所提供的建立该试剂盒的方法以及检测方法也可用于非洲猪瘟病毒其它抗原的单克隆抗体的筛选和检测。因此该方法也应属于本发明的保护范围之内。另一方面，使用本方法还可以用于其它抗原(不局限于非洲猪瘟病毒)的单克隆抗体的筛选和检测。附图说明图1pcr鉴定图谱，其中1：dnamarker；2：plasmid；3:plasmiddigestedwithxhoi-mlui；4:p30gene。图2非洲猪瘟病毒p30核苷酸序列比对结果。图3非洲猪瘟病毒p30蛋白sds-page电泳图。图4阳性的cut-off值。图5阴性的cut-off值。具体实施方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及各种原料，如无特别说明，均为市售。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1非洲猪瘟病毒p30蛋白的制备1材料1.1菌株与载体大肠杆菌bl21感受态细胞，购于博迈德科技有限公司；基因合成由通用生物系统(安徽)有限公司合成(提供质粒pet-30a)。1.2主要试剂dnamarker购自thermo公司、质粒小提试剂盒购自axygen公司；其他化学试剂均为国产分析纯。1.3仪器centrifμge5804r台式高速离心机购自德国eppendorf公司；pcr仪、核酸电泳仪、versadoc2000凝胶成像系统，美国bio-rad公司；hzq-c空气浴恒温双层振荡器，购自哈尔滨东明医疗仪器厂；sw-cj-if超净工作台，苏净集团安泰公司；-80℃冰箱，日本三洋。1.4主要溶液的配制1.4.1lb培养基称取5.0g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10gnacl，溶于1l纯化水，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。1.4.2lb(kan+)液体培养基lb培养基中加入卡那霉素，使终浓度为100μg/ml，置2～8℃保存。1.4.3lb(kan+)固体培养基在100mllb培养基中加入1.5g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。使用前，将培养基在微波炉中融化，室温冷却，待培养基温度降到50℃左右时，加入卡那霉素使其终浓度为100μg/ml，混匀后倒板，打开平皿盖自然冷却后，置2～8℃保存。2方法2.1目的片段合成选择我国非洲猪瘟流行毒株结构蛋白编码基因p30，基因全长621bp，其核苷酸序列见seqidno1。2.2重组菌株构建克隆位点ndei(catatg)-xhoi(ctcgag)，克隆载体pet-30a(+)，以上质粒构建由通用生物系统(安徽)有限公司完成。2.3感受态细胞转化将冰冻的感受态细胞先于冰上溶解，将1μl质粒dna加入100μl感受态细胞中于冰上放置30分钟，于42℃金属浴热击60秒，迅速放于冰上5分钟。将已摄取了外源遗传物质的感受态细胞加入培养试管,该培养试管有已预热至37℃的lb液体培养基,使总体积为1ml，200r/min培养1小时。复苏的菌液，用加样枪将菌液加到lb(kan+)平板上，用推棒涂布直至培养基表面无可见的液体，将有培养基的一面向下培养约30分钟后，倒置37℃培养过夜。从平板上菌落挑取单菌落接种于1mllb(kan+)液体培养基，37℃、200r/min培养12～16小时，收集1ml菌液，提取重组质粒，采用pcr扩增反应验证重组质粒是否含有非洲猪瘟p30片段。2.4菌株的保存对测序正确的菌株按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，检验合格后，取菌液加以终浓度为40％的甘油，置-80℃，作为原始种子批妥善保存。3p30蛋白表达3.1阳性菌株筛选与鉴定将连接产物转化感受态细胞，37℃倒置培养12～16小时后，可见菌落形态为光滑型，单个散在，边缘整齐，表面有光泽、湿润、灰白色，呈典型大肠杆菌菌落形态。挑取其中的1个单菌落进行pcr鉴定和测序鉴定，pcr鉴定结果(图1)与预期大小一致，序列比对结果，与genbank公布的非洲猪瘟病毒p30序列同源性为100％(图2)。并将筛选的阳性菌株命名为bl-21-p30。对重组大肠杆菌bl-21-p30进行纯粹检验，检验结果均纯粹，无杂菌或霉菌生长。3.2bl-21-p30菌种的p30蛋白表达以1％比例接种含100μg/ml卡纳霉素lb液体培养基，在37℃条件下以200r/min振荡培养2～4小时，至菌液od600nm为0.6～0.8时，加入终浓度1.0mmiptg继续诱导4小时。诱导好的重组菌5000g离心10分钟弃上清，沉淀部分使用pbs溶解10分钟后，用超声细胞破碎仪破碎。破碎后4℃离心(12000r/min)30分钟弃上清，沉淀包涵体部分用裂解液(50mmtris，8murea,0.5mnacl)裂解10分钟，12000r/min离心30分钟取上清过镍柱纯化。使用10倍柱体积裂解液清洗柱体；将上清加入镍柱中，蛋白液缓慢上样；10倍柱体积裂解液洗涤，去除杂蛋白；5倍柱体积洗脱液(50mmtris，8murea,0.5mnacl，300mm咪唑)洗脱收集纯化的p30蛋白冷冻保存。p30蛋白使用sds-page蛋白凝胶进行电泳检验，在30kd左右有一条清晰条带，纯度大于等于95％。实施例2非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体鉴定用试剂盒的建立1材料与方法1.1试验材料1.1.1纯化的非洲猪瘟病毒p30蛋白由浙江理工大学制备。1.1.2酶标板购自美国corning公司。1.1.3羊抗鼠酶标抗体均购自华美生物公司。1.1.4主要试剂tmb单组分显色液购自北京索莱宝科技有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯。1.1.5弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自sigma公司。1.1.6balb/c小鼠购自扬州大学。1.2试验方法1.2.1阳性血清和阴性血清的制备与检验1.2.1.1阴性血清的制备30只6-8周龄的spf级雌性balb/c小鼠，体表消毒，通过眼眶取血，3000g离心30min，分离血清，编号为n1-n30，置-20℃冰箱保存备用。1.2.1.2阳性血清的制备同样取30只6-8周龄的雌性balb/c小鼠，以纯化的p30蛋白为免疫原(100μg/ml)，皮下多点注射免疫，每次免疫量为50μg/只。免疫2次，间隔2周，方法剂量同上，首次免疫使用弗氏完全佐剂，再次加强免疫使用弗氏不完全佐剂。二免后21天，用眼球摘除法采集血液，分离血清，编号为p1-p30，置-20℃下保存备用。1.2.2间接elisa方法的建立1.2.2.1重组p30蛋白包被浓度确定与血清最佳稀释倍数的确定采用方阵滴定法确定重组蛋白的最佳工作浓度和待检血清的最佳稀释倍数。纯化后的重组p30蛋白用包被液(0.05m碳酸盐缓冲液ph9.6)稀释到浓度为4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml，按100μl/孔包被酶标板。阴性(n1)、阳性血清(p1)分别按1:100、1:200、1:400和1:800进行倍比稀释，每个血清稀释度对应8个抗原包被浓度。使用样品稀释液(含1％bsa的1×pbst溶液)将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠酶标抗体稀释10000倍。按照间接elisa方法的操作程序进行检测，用酶标仪测定每孔od450nm读数，计算相同稀释度的阳性血清和阴性血清孔之间的od450nm值的比值(p/n)值，选择p/n值最大孔的稀释度作为抗原和血清的最佳稀释度。1.2.2.2羊抗鼠酶标抗体工作浓度的优化以重组蛋白的最佳工作浓度包被elisa板，封闭，加入最适稀释倍数的阴性(n1)、阳性血清(p1)，将羊抗鼠酶标抗体按1:5000、1:10000、1:20000的比例倍比稀释，按照间接elisa方法的操作程序，检测已知的阴、阳性血清，酶标仪测定每孔od450nm值，比较p/n值，以确定酶标抗体最佳稀释度。1.2.2.3封闭条件的选择封闭液分别选择含0.5％bsa、1％bsa、5％bsa、5％脱脂乳的1×pbst溶液，封闭的时间分别用37℃孵育1小时、37℃孵育2小时、37℃孵育2.5小时，进行elisa检测，比较p/n值，确定最佳封闭条件。1.2.2.4抗原抗体反应条件及时间采用方阵滴定法确定抗原抗体的反应条件及时间。取阴性、阳性血清分别按最佳稀释倍数稀释，分别进行检测，抗原抗体反应温度为25℃、37℃，时间为1小时、1.5小时、2小时。用酶标仪测定每孔od450nm值，计算p/n(阳性/阴性)值。选择p/n值最大的条件为抗原抗体的反应条件及时间。1.2.2.5羊抗鼠酶标抗体作用条件及时间采用方阵滴定法确定酶标抗体工作条件及时间。取阴性、阳性血清分别按最佳稀释倍数稀释，分别进行检测；作用温度：4℃、37℃，作用时间：4℃作用14小时，37℃作用45分钟、60分钟、90分钟，酶标仪测定每孔od450nm值，计算p/n(阳性/阴性)值。选择p/n值最大孔的稀释倍数作为酶标抗体最佳作用温度与时间。1.2.2.6底物浓度及反应时间取底物分别进行检测，反应时间分别为8分钟、10分钟、15分钟，用酶标仪测定每孔od450nm值，计算p/n(阳性/阴性)值。选择p/n值最大孔的稀释倍数作为最佳底物浓度及反应时间。1.2.3阳性对照和阴性对照的制备1.2.3.1阴性对照的制备取n1～n30共30份阴性血清分别按照1.2.2的方法及确定的条件进行检测，将od450nm值小于0.2的血清混和作为阴性对照血清，分装为50μl/支，-20℃保存。1.2.3.2阳性对照的制备取p1～p30共30份阳性血清分别按照1.2.2的方法及确定的条件进行检测，将od450nm值大于0.9小于1.2的血清混和作为阳性对照血清，分装为50μl/支，-20℃保存。1.2.4成立条件取阴性、阳性对照按确定的诊断方法进行操作，并进行50次重复性试验，计算阳性对照确定试剂盒中阴性对照、阳性对照成立的成立条件。1.2.5阴阳性临界值的确定用203份已知阴性血清、200份已知阳性血清按上述确定的诊断方法进行检测，用medcalc软件对所有检测结果进行统计学分析(roc分析)，根据95％cis条件下的敏感性(sn95)，特异性(sp95)以及95％cis下的曲线面积(aucs)来确定最优临界点。2结果2.1阳性血清和阴性血清的制备与检测2.1.1制备按照试验方法分别制备得到30份阳性血清和30份阴性血清，每份血清均≥1ml，均置-80℃下保存备用。2.1.2检测ifa检测结果显示，30份阳性血清(p1-p30)均为阳性，30份阴性血清(n1-n30)均为阴性。2.2间接elisa方法的建立2.2.1重组p30蛋白包被浓度确定与血清最佳稀释倍数的确定方阵滴定法结果显示：当包被抗原量为200ng/孔/100μl(即2μg/ml)，血清的最佳稀释倍数为1:100时，检测得到的p/n最高(表1)，为最佳检测效果。因此，抗原的最佳包被量为200ng/孔/100μl(即2μg/ml)，血清的最佳稀释倍数定为1:100。表1p30蛋白抗原最佳包被浓度和阳性血清的最佳稀释度注：(+)表示阳性血清，(-)表示阴性血清2.2.2羊抗鼠酶标抗体工作浓度的优化当酶标抗体稀释度为1:10000时，检测得到的p/n值达到最高(表2)；因此，确定酶标抗体最佳工作浓度为1:10000。表2酶标抗体最佳稀释倍数的确定2.2.3封闭条件的选择当封闭液为含1％bsa的1×pbst，封闭条件为37℃2小时时，检测结果p/n值最高(表3)；因此，最佳封闭条件确定为：封闭液为含1％bsa的1×pbst，封闭条件为37℃2小时。表3最佳封闭条件的确定(阳性样品p/n值)2.2.4抗原抗体反应条件及时间采用方阵滴定法对抗原抗体反应条件进行实验，结果显示：抗原抗体反应在37℃条件下1小时p/n值最高(表4)，其与25℃条件下2小时p/n值差异不大。考虑到一般兽医实验室都配备生化培养箱，为了缩短操作时间，提高工作效率，我们确定抗原抗体最佳反应条件为：37℃条件下作用1小时。表4抗原抗体反应条件及时间2.2.5羊抗鼠酶标抗体作用条件及时间在羊抗鼠酶标抗体的工作浓度1:10000条件下，对羊抗鼠酶标抗体作用温度及反应时间进行实验，结果显示：37℃条件下作用60分钟时，p/n值达到最高(表5)。因此确认羊抗鼠酶标抗体最佳作用条件为：37℃条件下作用60分钟。表5羊抗鼠酶标抗体作用条件及时间p/n结果2.2.6底物浓度及反应时间加入底物之后分别在37℃作用8分钟、10分钟、15分钟进行elisa检测，选择底物最佳作用时间。用酶标仪测定每孔od450nm值，计算各个作用时间p/n值，结果表明加入底物10分钟时其p/n值最高。因此，选择37℃条件时底物反应时间为10分钟作为最佳底物浓度及反应时间。具体结果见表6。表6底物反应时间p/n结果2.3阳性对照和阴性对照的制备按照建立的elisa方法对p1-p30和n1-n30分别进行检测，其中p1-p5、p11-p14、p18-p20的od450值均大于0.9且小于1.2，优选地，od450nm值为1.1的。n1-n12、n15-n25、n28-n30的od450值均＜0.2，优选地，od450nm值＜0.1的。这些满足阳性对照和阴性对照要求的血清，混合后按照50μl/支分装，-20℃保存备用。2.4成立条件取阴性、阳性对照按确定的诊断方法进行操作，并进行50次重复性试验，结果如下：表7阴、阳性对照重复性试验检测结果考虑设备人员操作差异，因此确定成立条件为：阳性对照孔每孔od450nm读数应大于等于0.6；阴性对照孔每孔od450nm读数应小于0.2。2.5阴阳性临界值的确定用203份已知阴性血清(按照1.2.1的方法制备，来源于203只balb/c空白小鼠的血清)、200份已知阳性血清(按照1.2.1的方法制备，来源于200只免疫p30蛋白的balb/c小鼠的血清)按上述确定的诊断方法进行检测，用medcalc软件对所有检测结果进行统计学分析(roc分析)，根据95％cis条件下的敏感性(sn95)，特异性(sp95)以及95％cis下的曲线面积(aucs)来确定。分析结果显示(图4、图5)，阳性的cut-off值(s/p值)为0.399，阴性的cut-off值(s/p值)为0.399为系统分析的最优临界点。因此，为后续判定便捷，将最终标准定为：当样品s/p值≥0.4时判为阳性。当样品s/p值＜0.4时判为阴性。表8203份已知阴性样品(s/p值)表9200份已知阳性样品(s/p值)1.3351.3451.6651.2290.7070.3990.4160.4321.1320.4160.6160.7521.4450.5180.4060.9831.3920.6260.9640.6730.5960.6251.3810.412.1671.8881.9431.7090.670.4620.4121.4930.4721.0231.9710.4580.930.4270.5611.6470.5650.9921.0321.0350.4540.9030.4881.8090.4920.6542.1610.4971.3941.8830.8911.2750.6781.3860.5881.9440.4992.0661.0490.4481.410.6120.990.490.4510.4251.0330.8020.6440.5572.1652.1970.4251.5030.5140.7151.6710.4471.3721.9032.1482.1070.7521.6760.41.3730.4611.0310.480.7780.6852.0180.6031.61.0382.0750.8160.5030.9891.5050.4771.041.7360.9440.440.8270.6810.7731.5192.0970.9812.0971.9062.1291.7981.5391.3381.1370.810.4961.7470.791.9420.861.1481.9640.4810.8390.8881.4712.0831.1780.40.4321.2230.4070.5881.3931.1832.0070.6880.4820.5880.7531.9261.2121.7150.5060.6310.8341.7571.0921.3972.0770.5162.0171.2941.9141.921.4631.1650.5490.5661.5420.6190.911.7381.4930.4641.7761.3841.190.4621.7450.7061.0280.4991.9071.8940.8361.7540.821.3280.8530.9570.4380.5011.791.030.8210.8961.7260.6142.1751.9190.468///实施例3非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体鉴定用试剂盒的检测方法1.样本稀释：用样品稀释液将待检样本进行1:100倍稀释；2.加样本：加入稀释好的样本、阴性对照和阳性对照，其中，阳性对照和阴性对照均做2个重复，100μl/孔，37℃孵育1小时，1×pbst洗涤3次，每孔300μl，每次3分钟，最后一次拍干；3.加羊抗鼠酶标抗体：每个反应孔中加入羊抗鼠酶标抗体，100μl/孔，37℃孵育1小时，1×pbst洗涤5次，每孔300μl，每次3分钟，最后一次拍干；4.加显色液：每个反应孔中加100μl显色液，37℃避光显色10分钟；5.加终止液：每个反应孔中加50μl终止液，并在10分钟内测定结果。6.检测：在酶标仪上测定各孔od450nm值；7.试验有效性判定：当阳性对照od450nm值均≥0.6，阴性对照od450nm值均＜0.2时，试验成立，结果有效；8.s/p值计算：9.试验结果判定：当待检样品s/p值≥0.4判为阳性，待检样品s/p值＜0.4判为阴性。实施例4非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体鉴定用试剂盒制备与组装1.试剂盒制备1)抗原包被板的制备：①包被：使用包被缓冲液(0.05m碳酸盐缓冲液ph9.6)将纯化的非洲猪瘟病毒p30重组蛋白稀释到2μg/ml，混匀后加入酶标板，100μl/孔，在2～8℃下作用12～15小时；②洗涤：用1×pbst洗涤3次，每次3分钟，每孔300μl，最后一次拍干；③封闭：加含1％bsa的pbs，200μl/孔，37℃封闭2小时；④洗涤：用1×pbst洗涤3次，每孔300μl，每次3分钟，拍干；⑤加保护剂：加入10％的海藻糖，37℃孵育2小时，拍干，加干燥剂并抽真空保存。2)样品稀释液为含1％bsa的1×pbst溶液，其配方如下：称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800ml双蒸水中，添加0.5ml吐温-20、终浓度为0.01％(m/v)的proclin300和终浓度为1％(m/v)bsa，溶解后调节ph值到7.2，然后加双蒸水至1l，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。3)浓缩洗涤液为25×pbst溶液，在使用前稀释到1×pbst溶液，其配方如下：称取6.8g磷酸二氢钾、5g氯化钾、89.5g十二水合磷酸氢二钠、198.7g氯化钠，溶于800ml双蒸水中，添加1.25％的吐温-20(v/v)和终浓度为0.1％的防腐剂proclin300(v/v)，加双蒸水至1l，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。4)羊抗鼠酶标抗体为使用样品稀释液将酶标二抗稀释10000倍后所得。5)阳性对照为od450nm值在0.9～1.2之间的阳性血清，具体制备方法见实施例2。6)阴性对照为od450nm值＜0.2的阴性血清，具体制备方法见实施例2。7)显色液为tmb单组分显色液或其他通用显色液，定量分装即可。8)终止液为2mh2so4，其配方为取超纯水891ml，再缓缓加入109ml浓硫酸，混匀即可，配制时注意安全。2.试剂盒组装(192孔/盒或480孔/盒)，按照下表对试剂盒进行组装：实施例5针对非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体筛选5.1asfv免疫原的制备取重组大肠杆菌bl-21-p30基础种子批菌种，以1％比例接种含100μg/ml卡纳霉素lb液体培养基，在37℃条件下以200r/min振荡培养2～4小时，至菌液od600nm为0.6～0.8时，加入终浓度1.0mmiptg继续诱导4小时。诱导好的重组菌5000g离心10分钟弃上清，沉淀部分使用pbs溶解10分钟后，用超声细胞破碎仪破碎。破碎后4℃离心(12000r/min)30分钟弃上清，沉淀包涵体部分用裂解液(50mmtris，8murea,0.5mnacl)裂解10分钟，12000r/min离心30分钟取上清过镍柱纯化。使用10倍柱体积裂解液清洗柱体；将上清加入镍柱中，蛋白液缓慢上样；10倍柱体积裂解液洗涤，去除杂蛋白；5倍柱体积洗脱液(50mmtris，8murea,0.5mnacl，300mm咪唑)洗脱收集纯化的p30蛋白冷冻保存。p30蛋白使用sds-page蛋白凝胶进行电泳检验，在30kd左右有一条清晰条带，纯度大于等于95％。蛋白定量后分装，-70℃保存备用。5.2动物免疫将制备好的asfv抗原免疫balb/c小鼠。免疫方法如下，皮下免疫弗氏完全佐剂乳化的抗原100μg/只，间隔3周后腹腔注射不完全弗氏佐剂乳化的抗原50μg/只，再间隔3周后腹腔注射不完全弗氏佐剂乳化的抗原50μg/只，融合前3天加强免疫不含佐剂的抗原100μg/只。5.3细胞融合先将饲养细胞铺96孔细胞板，于37℃、5％co2培养箱培养备用。无菌取免疫小鼠脾脏，并制成脾细胞悬液，将sp2/0与脾细胞悬液混合(比例为1:5～1:10)于50ml离心管中混匀，以1500r/min离心10分钟，去上清。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中，在1分钟之内慢慢滴加预热至37℃的50％peg1ml，边加边轻轻搅拌。然后慢慢加入预热至37℃的1640液10ml。最后加入30ml1640液。以1000r/min离心5分钟，收集沉淀。用hat培养基悬浮融合后的细胞，接种于已铺有饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔。于37℃、5％co2培养箱中培养。融合后第二天开始观察，应无污染，于第四天每孔补加1滴hat培养基，第8～10天吸去100μl培养基换ht培养基100μl。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。5.4使用实施例4制备和组装的试剂盒并使用实施例3的检测方法对5.3的培养基进行检测。5.5杂交瘤细胞阳性克隆株筛选结果融合后筛选到4株阳性细胞株，挑选三株效价较高的进行亚克隆，获得稳定分泌抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株2株，挑选elisa检测值最高的单克隆细胞株进行扩大和冻存，并分别命名为7d5和4c11，具体结果见下表。表10杂交瘤细胞阳性克隆株筛选结果上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本
技术领域：
的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。序列表<110>杭州恒奥科技有限公司<120>非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体筛选和检测用试剂盒及其制备方法<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>621<212>dna<213>非洲猪瘟病毒p30核苷酸序列<400>1catatggatttcatcctgaatatcagtatgaaaatggaagttatcttcaagaccgatctg60cgtagtagcagtcaggttgtttttcatgcaggcagtctgtataattggtttagtgtggaa120attatcaacagtggccgcattgttaccaccgccattaagaccctgctgagtaccgtgaaa180tatgatattgttaaaagcgcccatatctatgcaggccagggttataccgaacatcaggca240caggaagaatggaatatgattctgcatgttctgtttgaagaagaaaccgaaagcagtgcc300agcagcgaaagcattcatgaaaagaatgataatgagaccaacgaatgcaccagcagtttt360gaaaccctgtttgaacaggaaccgagcagtgaagaaccgaaagatagcaaactgtatatg420ctggcccagaaaaccgttcagcatattgaacagtatggtaaagccccggattttaataag480gttattcgcgcccataattttattcagaccattcatggcaccccgctgaaagaagaagaa540aaagaagttgtgcgtctgatggttattaagctgctgaaaaagaataagctgctgagccat600ctgcatctgatgtttctcgag621当前第1页12