一种重金属经口生物可及性与毒性检测体系的建立方法与流程

本发明属于食品安全检测与评估技术领域，尤其涉及一种重金属经口生物可及性与毒性检测体系的建立方法。

背景技术：

受环境污染等因素的影响，食品和饮用水来源的安全问题时有发生。经口摄入被污染的食品/饮用水所导致疾病的发病率日益上升，已占据各种疾病总发病率排行榜第二位，成为当前重点关注的安全卫生问题。重金属，作为自然界的一种重要化学物污染物，一旦进入机体，较难自然排出或彻底清除，对机体的危害具有多系统、多器官和不可逆等特点，严重影响人类健康安全。因此，对食品和饮用水来源可能造成污染的重金属等化学物进行风险评估及有效管理控制是当务之急。

现行食品和饮用水安全风险评价体系主要以整体动物实验进行危害识别和剂量-反应关系外推，存在检测评价周期长、花费大、由动物实验外推至人以及高剂量外推至低剂量不确定性和以中毒和死亡为观察终点难以准确反映暴露的早期健康效应等限制，无法满足快速检测和准确评估的需求。随着21世纪毒性测试新策略(toxicitytestingin21stcentury,tt21c)的提出后，依赖于高通量的体外测试体系发展和计算机毒理学应用，已取得许多成果，尤其是毒性通路(toxicitypathways)和有害结局路径(adverseoutcomepathway,aop)从概念提出到研究的深入开展，为化学物的毒效应阐述和风险评估指明了新方向和研究手段。以人源细胞系为代表替代动物实验的体外模型研究引起广泛关注，在探究皮肤致敏物质的不良结局路径(adverseoutcomepathway,aop)及风险评估方面的应用已取得突破性的进展，说明体外细胞模型在aop框架下应用于检测和评估的可行性。

食品和饮用水化学物的检测和风险评估方面，具体涉及经口化学物的生物可及性与毒性检测。目前，体外细胞模型常采用待测化学物直接染毒caco-2细胞模型或其他肠组织来源细胞的方式模拟肠道对化学物吸收转化过程，该方法与体内研究相比，操作简单、成本低、能在较短时间内初步评估人体暴露于化学物的影响，但存在较明显的缺陷：(1)caco-2细胞模型仅由单层小肠上皮细胞构成相比人体正常小肠上皮细胞单层缺少黏液层覆着；(2)直接使用化学物进行染毒的方式忽略了人体消化过程对化学物转化的影响，尤其在对食品和饮用水中性质不稳定的化学物进行评价时，消化过程不可忽视。发表于natureprotocols杂志的文献“infogeststaticinvitrosimulationofgastrointestinalfooddigestion”中提供了infogest2.0体外消化方法，被广泛用于体外消化模型的建立。

虽然已有多种体外胃、肠消化模型，但是，即使研究来自同一食品/水样品中的重金属等化学物不同模型结果也很难统一，检测和评估结果的可靠性不强。中国专利申请cn110459326a公开了一种近海食用贝类的重金属健康风险评价方法，包括如下步骤：获取待评估贝类可食用部分的重金属浓度数据；获取待评估区不同年龄消费者人群的体重和贝类日摄入量数据；通过体外消化模型确定不同贝类中重金属对人体的生物可及性；采用每周摄入量、致癌健康风险和非致癌健康风险评价方法，得到消费者食用贝类的重金属健康风险。该方法仅通过体外消化模型确定生物可及性，未考虑吸收情况，难以反映人体实际吸收情况，从而影响了生物可及性检测和健康风险评估的准确性。

因此，提供一种重金属经口生物可及性与毒性检测体系的建立方法，对不同体外模型进行合理串接，具有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种重金属经口生物可及性与毒性检测体系的建立方法，适用于检测重金属经口生物可及性，也适用于潜在毒性效应的预测和健康风险的评估，更能反映人体实际消化/吸收情况，比现有的检测和评价方法更全面、科学和准确，可以为构建化学物外暴露剂量与靶器官剂量外推模型提供重要参考。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

本发明提供一种重金属经口生物可及性检测体系的建立方法，包括如下步骤：

1)分别构建人体外胃肠消化模型和人小肠上皮细胞3d模型；

2)对所述人体外胃肠消化模型分别施加含不同浓度重金属的物质模拟人体消化过程，收集得到含重金属的消化液；

3)对所述人小肠上皮细胞3d模型分别施加所述含重金属的消化液培养预定时间，以模拟小肠吸收过程；

4)追踪人体外胃肠消化过程及人小肠上皮细胞吸收过程重金属价态及浓度的变化，计算经口生物可及性，建立经口暴露重金属浓度与生物可及性的关系曲线。

优选地，所述步骤1)中，基于静态体外消化infogest2.0方法建立人体外胃肠消化模型，禁食状态下的模拟胃液ph调整为1.8，模拟胃液的组分及其浓度包括：氯化钾6.9mm、磷酸二氢钾0.9mm、碳酸氢钠25mm、氯化钠47.2mm、六水合氯化镁0.12mm、碳酸铵0.5mm、盐酸15.6mm、二水合氯化钙0.15mm、胃蛋白酶2000u/ml、胃脂肪酶60u/ml、抗坏血酸175μm、谷胱甘肽18μm。

优选地，所述步骤1)中，构建人小肠上皮细胞体外吸收模型的步骤包括：将生长状态良好的caco-2和ht29-mtx按9：1的比例、密度为10万/孔，接种于小室顶侧pet膜上，于37℃、5％co2培养箱中培养21天。

更优选地，所述小室的型号规格为12孔、0.4μm孔径、1.12cm2生长面积。

优选地，所述步骤2)中，不同浓度的重金属范围为0-40mg/l；所述重金属包括：铬、铅、镉、汞、砷、锡、镍。

更优选地，所述步骤2)中，不同浓度的重金属范围为0-20mg/l；所述重金属为铬。

优选地，所述步骤3)中，所述含重金属的消化液稀释5-15倍后施加于小室顶侧，所述培养预定时间分别是4，8，12，24h。

优选地，所述步骤4)中，计算公式为：生物可及性(％)＝(c×v)/(t×m)×100％，c为消化液中重金属浓度，v为消化液体积，t为流质食品或水中重金属浓度，m为流质食品或水消化前质量或体积。

此外，本发明还提供一种重金属经口毒性检测体系的建立方法，包括所述的重金属经口生物可及性检测体系的建立方法，还包括如下步骤：小肠吸收结束后测定人小肠上皮细胞3d模型毒性损伤指标随重金属施加浓度的变化曲线，基于经口生物可及性的结果，评估暴露风险，建立经口暴露重金属浓度与暴露风险的关系曲线。

优选地，所述人小肠上皮细胞3d模型损伤指标包括细胞增殖能力、氧化应激以及遗传损伤中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明率先将基于静态体外消化infogest2.0方法建立人体外胃肠消化模型与基于人源化细胞caco-2和ht29-mtx建立人小肠上皮细胞3d模型进行合理的串接，实现体外模拟消化/吸收过程，应用重金属检测及细胞毒性检测技术，达到同时检测生物可及性、预测毒性效应和评估健康风险的目的，对重金属的消化和吸收情况形成更清楚的认识。

(2)本发明将待测重金属先进行体外消化之后按一定比例稀释加入培养基作用于人小肠上皮细胞3d模型，相比直接用化学物染毒的方式更能反映人体实际暴露情况；此外，通过caco-2(人结直肠腺癌细胞)和ht29-mtx(低剂量甲氨蝶呤诱导的定向分化人结肠癌细胞)按一定比例培养建立的人小肠上皮细胞3d模型分化成熟后形成表面有黏液层附着的细胞单层，其厚度及结构与人体单层肠上皮细胞相近，更能反映人体实际吸收情况。

(3)与动物试验相比，本发明的实验条件可控可调、操作较简单、重复性好，实验结果检测及观察具有直观性且可信度高，周期短，能满足重金属经口生物可及性及生物利用度等指标的检测，也适用于潜在毒性效应预测和健康风险评估，比现有的检测和评价方法更全面、科学和准确，可为构建化学物外暴露剂量与靶器官剂量外推模型提供重要参考。

附图说明

图1为细胞单层21dab-pas染色示意图(纵切面100×)。

图2为细胞单层膜完整性等指标与生长时间关系示意图；其中，2a为细胞单层teer与生长时间关系示意图，2b为细胞单层渗透性与生长时间关系示意图，2c为细胞单层ap/bl碱性磷酸酶比值与生长时间关系示意图。

图3为模拟饮水暴露cr(ⅵ)消化过程之后作用于细胞单层4h，细胞模型损伤程度与暴露cr(ⅵ)剂量之间的关系示意图。其中，3a为细胞单层4hab-pas染色示意图(纵切面100×)；3b为细胞模型氧化损伤结果示意图。

图4为细胞单层暴露cr(ⅵ)剂量与生物利用度结果示意图。

图5为模拟饮水暴露cr(ⅵ)剂量与生物利用度的关系曲线。

图6为模拟饮水暴露cr(ⅵ)剂量与暴露风险的关系曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例中如未注明实验具体条件，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。文中除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。cr(ⅵ)指六价铬离子。

实施例中所用部分原材料说明如下：人结直肠腺癌细胞caco-2与低剂量甲氨蝶呤诱导的定向分化人结肠癌细胞ht29-mtx购自atcc；dmem基础培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素双联抗生素、l-谷氨酰胺均购自gibco公司。

实施例中所用部分仪器说明如下：co2恒温培养箱(esco，新加坡)，台式低温离心机(eppendorf，德国)，倒置荧光显微镜(nikon，日本)，倒置显微镜(leica，德国)，生物安全柜(esco，新加坡)，spark10m多功能酶标仪(tecan，瑞士)，ers-2细胞电阻仪(millipore，美国)，12孔培养板(0.4μm，corning，美国)。

实施例一重金属经口生物可及性检测体系的建立方法

提供一种重金属经口生物可及性检测体系的建立方法，包括以下步骤：

1.1构建人体外胃肠消化模型和人小肠上皮细胞3d模型；

基于静态体外消化infogest2.0方法建立体外消化模型，开始前需测定胃蛋白酶、胰蛋白酶活性，胆盐浓度及调节ph至特定值所需加入酸碱体积以控制实验之间的批次差异，提高实验可重复性。配制1.25×模拟唾液(simulatedsalivafluids，ssf)储备液，(1×模拟唾液含15.1mm氯化钾、3.7mm磷酸二氢钾、13.6mm碳酸氢钠、0.15mm六水合氯化镁、0.06mm碳酸铵、1.1mm盐酸、1.5mm二水合氯化钙；调节ph至7.0)，1.25×模拟胃液(simulatedgastricfluids，sgf)储备液(1×模拟胃液含6.9mm氯化钾、0.9mm磷酸二氢钾、25mm碳酸氢钠、47.2mm氯化钠、0.12mm六水合氯化镁、0.5mm碳酸铵、15.6mm盐酸、0.15mm二水合氯化钙；调节ph至3)、1.25×模拟肠液(simulatedintestinalfluids，sif)储备液(1×模拟肠液含6.8mm氯化钾、0.8mm磷酸二氢钾、85mm碳酸氢钠、38.4mm氯化钠、0.33mm六水合氯化镁、8.4mm盐酸、0.6mm二水合氯化钙；调节ph至7.0)，应特别注意的是加入碳酸盐时需尽量保持容器密封，二水合氯化钙在体外消化开始前添加。消化液现用现配，可参考(http://www.proteomics.ch/ivd/)根据当日需消化样本量配制消化液。整个消化过程在37℃下进行，所有溶液在使用前应预热以避免温度波动。消化液活性成分调整应考虑消化过程待测化学物是否受某些因素(如胃液酸度、酶浓度、还原物质种类及浓度)影响而发生理化性质改变，若会受影响则结合人群消化液样本数据信息进行调整，并将实验结果与以往文献报道结果进行比较，以确定最佳模拟参数。消化液ph参考：胃液1.7-6.4，肠液5.0-7.0。消化时间根据食品水解难易程度，胃消化阶段控制在2-3h之间，肠消化阶段控制在3h以内。

构建人小肠上皮细胞3d模型，具体涉及的方法包括换液、传代、复苏及冻存等步骤。优选地，将新复苏的caco-2与ht29-mtx加入培养容器中培养4-5代，细胞为贴壁生长，当细胞融合度达80％，用edta-胰酶消化传代，部分细胞可加入冻存液(10％二甲基亚砜，90％胎牛血清)于-80℃保存。细胞生长状态良好时接种于小室顶侧(apicalside,ap)pet膜上，caco-2与ht29-mtx接种比例为9：1，密度为10万/孔，于37℃、5％co2培养箱中培养，期间每48h更换培养液，所述小室的型号规格为12孔、0.4μm孔径、1.12cm²生长面积。细胞共培养21天，通过检测细胞单层的完整性、渗透性及分化程度以判断模型是否构建成功。

所述细胞单层完整性检测：分别在接种后7，14，21天，测定teer值，每孔测3次取均值。teer值＝(r测定孔-r空白孔)×a，r测定孔为生长有细胞的培养皿测得的电阻值，r空白孔为未接种细胞，仅加入相同体积培养液的培养皿的电阻值，a为有效膜面积(1.12cm²)。当teer值大于300ω/cm²，说明细胞单层膜完整性已形成。

所述细胞单层通透性检测：本实验中采用荧光黄验证细胞膜的通透性，用hank’s平衡盐缓冲液(hank’sbalancedsaltsolution,hbss)分别配制0.005-0.5μg/ml浓度范围的荧光黄标准溶液。细胞接种7，14，21天后，每块12孔板选取其中3孔，弃去培养液，并用预热的hbss清洗2次后弃去，在ap加入含有20μg/ml荧光黄的hbss溶液0.5ml，bl加入hbss溶液1.5ml，在37℃、5％co2培养箱中培养，分别于0.5h，1h在bl侧取100μl，同时补加100μlhbss。实验结束后，使用酶标仪在激发波长427nm、发射波长536nm处检测荧光强度。并根据标准曲线和回归方程计算荧光黄转运系数papp，papp＝(dq/dt)/(ac0)，其中：dq/dt为单位时间荧光黄转运量(μg/s)，a为有效膜面积(1.12cm²)，c0为荧光黄的初始浓度(20μg/ml)。培养21天后papp低于5×10^-7cm/s，说明细胞单层膜完整性已形成，渗透性符合实验要求。

所述细胞单层生长分化程度检测：本实验中使用碱性磷酸酶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，分别在细胞接种7，14，21天后，收集细胞膜ap、bl侧培养液，按试剂盒说明书检测细胞培养液中的碱性磷酸酶活力[金氏单位/100ml]，计算ap与bl侧细胞培养液中的碱性磷酸酶活力比值，比值ap/bl大于4，说明细胞模型在生长过程中分化明显，极性形成。

1.2对所述体外消化模型分别施加不同浓度的重金属后模拟人体消化过程，收集得到含重金属的消化液；

不同浓度的范围可参考人体经口暴露具体的重金属种类来确定，最低剂量应包含当前安全限值。在参考的基础上，经实验考察，将重金属的不同浓度范围确定为0-40mg/l。所述多个浓度为按等比数列变化的浓度，比例优选2或5。以确保细胞损伤程度仅与待测化学物浓度有关。

体外消化过程具体操作：将含重金属的流质食品样品与模拟唾液液(除上述所含无机盐成份外还应包含75u/ml唾液淀粉酶和1.5mm二水合氯化钙)等体积混合，置于37℃，55rpm的摇中床孵育2min模拟口腔消化阶段；之后再与等体积模拟胃液(除上述所含无机盐成份外还应包含2000u/ml胃蛋白酶、60u/ml胃脂肪酶和0.15mm二水合氯化钙)混合，置于37℃，55rpm的摇中床孵育2-3h模拟胃消化阶段，结束后与等体积模拟肠液(除上述所含无机盐成份外还应包含10mm胆盐、100u/ml胰酶和0.6mm二水合氯化钙)混合，置于37℃，55rpm的摇中床孵育0.2-3h模拟小肠消化阶段。

各阶段孵育结束后，10000rpm离心5min，收集上清，取部分用于下一消化阶段；剩余上清液加热至95℃10min使酶失活，冷却后调节ph至6.8-7.4之间，用0.22μm滤膜过滤，储存于-80℃，用于后续处理细胞模型、检测重金属/消化后产物的浓度。

1.3对所述人小肠上皮细胞3d模型分别施加所述含有重金属的消化液后培养4-24h模拟小肠吸收过程；

将1.2获得的各阶段消化液于37℃预热后用细胞培养液稀释5-20倍，取0.5ml加入细胞模型ap侧，bl加入细胞培养液1.5ml，置于37℃、5％co2培养箱中分别培养4、8、12、24h。培养结束后收集ap、bl培养液，4℃400g离心5min，取上清保存于-80℃用于检测重金属/重金属消化后产物的浓度及乳酸脱氢酶测定，细胞单层用于测定活性氧及免疫荧光。

1.4追踪体外消化过程及人小肠上皮细胞吸收过程各阶段重金属/重金属特征消化后产物的浓度变化，计算重金属经口生物可及性/利用度，建立重金属浓度与生物可及性/利用度的关系曲线；

所述追踪人体外胃肠消化过程及人小肠上皮细胞吸收过程重金属价态/浓度的变化，是通过检测各消化/吸收阶段存留样本中重金属价态及对应浓度，建立经口暴露重金属浓度与生物可及性的关系曲线。应用高效液相色谱法(hplc)区分胃、肠消化后消化液样品中重金属价态，电感耦合等离子体质谱(icp-ms)检测各个价态重金属浓度。细胞及ap、bl上清液样品需用微波消解仪对样品进行预处理，之后10000rpm离心5min取上清，用2％硝酸将样品浓度稀释至1-100μg/l待测。细胞内重金属含量用细胞总蛋白进行校正，即：单位毫克蛋白的细胞中所含重金属含量，单位为：μg/mgprotein；消化液中重金属检测仅需用2％硝酸将样品浓度稀释至1-100μg/l待测。

所述重金属在胃肠道的生物可及性是指：重金属经过胃肠道消化从流质食品或水基质中释放出来，随后可能被肠道吸收的部分占流质食品或水中总化学物的比例。具体计算公式为：生物可及性(％)＝(c×v)/(t×m)×100％，公式中，c为消化液中重金属浓度(μg/ml)，v为消化液体积(ml)，t为流质食品或水中重金属浓度(μg/g或μg/ml)，m为流质食品或水消化前质量(g)或体积(ml)。

所述重金属的生物利用度是指：经肠道吸收的部分能到达全身循环并能发挥其毒性作用的重金属占摄入来自流质食品或水中总重金属的比例。具体计算公式为：生物利用度(％)＝[1-(cap×vap)/(tap×map)]×100％，公式中，cap为染毒结束后ap侧重金属浓度(μg/ml)，vap为ap侧溶液体积(ml)，tap为消化液加入ap侧时重金属浓度(μg/ml)，map为消化液加入ap侧的体积(ml)。

所述建立重金属浓度与生物可及性/利用度的关系曲线是采用bmdexpress分析软件，根据各个拟合模型的p值、aic值选择最优模型绘制曲线。

实施例二重金属经口毒性检测体系的建立方法

提供一种重金属经口毒性检测体系的建立方法，包括以下步骤：

1.1构建体外消化模型和人小肠上皮细胞3d模型；

1.2对所述体外消化模型分别施加不同浓度的重金属后模拟人体消化过程，收集得到含重金属的消化液；

1.3对所述人小肠上皮细胞体外吸收模型分别施加所述含有重金属的消化液后培养4-24h模拟小肠吸收过程，测定反映所述细胞模型毒性损伤程度随重金属施加浓度的变化曲线；

1.4追踪体外消化过程及人小肠上皮细胞吸收过程各阶段重金属/重金属特征消化后产物的浓度变化，计算重金属经口生物可及性，建立重金属浓度与生物可及性的关系曲线；

本实施例中的步骤1.1、1.2、1.4与实施例一相同。

本实施例中的步骤1.3中，还包括测定反映所述细胞模型毒性损伤程度随重金属施加浓度的变化曲线的步骤，所述细胞模型毒性损伤包括：细胞氧化应激、增殖能力、遗传损伤，检测方法包括：活性氧测定、乳酸脱氢酶(ldh)测定、γ-h2ax免疫荧光。

所述活性氧测定，反映细胞氧化应激状态，是细胞应对化学物反应比较敏感的指标。本发明中使用活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，具体操作可参考说明书。染毒结束后给细胞装载dcfh-da探针，于37℃、5％co2培养箱中避光孵育30min，之后用预热pbs润洗两次去除多余探针。置于荧光倒置显微镜下观察拍摄，每个样本选取中心、染色均匀的视野拍摄，共拍摄5张图片，以获得每个样本代表性图片。荧光强度用imagej定量。测定结束后用刀片将pet膜取下，储存于含有1ml2％硝酸的ep管中，用于检测胞内待测化学物产物及浓度。

所述乳酸脱氢酶(ldh)测定，反映细胞毒性。本发明中使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，具体操作可参考说明书。细胞染毒结束取120μlap上清于96孔板内加入60μlldh检测工作液，避光室温摇床孵育30min，在490nm波长处测定吸光度。设置空白孔(新鲜培养液)、阳性对照孔[孵育结束前1h，阳性对照孔加入ldh释放试剂(培养基与ldh释放试剂的比例为10：1)]。根据公式计算：细胞毒性或死亡率(％)＝(atest-ablank)/(amax-ablank)×100％。

所述γ-h2ax免疫荧光检测以反映细胞遗传损伤程度。染毒结束后细胞用预冷的pbs润洗三次，4％多聚甲醛室温固定15min后，用含0.5％trintonx-100pbs室温通透5min，之后用预冷的pbs洗三次。山羊血清室温封闭30min后，加入γ-h2ax一抗(rabbitanti-histoneh2a.xantibody-chipgrade(ab11175)，稀释比例1：1000)4℃过夜孵育，孵育结束后用含20％tween的pbs溶液(pbst)洗三次以洗去残余未结合或非特异性结合的一抗。加入山羊抗兔二抗及dapi[goatanti-rabbitiggh&l(hrp)(ab205718)，稀释比例1：500；dapi，稀释比例1：1000]室温孵育30min，随后用pbst洗三次。置于荧光倒置显微镜下观察拍摄，每个样本选取中心、染色均匀的视野拍摄，共拍摄5张图片，以获得每个样本代表性图片。荧光强度用imagej定量。测定结束后用刀片将细胞膜取下，储存于含有1ml2％硝酸的ep管中，用于检测胞内待测化学物产物及浓度。

要求每个实验组一式三份，数据以均数±标准差(x±sd)表示,统计分析采用spss20.0及graphpadprism7.0进行数据处理与绘图,组间比较用单因素方差分析(anova)，在单因素方差分析有意义的基础上再进行组间两两比较，两变量之间相关关系行spearman相关分析，p<0.05为差异显著。

1.5基于经口生物可及性/利用度，计算暴露风险，建立重金属浓度与暴露风险的关系曲线。

所述暴露风险计算，首先，基于上述实施例一的生物可及性结果估算健康个体每日每千克体重下重金属的吸收量，计算公式为：当重金属为非致癌物质时，其潜在的暴露风险为吸收量(di)与参考剂量(rfd)的比值，计算公式为：当重金属为致癌物质时，其风险是通过计算人体一生暴露于潜在致癌物质引起的致癌可能性，计算公式为：cancinogenicrisk＝di×sf，参数定义见表1。

表1暴露风险公式涉及参数的定义

所述建立重金属浓度与暴露风险的关系曲线是采用bmdexpress分析软件，根据各个拟合模型的p值、aic值选择最优模型绘制经口暴露重金属浓度与暴露风险的关系曲线。

实施例三体系应用过程中所涉及的质量控制

本发明在消化/吸收阶段通过计算回收率进行质量控制以保证结果的准确性。消化阶段通过测定消化后离心获得的上清液(消化液)与离心后不溶性沉淀(食糜)中重金属浓度，二者含重金属总量与食品样品中重金属含量之比即为消化阶段回收率，要求该阶段回收率在0.9-1.1范围之间；肠吸收阶段分别测定ap、bl和细胞中重金属浓度，三者之和与消化液加入ap侧重金属含量比值即为肠吸收阶段回收率，要求该阶段回收率在0.8-1.0范围之间。从而判断模型准确度好坏。

本发明应用人体外胃肠消化模型及人小肠上皮细胞3d模型获得的生物可及性和生物利用度结果，在相同模拟参数条件下重复实验结果的日内/日间相对标准差要求均小于5％，表明本体系所得结果稳定可靠，重复性好。

本发明实施前应确保所用试剂、器皿、生物材料未被待测重金属污染。

本发明获得的经口暴露重金属的水平与生物可及性/生物利用度/暴露风险的关系曲线，三者之一应与现有该重金属经口暴露实验结果中相关数据进行比较分析，必要时可进行动物实验验证本体系获得的实验结果。

实施例四饮用水中六价铬重金属经口生物可及性与毒性检测体系的建立

铬(chromium,cr)广泛分布于自然界中，主要污染来源于工业生产。cr价态繁多，其中cr(ⅲ)和cr(ⅵ)是保持热力学稳定的两种常见价态且在一定条件下可以相互转换。目前，大多数研究认为cr(ⅲ)无毒而cr(ⅵ)有毒，人体经口暴露cr(ⅵ)多见于摄入污染的水。

经口暴露cr(ⅵ)的毒作用机制可简单概括为：胃酸还原能力饱和后，未还原的cr(ⅵ)进入胞内代谢活化发挥生物毒性作用。cr(ⅵ)具有较强的氧化性，经口暴露后超过80％cr(ⅵ)在胃内能与还原物质(抗坏血酸、谷胱甘肽等)发生氧化还原反应被还原为cr(ⅲ)，未被还原的cr(ⅵ)以及还原后形成的cr(ⅲ)随胃蠕动流向小肠。cr(ⅲ)形成的阳离子结构较大，仅不到1％的cr(ⅲ)可通过胞吞胞吐的方式进入胞内，大多数随粪便排出体外，生物利用度极低；而cr(ⅵ)形成的阴离子结构多以含氧四面体形式存在，该结构与硫酸根离子相似，因此，在小肠吸收过程中，cr(ⅵ)可通过硫酸根离子通道被肠上皮细胞摄取吸收，进入胞内的cr(ⅵ)与胞内还原物质反应进一步被还原为cr(ⅲ)或者cr的中间价态(+4、+5价)同时生成活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)引起氧化应激，诱导细胞凋亡；其次，cr中间价态易与dna形成加合物导致染色体断裂发挥遗传毒性。在以上基本信息的基础上，应用本发明建立的检测体系对饮水暴露cr(ⅵ)的生物可及性、毒性效应进行检测和评估。

在参考饮用水中饮用水中cr(ⅵ)浓度数据，经实验考察，将cr(ⅵ)的不同浓度范围确定为0-20mg/l，设置的剂量组分别为：0，0.005，0.05，0.5，2，5，10，20mg/l。

体外消化过程：鉴于人体日常单次饮水或液体类流质食品的体积远大于唾液分泌体积，且与唾液接触时间较短，因此，体外消化过程可忽略不计口腔消化阶段的影响。但对于固态食物则需要考虑口腔内消化过程。胃内消化过程是cr(ⅵ)重要的解毒环节，胃内还原物质种类及浓度、胃液ph、消化时间是影响该过程的重要因素。参考健康人群禁食状态下胃液样本中还原物质种类及浓度数据，对infogest2.0体外消化方法中模拟胃液进行优化以模拟禁食状态，禁食状态的模拟胃液调节ph至1.8，包括的组分及其浓度：氯化钾6.9mm、磷酸二氢钾0.9mm、碳酸氢钠25mm、氯化钠47.2mm、六水合氯化镁0.12mm、碳酸铵0.5mm、盐酸15.6mm、二水合氯化钙0.15mm、胃蛋白酶2000u/ml、胃脂肪酶60u/ml、抗坏血酸175μm、谷胱甘肽18μm。为确保还原物质活性，需在消化开始前加入。为了模拟人体不同状态下胃液ph条件对cr(ⅵ)价态的影响，消化开始前用5m氢氧化钠将上述禁食状态的模拟胃液ph滴定至3(两餐之间)、5(饱腹状态)。考虑评估饮水中cr(ⅵ)，长期暴露引起小鼠小肠肿瘤的位置多发于近十二指肠段，故实施例四中胃消化时间定为2h，肠消化时间定为0.5h。

人小肠上皮细胞3d模型构建，参阅图1，细胞模型培养21天形成细胞单层厚度大于10μm，细胞表面附着有粘液层；参阅图2a-2c，反映的是人小肠上皮细胞3d模型的完整性、渗透性及分化程度随生长时间的变化曲线，培养21天后teer值大于300ω/cm²，渗透性papp低于5×10^-7cm/s，分化程度碱性磷酸酶比值ap/bl大于4，符合实验要求，构建成功。之后将消化液用细胞培养液稀释5-12倍加入ap，分别培养4、8、12、24h。模拟饮水暴露cr(ⅵ)消化过程之后作用于细胞单层4h，细胞模型损伤程度与暴露cr(ⅵ)剂量之间的关系示意图如图3所示。

cr价态主要是cr(ⅲ)和cr(ⅵ)，应用高效液相色谱法(hplc)结合电感耦合等离子体质谱(icp-ms)以钪(scandium，sc)为内标进行价态区分及定量检测，检出限为0.5μg/l。

参阅表2，饮水暴露0.005-20mg/l经过胃液消化后，当模拟胃液ph为1.8时，生物可及性为0.76±0.11％-43.01±3.22％，对应的消化后模拟胃液中cr(ⅵ)浓度为0.017μg/l-4.617mg/l；当模拟胃液ph为3时，生物可及性为18.58±2.31％-50.36±4.01％，对应的消化后模拟胃液中cr(ⅵ)浓度为0.407μg/l-5.430mg/l；当模拟胃液ph为5时，生物可及性为27.33±1.86％-66.67±2.59％，对应的消化后模拟胃液中cr(ⅵ)浓度为0.637μg/l-6.917mg/l。在相同ph的模拟胃液中，生物可及性和单位时间内还原的cr(ⅵ)的质量随饮水暴露cr(ⅵ)浓度升高而升高。同一暴露剂量下，随胃液酸度升高，由于模拟胃液中起主要还原作用的抗坏血酸活性抑制导致胃液cr(ⅵ)还原能力下降伴随生物可及性增加。

饮水暴露cr(ⅵ)与不同ph模拟胃液充分反应后与模拟肠液混匀反应0.5h，检测胃肠混合液内cr(ⅵ)浓度。参阅表2，当模拟胃液ph为1.8时，肠阶段生物可及性0.66±0.10％-40.31±2.02％，对应胃肠液内cr(ⅵ)浓度为0.007μg/l-2.114mg/l；当模拟胃液ph为3时，肠阶段生物可及性15.19±0.10％-47.82±1.99％，对应胃肠液内cr(ⅵ)浓度为0.189μg/l-2.487mg/l；当模拟胃液ph为5时，肠阶段生物可及性25.93±1.32％-57.67±3.33％，对应胃肠液内cr(ⅵ)浓度为0.308μg/l-3.046mg/l。胃消化结束后未消耗的还原物质与肠液混合，肠消化阶段可还原少量cr(ⅵ)，但还原速率相比胃消化阶段明显降低。ph＝5组胃消化后未消耗的还原物质浓度相比(ph＝1.8组、ph＝3组)较高，因此，ph＝5组肠消化阶段还原速率高于另外两组(尤其当暴露剂量高于5mg/l时最为明显)。

参阅表2，基于上述获得饮水暴露cr(ⅵ)的胃肠消化后的生物可及性估算健康个体每日每千克体重下待测化学物的吸收量，计算公式为：且cr(ⅵ)经口暴露为非致癌效应其潜在的暴露风险为吸收量(di)与参考剂量(rfd)的比值，计算公式为：参数赋值参考[中国人群暴露参数手册(成人卷)，2014年]，其中，ir为1850ml/day，ef为350days/year，ed为24years，bw为60.6kg，at为365*eddays，rfd为0.003mg/kg/day。当hq>1时，认为会对人体造成健康危害。饮水暴露0.005-20mg/l剂量的cr(ⅵ)对应的暴露风险为0-98.886，当人体饮水暴露cr(ⅵ)的剂量超过0.5mg/l时存在健康风险。

表2饮水暴露cr(ⅵ)生物可及性及暴露风险

胃肠消化过程对cr(ⅵ)生物可及性影响较大，cr(ⅵ)在肠内吸收呈剂量依赖性，当饮水暴露cr(ⅵ)剂量为0-20mg/l时，能够到达小肠腔内cr(ⅵ)浓度在0-6.917mg/l之间。由于消化液的渗透压相比细胞培养液较高，不能直接用消化液处理细胞以模拟肠道吸收过程。因此，增设一组模拟饮水暴露120mg/lcr(ⅵ)(cr(ⅵ)浓度远高于还原物质的还原能力)，经胃肠液消化后将ph调至6.8，检测其中cr(ⅵ)浓度。浓度确定后用细胞培养液稀释至0-20mg/l，再次检测稀释后溶液中cr(ⅵ)浓度，之后用于处理人小肠上皮细胞体外吸收模型。

细胞模型处理4h后，镜下可见，随着ap剂量增加，细胞单层完整性破坏，膜厚度降低，细胞排列疏松甚至脱落。检测细胞氧化应激状态，当暴露剂量大于5mg/l时细胞内ros明显升高。通过检测细胞模型ap、bl和细胞内的铬含量，建立小肠上皮细胞单层暴露剂量与cr(ⅵ)生物利用度的关系曲线，参阅图4。

现有技术多基于胃肠消化后生物可及性来估算暴露风险，忽略肠吸收过程导致风险被高估，在风险管理中会造成一定程度上资源浪费。因此，在本实施例中将人小肠上皮细胞体外吸收模型的生物利用度与胃肠消化后的生物可及性结合推算出经口暴露不同剂量cr(ⅵ)的生物利用度并计算暴露风险，结果参阅表3。应用基准剂量(benchmarkdose,bmd)软件建立模型，参阅图5、6。基于生物利用度计算饮水暴露0-20mg/l的暴露风险为0-51.23，当人体饮水暴露cr(ⅵ)的剂量超过2.000mg/l时存在健康风险。

表3饮水暴露cr(ⅵ)生物利用度及暴露风险

应用本发明建立经口暴露剂量与内剂量之间的关系，同时探究cr(ⅵ)生物利用度与人小肠上皮细胞单层屏障损伤以及细胞毒性之间的相关关系。为进一步利用转录组测序和计算毒理学分析毒性通路扰动与cr(ⅵ)暴露的剂量-反应关系，构建cr(ⅵ)外暴露剂量与靶器官剂量外推模型奠定基础，为利用体外实验数据进行化学物的暴露风险预测提供了有力的分析手段。

与现有文献报道数据进行比较：实施例四中cr(ⅵ)生物可及性受体外消化过程中胃内还原物质种类及浓度影响明显，检测了优化后模拟胃液对cr(ⅵ)的还原能力，对cr(ⅵ)的最大还原能力为12.34mg/l，与现有文献报道的成人胃液还原能力8.4±4.7mg/l进行比较，在此范围内。

开展动物实验进行体内验证：选择sd大鼠和c57bl/6小鼠作为研究对象，每组10只，雌雄各半。选择重铬酸钾进行染毒，剂量设置根据细胞实验获得bmd10剂量范围上下各选择1个剂量(10倍剂量)，以灌胃方式进行重复剂量染毒21天。染毒结束后，收集大小鼠的血液、尿液样本，采集小肠、肝肾组织等检测铬的含量，探究铬在体内吸收分布及利用率，与本发明的检测和评估结果相符。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。