一种检测保健酒中有效成分含量的方法与流程

本发明属于保健酒检测领域，具体涉及一种检测保健酒中有效成分含量的方法。

背景技术：

保健酒属于配制酒，是一种以蒸馏酒、发酵酒或食用酒精为酒基，以食用或药食两用的辅料或食品添加剂，进行调配、混合或再加工制成的、已改变了其原酒风格的饮料酒。保健酒对人体具有保健功能，它适用于特定人群食用，有调节机体功能，但不以治疗为目的。

保健酒中通常包括芳樟醇、樟脑、肉桂醛、乙酸龙脑酯、丁香酚、藁本内酯等有效成分，有效成分的具体含量是保健酒质量评价的重要指标之一，但目前保健酒行业还未有相关的有效成分标准测定方法。

与药材中有效成分的检测相比，保健酒中有效成分的检测难度明显增加。药材不存在有机溶剂干扰，可以直接采用极性匹配的有机溶剂进行提取后再检测含量，方法简单。但是保健酒中含有大量的乙醇与水，有效成分已溶解于这个溶剂体系，乙醇与水都属于膨胀系数很大的溶剂，尤其是水根本不能直接上质谱，因此必须采用合适的溶剂置换乙醇与水体系，有效成分在溶剂置换过程中存在分配问题，置换溶剂不可能将有效成分完全提取过来；另外，保健酒中一般含糖、色素等大分子化合物，这些物质也会影响溶剂的置换效率。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种检测保健酒中有效成分含量的方法。

本发明提供一种检测保健酒中有效成分含量的方法，包括：采用气相色谱质谱联用仪进行检测，基于标准曲线法计算获得有效成分的含量；

其中样品的前处理具体包括：将待测保健酒样品与有效成分的同位素内标物和水混合，加入氯化钠至溶液饱和，再用有机溶剂进行提取，得到样品溶液。

本发明针对保健酒中的有效成分，采用气相色谱质谱联用仪进行分析检测，不存在气相色谱检测易出现鬼峰、响应值小、干扰大，无法准确定量的问题，也不会出现液相色谱法分离度差的问题，采用气相色谱质谱联用，通过选择特征离子峰进行定量，结果更快速准确。

本发明在样品前处理时采用有效成分的同位素作为内标物，其与待测有效成分性质及分配系数基本一致，以其为对照标准，可以减小检测误差。另外，通过加水稀释体系中乙醇浓度，再加氯化钠使乙醇水溶液饱和，提高水溶液的极性，促使有效成分向提取剂中转移，提高提取效率；而且其中采用了液液微萃取的方法，仅使用很少量的有机溶剂进行提取，大幅降低有机溶剂的使用量，降低成本以及减少对环境的污染。

进一步地，所述有机溶剂为乙醚。使用乙醚的提取效果和上机检测效果都是比较好的，检测结果更准确。

进一步地，所述待测保健酒样品、所述同位素内标物和水的用量比为3～5ml:5～10μg:5～20ml；所述待测保健酒样品与乙醚的体积比为2:1。

进一步地，其中标准溶液的配制具体包括：将与所述待测保健酒样品对应的酒基、水、白砂糖和焦糖色素混合，制备得到酒精度、含糖量和透光率与所述待测保健酒样品一致的基准模拟液；

以所述基准模拟液为溶剂，溶解有效成分标准品，所得溶液按照所述待测保健酒样品处理得到所述样品溶液的方法进行处理，得到标准溶液。

本发明采用与待测保健酒样品一样的溶剂体系来配制标准溶液，有利于消除基质效应，减小误差。

进一步地，建立标准曲线时，以所述标准溶液中有效成分与内标物的色谱峰面积比为纵坐标，以所述标准溶液中有效成分与内标物的浓度比为横坐标。

进一步地，所述有效成分为芳樟醇、樟脑、肉桂醛、乙酸龙脑酯、丁香酚和藁本内酯中的一种或多种。

本发明涉及的保健酒包括市面上常见的保健酒，例如劲酒、椰岛鹿龟酒等。本发明的方法可以检测保健酒中的一种有效成分，也可以同时检测多种有效成分。优选地，检测上述6种有效成分中的一种或多种时，效果更好，即检测重复性好、灵敏度高、结果更准确。

当所述有效成分为一种时，所述同位素内标物优选为该有效成分对应的同位素；当所述有效成分为多种时，所述同位素内标物优选为丁香酚同位素，兼顾了试剂来源以及检测结果准确性。

进一步地，所述丁香酚同位素为丁香酚-d3，即氘代丁香酚。

进一步地，其中气相色谱检测条件包括：

色谱柱固定相为(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷，优选为30m×0.25mm(内径)×0.25μm(膜厚)或性能相当色谱柱；进样口温度为280℃，分流比为10:1，恒流模式，流速为1.5ml/min，进样量1μl；载气为高纯氦气，纯度≥99.999％；柱温初温为50℃，保持5min，以3.5℃/min升至180℃，再以30℃/min升至320℃，保持10min。

进一步地，其中质谱检测条件包括：

电离模式：电子轰击源，能量为70ev；四极杆温度：150℃；离子源温度：230℃；溶剂延迟：5min；检测方式：选择离子扫描采集。

在本发明一个优选实施方式中，所述方法具体包括：

a.将待测保健酒样品、丁香酚-d3和水按照3～5ml:5～10μg:5～20ml比例混合，得到混合溶液，向其中加入氯化钠至饱和，然后用乙醚进行提取，乙醚体积为所述待测保健酒样品体积的一半，离心分离收集上层清液，得到样品溶液；

b.将与所述待测保健酒样品对应的酒基、水、白砂糖和焦糖色素混合，制备得到酒精度、含糖量和透光率与所述待测保健酒样品一致的基准模拟液；以所述基准模拟液为溶剂，溶解有效成分标准品，所得溶液按照上述步骤a处理，得到标准溶液；

c.将上述步骤a得到的样品溶液和上述步骤b得到的标准溶液分别进行气相色谱质谱联用检测分析；

d.以标准溶液中有效成分与丁香酚-d3的色谱峰面积比为纵坐标、有效成分与丁香酚-d3的浓度比为横坐标，建立标准曲线；

e.将测得的样品溶液中有效成分与丁香酚-d3的色谱峰面积比代入标准曲线，计算出所述待测保健酒样品中有效成分的含量。

进一步地，离心分离时，以8000～10000rpm的转速离心7～10min。

本发明的有益效果：

本发明采用气相色谱质谱联用仪进行检测，以有效成分的同位素作为内标物，并对样品前处理进行了改进，可以有效减小误差，保证检测结果的准确性。本发明的方法能够同时检测保健酒中多种有效成分，检出限为11.73μg/l～75.75μg/l，具有适用范围广、操作简便、检测限低、准确度高的优点。

附图说明

图1为实施例1中6种有效成分混合标准溶液及内标物溶液的质谱图；

图2为实施例1中芳樟醇标准曲线图；

图3为实施例1中樟脑标准曲线图；

图4为实施例1中肉桂醛标准曲线图；

图5为实施例1中乙酸龙脑酯标准曲线图；

图6为实施例1中丁香酚标准曲线图；

图7为实施例1中藁本内酯标准曲线图；

图8为实施例1中保健酒待测样品(1)的质谱图；

图9为实施例1中保健酒待测样品(1)回收率实验的质谱图；

图10为实施例2中保健酒待测样品(2)的质谱图；

图11为实施例3中保健酒待测样品(3)的质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种检测保健酒中有效成分(包括芳樟醇、樟脑、肉桂醛、乙酸龙脑酯、丁香酚、藁本内酯)含量的方法，具体如下：

1.试剂

1.1无水乙醇、乙醚：色谱纯；

1.2白砂糖、焦糖色素：食品级。

2.待测样品及标准品

待测样品(1)：中国劲酒，酒精度35％(v/v)，透光率为60％，由劲牌有限公司提供；

芳樟醇、樟脑、肉桂醛、乙酸龙脑酯、丁香酚、藁本内酯标准品：纯度大于97.8％，购于中国食品药品检定研究院；

丁香酚-d3标准品：纯度大于98.8％，购于trccanada。

3.标准溶液配制

3.1配制有效成分单标储备液：各称取上述6种有效成分标准品适量于10ml容量瓶中，用无水乙醇溶解定容至刻度，得到6种有效成分的单标储备液，-20℃保存，具体浓度见表1。

3.2配制基准模拟液：吸取酒精度为50％(v/v)的保健酒酒基70ml于100ml容量瓶中，加入白砂糖6g，振摇使溶解，用水定容至刻度，加入焦糖色素调整透光率为60％，使其酒精度、含糖量和透光率与待测样品(1)一致，4℃保存。

3.3配制有效成分混合标准溶液：吸取各种有效成分的单标储备液，用基准模拟液定容至10ml，-20℃保存，具体浓度见表1。

3.4配制内标液：称取丁香酚-d34mg，用无水乙醇溶解定容至10ml，得400mg/l的丁香酚-d3内标液，-20℃保存。

表16种有效成分的单标浓度及混标浓度

4.样品处理过程

移取待测样品(1)4ml于50ml离心管中，加入丁香酚-d3内标液20μl，再加水10ml，加入氯化钠4g，超声溶解至饱和，加入乙醚2ml，涡旋振荡提取1min后，以8000r/min离心5min，吸出上层清液1ml(即样品溶液)于样品瓶中，待gc/ms分析。

5.样品测定

5.1仪器条件

安捷伦7890-5977b气相色谱-质谱仪。

5.1.1气相色谱条件

色谱柱固定相为(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm(内径)×0.25μm(膜厚)或性能相当色谱柱；进样口温度为280℃，分流比为10:1，恒流模式，流速为1.5ml/min，进样量1μl；载气为高纯氦气，纯度≥99.999％；柱温初温为50℃，保持5min，以3.5℃/min升至180℃，再以30℃/min升至320℃，保持10min。

5.1.2质谱条件

离子源为ei源，能量为70ev；四极杆温度为150℃；离子源温度为230℃；溶剂延迟为5min。检测方式为选择离子扫描采集；监测离子见表2。

先采用全扫描模式(scan)进行定性分析，对仪器参数进行优化，确定各有效成分与内标物的保留时间及特征离子，然后对化合物进行分组，采用选择离子模式(sim)扫描检测，具体如表2所示。

本实施例中6种有效成分混合标准溶液及内标溶液的质谱图如图1所示。

表26种有效成分及内标物气相色谱-质谱参数

备注：表2中*指定量离子。

5.2标准曲线的制作

取6个10ml容量瓶，分别吸取3.3中有效成分混合标准溶液50μl、100μl、200μl、500μl、1000μl、2000μl，用3.2中基准模拟液定容至刻度，临用时配制。

分别移取上述配制的溶液4ml于50ml离心管中，加入丁香酚-d3内标液20μl，加入水10ml，加入氯化钠4g，超声溶解，加入乙醚2ml，涡旋振荡提取1min后，以8000r/min离心5min，吸出上清液1ml于样品瓶中，供gc/ms分析后分别以有效成分与内标物的峰面积比为纵坐标，有效成分与内标物的浓度比为横坐标制作标准曲线，6种有效成分标准曲线参数见表3，6种有效成分标准曲线图如图2-7所示。

表36种有效成分标准曲线参数

5.3测定

将样品溶液与标准溶液在同一检测条件下进行测定，结果待测样品(1)的质谱图如图8所示，将其中有效成分的峰面积ai与丁香酚-d3的峰面积af代入标准曲线，计算试样中相应有效成分的含量xi。

5.4计算

试样中6种有效成分含量按式(1)计算

式中：

xi---试样中第i种有效成分的含量，单位为毫克每升或毫克每千克(mg/l或mg/kg)；

xf---试样中丁香酚-d3的含量，单位为毫克每升或毫克每千克(mg/l或mg/kg)；

ai---试样中第i种有效成分的色谱峰面积；

af---试样中丁香酚-d3的色谱峰面积；

b---标准曲线的截距值；

k---标准曲线的斜率。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留至小数点后3位。

6.重复性实验

取待测样品(1)共6份，标记为c-1～c-6，按上述方法处理样品溶液，测定有效成分含量，并计算6种有效成分测定结果重复性，rsd值均小于10％，表明方法重复性良好，具体计算结果如表4所示。

表46种有效成分重复性实验数据结果

7.检测限(lod)和定量限(loq)

检测限(lod)为信号强度(s)/基线噪声(n)＝3:1时对应的样品浓度；

定量限(loq)为信号强度(s)/基线噪声(n)＝10:1时对应的样品浓度。

本实施例中6种有效成分检出限(lod)为11.73μg/l～75.75μg/l，定量限(loq)为39.10μg/l～252.50μg/l，具体计算结果如表5所示。

表56种有效成分检测限(lod)及定量限(loq)计算结果

8.回收率实验过程

准确吸取4ml待测样品(1)于50ml离心管中，共6份，分别标记为r1-1和r1-2、r2-1和r2-2、r3-1和r3-2；

取3.3中有效成分混合标准溶液，分别向r1-1和r1-2中加入0.05ml，向r2-1和r2-2中加入0.1ml，向r3-1和r3-2中加入0.2ml；

再各加入丁香酚-d3内标物液20μl，加入水10ml，加入氯化钠4g，超声溶解，加入乙醚2ml，涡旋振荡提取1min后，以8000r/min离心5min，吸出上层清液1ml至样品瓶，待gc/ms分析，待测样品(1)回收率实验的质谱图如图9所示。

将有效成分与内标物的峰面积代入标准曲线，计算各有效成分的含量及回收率，6种有效成分的回收率均大于85％，rsd值均小于5％，表明本方法准确度良好，具体计算结果如表6所示。

表66种有效成分检测结果及回收率

实施例2

本实施例提供一种检测保健酒中有效成分(包括芳樟醇、樟脑、肉桂醛、乙酸龙脑酯、丁香酚、藁本内酯)含量的方法，具体如下：

1.试剂：与实施例1相同。

2.待测样品(2)：金标劲酒，酒精度为38％(v/v)，透光率为70％，由劲牌有限公司提供。

3.基准模拟液：吸取酒精度为50％(v/v)保健酒酒基76ml于100ml容量瓶中，加入白砂糖0.3g，振摇使溶解，用水定容至刻度，加入焦糖色素调整透光率为70％，使其酒精度、总糖量和透光率与待测样品(2)一致，4℃保存。

4.样品处理过程：准确吸取待测样品4ml于50ml离心管中，加入丁香酚-d3内标液20μl，加水11ml，加入氯化钠4g，超声溶解，加入乙醚2ml，涡旋振荡提取1min后，以8000r/min离心5min，吸出上层清液1ml至样品瓶待gc/ms分析。

5.标准曲线的绘制：同实施例1。

6.样品测定：测定条件及方法与实施例1相同，所得待测样品(2)的质谱图如图10所示，将有效成分与内标物的峰面积代入标准曲线，计算得到各有效成分的含量，本实施例待测样品(2)中6种有效成分计算结果如表7所示。

表7待测样品(2)中6种有效成分检测结果

实施例3

本实施例提供一种检测保健酒中有效成分(包括芳樟醇、樟脑、肉桂醛、乙酸龙脑酯、丁香酚、藁本内酯)含量的方法，具体如下：

1.试剂：与实施例1相同。

2.待测样品(3)：致中和，酒精度为38％(v/v)，透光率为65％，浙江致中和酒业公司提供。

3.基准模拟液的配制：吸取酒精度为50％(v/v)保健酒酒基76ml于100ml容量瓶中，加入白砂糖11g，振摇使溶解，用水定容至刻度，加入焦糖色素调整透光率为65％，4℃保存。

4.样品处理过程：准确吸取待测样品4ml于50ml离心管中，加入丁香酚-d3内标液20μl，加水11ml，加入氯化钠4g，超声溶解，加入乙醚2ml，涡旋振荡提取1min后，以8000r/min离心5min，吸出上层清液1ml至样品瓶待gc/ms分析。

5.标准曲线的绘制：同实施例1。

6.样品测定：测定条件及方法与实施例1相同，所得待测样品(3)的质谱图如图11所示，将有效成分与内标物的峰面积代入标准曲线，计算得到各有效成分的含量，本实施例待测样品(3)中6种有效成分计算结果如表8所示。

表8待测样品(3)中6种有效成分检测结果

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。