直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法与流程

本发明涉及蛋氨酸亚砜的检测方法，具体涉及一种直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法。
背景技术：
：复方氨基酸注射液处方中含有甲硫氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸等几种到几十种氨基酸，其作为重要的肠外营养药，广泛应用于临床，满足患者体内氨基酸需要。其中，甲硫氨酸作为人体内必需氨基酸，因其结构中含有巯基，易被氧化降解成蛋氨酸亚砜，对人体健康有害。蛋氨酸亚砜的结构式如下：蛋氨酸亚砜因复方氨基酸类产品处方成分较复杂，并且大多数成分结构近似，很容易干扰蛋氨酸亚砜的测定。目前可检索到的方法大多采用柱前衍生或柱后衍生法进行检测，或使用离子对试剂梯度洗脱方式检测，对实验人员的操作要求较高，色谱柱的损伤较大，因此，需建立一种专属性强、简便可行的检测方法，用于控制复方氨基酸产品中蛋氨酸亚砜的含量。技术实现要素：针对以上不足，本发明的目的是提供一种直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，无需衍生化前处理，流动相采用常见溶剂，色谱柱的使用寿命长，具有准确、简便、专属性强、灵敏度高、重复性好的特点。本发明所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，包括如下步骤：(1)配制蛋氨酸亚砜对照品溶液；(2)将对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标构建标准曲线；(3)配制供试品溶液；(4)将供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算蛋氨酸亚砜的含量；其中，液相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱：采用氨基键合硅胶色谱柱；流动相：磷酸水-乙腈体系；洗脱方式：等度洗脱；流速：0.65-0.75ml/min；检测波长：210nm；柱温：30-40℃；进样量：5-100μl。其中：优选地，所述的氨基键合硅胶色谱柱选自hichrom氨基柱、thermohypersil氨基柱、月旭ultimatexb氨基柱、merckpurospherstar氨基柱、mercklichrospher氨基柱、phenomenexluna氨基柱、岛津inertsil氨基柱、cosmosil氨基柱、ymc-pack氨基柱、agilentzorbax氨基柱、watersspherisorb氨基柱或shiseidocapcellpak氨基柱中的一种。所述的色谱柱长度为250mm、150mm、100mm或80mm。所述的流动相中，磷酸水的ph为2.7-2.9，优选2.8。所述的流动相中，磷酸水与乙腈的体积比为30-36:70-64，优选33:67。优选地，所述的流速为：0.7ml/min。优选地，所述的柱温为：35℃。优选地，所述的进样量：20μl。所述的供试品溶液的配制方法为：精密量取复方氨基酸注射液，加流动相稀释制成含甲硫氨酸0.1-1.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液。所述的对照品溶液的配制方法为：精密称取蛋氨酸亚砜适量，加流动相溶解并定量稀释制成约含5μg/ml的溶液，作为对照品溶液。与现有技术相比，本发明的有益效果如下：1、本发明提供的方法专属性强、灵敏度高、重复性好，解决了处方中其他氨基酸成分干扰的技术难题。2、本发明采用的流动相为常见的磷酸水和乙腈体系，无其他离子对试剂或缓冲盐，能较大程度的延长色谱柱的使用寿命，大大降低成本。3、本发明提供的方法操作简便、准确性高，无需衍生化前处理，避免了其他检测方法中采用氨基酸衍生程序测定导致测定结果不准确、平行性差等问题，保证了复方氨基酸类产品的质量。附图说明图1为本发明的阴性空白溶液的hplc图；图2为本发明的蛋氨酸亚砜对照品溶液的hplc图；图3为本发明的供试品溶液的hplc图；图4为本发明的加标供试品溶液的hplc图。具体实施方式以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不仅仅局限于下述实施例。实施例11、色谱条件色谱柱：hichrom氨基柱(250×4.6mm，5μm)，检测波长：210nm，流速0.7ml/min，柱温：35℃，进样量20μl。2、溶液制备2.1流动相：水(用磷酸调节ph值至2.8)-乙腈(33：67)。2.2供试品溶液：精密量取复方氨基酸注射液，加流动相稀释制成含甲硫氨酸0.56mg/ml的溶液，作为供试品溶液。2.3对照品溶液：精密称取蛋氨酸亚砜适量，加流动相溶解并定量稀释制成约含5μg/ml的溶液，作为对照品溶液。3、测定方法精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。(1)专属性试验阴性空白溶液的制备：按制剂处方量配制不含甲硫氨酸的溶液，作为空白辅料溶液。从中取2ml，用流动相稀释定容至20ml。未破坏样品的制备：取供试样品2ml，用流动相稀释定容至20ml。酸破坏样品的制备：取供试样品2ml，加入1mol/l盐酸0.2ml，加水10ml，水浴加热2h，加入1mol/l氢氧化钠溶液中和，流动相定容至20ml。碱破坏样品的制备：取供试样品2ml，加入1mol/l氢氧化钠溶液0.2ml，加水10ml，水浴加热2h，加入1mol/l盐酸中和，流动相定容至20ml。氧化样品的制备：取供试样品2ml，加入30％过氧化氢0.2ml，加水10ml，水浴加热2h，流动相定容至20ml。高温样品的制备：取供试样品2ml，加水10ml，水浴加热2h，流动相定容至20ml。光照样品的制备：取光照24h(光照度约5000lx、近紫外能量约100μw/cm2)的供试样品2ml，流动相定容至20ml。分别取上述样品，依法检验，结果见表1。表1蛋氨酸亚砜强制降解试验结果汇总样品名称蛋氨酸亚砜峰面积结果未破坏11029——酸13588蛋氨酸亚砜含量基本无变化，与相邻峰的分离良好碱13914蛋氨酸亚砜含量基本无变化，与相邻峰的分离良好氧化98144蛋氨酸亚砜含量明显升高，与相邻峰的分离良好高温13248蛋氨酸亚砜含量基本无变化，与相邻峰的分离良好光照10803蛋氨酸亚砜含量基本无变化，与相邻峰的分离良好结论：阴性空白溶液不影响蛋氨酸亚砜的检测，在酸、碱、氧化、高温、光照降解试验色谱图中，蛋氨酸亚砜峰与相邻峰之间分离度均符合要求；酸、碱、高温、光照降解试验中，蛋氨酸亚砜含量基本无变化；氧化降解试验蛋氨酸亚砜含量升高很多。由此可见，甲硫氨酸对氧敏感，易降解为蛋氨酸亚砜。(2)定量限取已知浓度的蛋氨酸亚砜对照品溶液，逐级稀释。计算蛋氨酸亚砜峰的信号峰高与基线噪音的比值，即s/n值，s/n在8-12时对应的浓度即为其定量限浓度，平行配制6份定量限浓度溶液，依法检测，记录色谱图，蛋氨酸亚砜峰面积的rsd应不大于5.0％。结果见表2。表2蛋氨酸亚砜的定量限测定结果结论：蛋氨酸亚砜的定量限为0.3690μg/ml，rsd符合要求。(3)线性范围取蛋氨酸亚砜对照品适量，用流动相溶解并定量稀释制成0.3690、1.9681、3.9362、4.9230、5.9040μg/ml的溶液，作为线性溶液1-5。分别取上述样品，依法检验，以蛋氨酸亚砜的浓度c(μg/ml)为横坐标，峰面积a为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程。结果见表3。表3蛋氨酸亚砜线性测定结果浓度(μg/ml)峰面积0.369044441.9681218633.9362435904.9230548415.904065080线性方程：a＝11002c+336.61相关系数：0.9999结论：蛋氨酸亚砜在0.3690-5.9040μg/ml范围，线性关系良好，线性相关系数r为0.9999，符合要求。(4)精密度取蛋氨酸亚砜对照品适量，加入供试样品中，加流动相溶解并稀释制成一定浓度的加标供试品溶液，平行制备6份，依法检验，要求6次测定结果的rsd≤3.0％，以证实方法具有良好的精密度，结果见表4。表4蛋氨酸亚砜检查精密度测定结果溶液序号蛋氨酸亚砜(mg/l)164.1264.4363.8464.0563.7663.7rsd(n＝6)0.43结论：精密度6次测定结果，蛋氨酸亚砜含量的rsd小于3.0％，符合要求。(5)准确度在供试样品中加入定量限、60％、80％、100％不同限度浓度的蛋氨酸亚砜，测定回收率所得。要求回收率在90-108％之间，以证实该方法具有良好的准确度，结果见表5。表5蛋氨酸亚砜回收率测试结果结论：蛋氨酸亚砜回收率在92.59-99.35％之间，符合要求。(6)溶液稳定性考察蛋氨酸亚砜对照品溶液与供试品溶液随时间的变化规律，对照品溶液与供试品溶液室温放置0、3、6、12、18、24h，依法检测。要求对照品溶液与供试品溶液中蛋氨酸亚砜峰面积的rsd≤10.0％，结果见表6。表6蛋氨酸亚砜溶液稳定性试验结果时间(h)对照品溶液供试品溶液052694692193526996871465250468447125249968915185269969276245277669368rsd％0.220.52结论：对照品溶液与供试品溶液室温放置24h内，蛋氨酸亚砜峰面积的rsd小于10.0％，溶液稳定性良好。(7)耐用性通过改变不同的柱温、流速、流动相比例及ph值、更换不同品牌色谱柱等来评估测定条件参数有微小变动时，测定结果的影响程度，结果见表7。表7蛋氨酸亚砜耐用性试验结果结论：柱温30-40℃、流速0.65-0.75ml/min、流动相ph值2.7-2.9、流动相比例30-36:70-64之间、更换不同品牌色谱柱，蛋氨酸亚砜含量的rsd均符合要求。以上所述仅为本发明的优选实施例，对于熟悉本领域的技术人员，在本发明的基础上，依然可以进行一定程度的方法优化，因此凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12