一种检测赖氨酸的MOF-Cd探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及氨基酸检测技术领域，具体地说是涉及一种检测赖氨酸的mof-cd探针及其制备方法和应用。

背景技术：

在生物体中氨基酸是不可缺少的成分，生物体的生长和发育过程都离不开氨基酸。在某些疾病的检测方面，就可以直接检测氨基酸的含量。例如组氨酸(his)除了是人类生长所必需的氨基酸外，它还是神经递质和哺乳动物中金属传递的调节剂。哮喘和晚期肝硬化会导致富含组氨酸的蛋白质水平异常；天冬氨酸(asp)是人类生长的内源性氨基酸，细胞中一定量的天冬氨酸是细胞增殖过程和呼吸所必需的。因此检测天冬氨酸的异常水平可以用作肿瘤的早期诊断。

传统检测氨基酸的方法如：光谱分析法、高效液相色谱法和电化学方法等，具有成本高、时间长、测试复杂等缺点。近些年来，科研工作者开始研究使用mofs作为荧光探针特异性检测氨基酸。lee科研组报道了基于碘化铜（i）簇的荧光金属有机骨架(lmof)，分散在水中的lmof对cys的选择性超过其他氨基酸，计算得出ksv的值为6.128×10²m^-1(r=0.9914)（jilee,huiyeongju,jonghwajung,mariikeda,yoichihabata,andshimsunglee，conventionalandmechanochemicalsynthesesofcopper(i)iodideluminescentmofwithbis(amidoquinoline)anditsapplicationforthedetectionofaminoacidinaqueoussolution[j].inorg.chem.,2019,58,1177-1183）。虽然有出色的选择性，但是其识别过程是基于荧光淬灭的，与完全明亮信号的降低相比，明亮的信号在完全黑暗的环境下的出现更易于检测，因此开发基于荧光增强检测氨基酸的荧光探针十分重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测赖氨酸的mof-cd探针及其制备方法和应用，以提供一种可以在水中通过荧光增强识别lys并且具有低检测限和高选择性的检测方法。

本发明采用的技术方案是：一种检测赖氨酸的mof-cd探针，其特征是，所述mof-cd探针是以四（4-咪唑基苯基）乙烯作为配体，利用cd(no3)•4h2o作为金属节点构建而成，mof-cd探针的制备工艺包括以下步骤：

（a）分别称取四（4-碘苯基）乙烯、咪唑、无水碳酸钾、无水硫酸铜为原料，并将原料混合后加入到耐高压反应管中，在氮气保护下，于180-190℃沙浴无溶剂反应11-13h，其中，各原料摩尔比为：四（4-碘苯基）乙烯∶咪唑∶无水碳酸钾∶无水硫酸铜=2∶38-42∶10-12∶0.07-0.09；

（b）反应后降至室温，所得固体用蒸馏水进行洗涤，干燥后用二氯甲烷溶解，然后利用柱层析技术分离得到纯品，将纯品于45-55℃条件下真空干燥过夜，得到白色的配体tipe；

（c）称取配体tipe和cd(no3)•4h2o于玻璃瓶中，其中，配体tipe与cd(no3)•4h2o的质量比为1∶8-12，向玻璃瓶中加入dmf、水和质量浓度为25%的氨水并混合均匀，其中，配体tipe∶dmf∶水∶氨水=3mg∶2-4ml∶0.5-2ml∶0.5-2ml，之后放入烘箱中，程序升温10-14h至75-85℃，恒温孵育45-52h，程序降温65-78h至20-30℃，得到淡黄色长方体晶体，即为mof-cd探针。

步骤（a）中，所述无水碳酸钾需研磨成粉末状。

步骤（b）中，柱层析的固定相为硅胶gf254，流动相为体积比为10∶1的二氯甲烷/甲醇混合液，洗脱液经减压蒸除溶剂后得到纯品。

一种检测赖氨酸的mof-cd探针的制备方法，包括以下步骤：

（a）分别称取四（4-碘苯基）乙烯、咪唑、无水碳酸钾、无水硫酸铜为原料，并将原料混合后加入到耐高压反应管中，在氮气保护下，于180-190℃沙浴无溶剂反应11-13h，其中，各原料摩尔比为：四（4-碘苯基）乙烯∶咪唑∶无水碳酸钾∶无水硫酸铜=2∶38-42∶10-12∶0.07-0.09；

（b）反应后降至室温，所得固体用蒸馏水进行洗涤，干燥后用二氯甲烷溶解，然后利用柱层析技术分离得到纯品，将纯品于45-55℃条件下真空干燥过夜，得到白色的配体tipe；

（c）称取配体tipe和cd(no3)•4h2o于玻璃瓶中，其中，配体tipe与cd(no3)•4h2o的质量比为1∶8-12，向玻璃瓶中加入dmf、水和质量浓度为25%的氨水并混合均匀，其中，配体tipe∶dmf∶水∶氨水=3mg∶2-4ml∶0.5-2ml∶0.5-2ml，之后放入烘箱中，程序升温10-14h至75-85℃，恒温孵育45-52h，程序降温65-78h至20-30℃，得到淡黄色长方体晶体，即为mof-cd探针。

步骤（a）中，所述无水碳酸钾需研磨成粉末状。

步骤（b）中，柱层析的固定相为硅胶gf254，流动相为体积比为10∶1的二氯甲烷/甲醇混合液，洗脱液经减压蒸除溶剂后得到纯品。

上述的mof-cd探针在水中检测赖氨酸中的应用。

mof-cd探针在水中的荧光强度在0-5.66μm浓度范围内随赖氨酸浓度的增大而增强，mof-cd探针识别赖氨酸的检测限是200nm。

本发明可以在水中对分析物进行检测，其通过荧光增强的响应方式检测分析物，具有高选择性、高灵敏度、高稳定性的优点。本发明可以在其他七种人体必须氨基酸的干扰下，检测水中的赖氨酸(lys)含量，检测限为200nm，检测效果不受其他氨基酸影响。

附图说明

图1：(a)mof-cd的不对称结构单元示意图；(b)沿y轴方向晶体堆积图。

图2：mof-cd的pxrd图。

图3：在八种人体必备的氨基酸中，mof-cd对lys的选择性识别结果图。

图4：lys的荧光滴定图。

图5：mof-cd的荧光变化随lys浓度的标准曲线图。

图6：在其他七种人体必须氨基酸存在的条件下，mof-cd对lys的荧光变化图（箱形：未加入lys；柱形：加入lys）。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明，实施例中未提及的试剂和操作均按本领域的常规操作实施。

实施例1制备mof-cd探针

首先合成配体tipe：将化合物四（4-碘苯基）乙烯(1.67g，2.00mmol)、咪唑(2.70g，40.00mmol)、研磨呈粉末状的无水碳酸钾(1.52g，11.00mmol)、无水硫酸铜(0.02g，0.08mmol)加入到耐高压反应管中，在氮气保护条件下，于185℃沙浴无溶剂反应12h。之后降到室温，所得固体用蒸馏水洗涤三次，干燥后用二氯甲烷溶解，然后利用柱层析技术（固定相为硅胶gf254，流动相为二氯甲烷/甲醇10∶1）淋洗分离，减压蒸除溶剂后得到纯品，将纯品在50℃真空干燥过夜，得到白色配体tipe。

称取配体tipe(3mg，0.005mmol)和cd(no3)·4h2o(30mg，0.097mmol)，装进10ml透明小玻璃瓶中，之后加入2mldmf，0.5ml水和0.5ml25%的氨水。将玻璃瓶放入烘箱中，程序升温12h至80℃，恒温孵育48h，程序降温72h至25℃，得到淡黄色长方体晶体，即为mof-cd探针，对所得mof-cd探针进行分析，如图1和图2所示，图1为所得到的mof-cd的结构，图2为mof-cd的pxrd图。

实施例2：mof-cd作为荧光探针对lys的检测

本实施例中利用缬氨酸(val)、异亮氨酸(ile)、苏氨酸(thr)、赖氨酸(lys)、甲硫氨酸(met)、色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)、亮氨酸(leu)这八种人体必需的氨基酸，将所合成的mof-cd溶液对lys进行选择性检测。

称取研细的mof-cd晶体粉末20mg，加入到100ml蒸馏水中，超声1h后静置过夜，得到mof-cd浓度为0.2mg/ml的悬浊液，然后配置各氨基酸储备液，浓度均为10-4m。

用移液器取1.8ml的mof-cd溶液，然后分别加入缬氨酸(val)、异亮氨酸(ile)、苏氨酸(thr)、赖氨酸(lys)、甲硫氨酸(met)、色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)以及亮氨酸(leu)这八种人体必需的氨基酸水溶液，八种必需氨基酸的加入量均为200μl，分别检测荧光强度，每种氨基酸做若干个平行试验，最终结果见图3，图3中lys对mof-cd溶液的荧光有明显的增强。

在mof-cd溶液中，随着lys的加入，mof-cd溶液中的分析物浓度逐渐增大，荧光逐渐增强。如图4所示，当加入120ul(5.56um)的lys时的荧光强度和加入100ul(4.74um)lys的荧光强度基本相同，荧光不再继续增强。如图5所示，在0-5.66μm终浓度范围内绘制出i0-i与lys浓度之间的关系图，回归线性方程为：y=162176.273x-25337.835，发现二者具有良好的线性关系，根据检测限公式(3σ/k)计算得出mof-cd识别lys的检测限是200nm。

在1.6ml的mof-cd溶液中，分别加入200μl其它七种人体必需的氨基酸（缬氨酸(val)、异亮氨酸(ile)、苏氨酸(thr)、甲硫氨酸(met)、色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)以及亮氨酸(leu)），再加入200μl赖氨酸(lys)，这样使得其存在lys的情况下同时也存在其它氨基酸。图6为在其他七种人体必需氨基酸存在的条件下，加入lys后，mof-cd溶液的荧光仍然增强，说明其它七种人体必需氨基酸没有干扰对lys的检测。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述内容加以更改或变换，而所有的这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。