基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法与流程

本发明涉及分析检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法。

背景技术：

脂肪酸(fattyacid,fa)是一类具有脂肪链的羧酸类化合物。根据脂肪族链的长度，脂肪酸可分为：短链脂肪酸(scfas，≤6碳原子)、中链脂肪酸(mcfas，7-12碳原子)、长链脂肪酸(lcfas，13-21碳原子)和超长链脂肪酸(vlcfas，≥22碳原子)。根据是否含碳碳双键分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。脂肪酸在生物体内起着多种关键作用：(1)脂肪酸是构成生物膜的各种功能脂质分子的重要组成部分；(2)脂肪酸可以β-氧化供能，是机体最重要的能量供应物质之一；(3)脂肪酸参与分子信号传导并调节其进程；(4)脂肪酸与肿瘤，糖尿病、心脏病、代谢综合征和药物性肝损伤(dili)等疾病密切相关。所以对脂肪酸进行有效综合分析对相关疾病发病机制的阐明和临床诊疗具有重大意义。

衍生化技术是指待测化合物的特定基团与衍生化试剂进行快速反应，定量生成衍生化物，然后通过检测衍生化物的量来间接测定待测化合物的量。

目前液相色谱质谱联用技术(lc-ms)是脂肪酸分析的主流方法。然而，由于脂肪酸的化学结构特点，其在电喷雾离子源中的离子化效率较差，使得其质谱检测灵敏度较差。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法，其通过双衍生化技术改变脂肪酸的物理化学特征，从而改善其色谱行为，增强质谱检测过程中的离子化效率，提升脂肪酸的质谱检测灵敏度。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法，其包括以下步骤：

步骤一、以乙腈为溶剂，加入含等质量脂肪酸的多种脂肪酸标准品，制备脂肪酸混合标准品溶液；

步骤二、以乙腈为溶剂，依次加入2-肼基嘧啶、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到2-肼基嘧啶衍生化溶液；

步骤三、取部分脂肪酸混合标准品溶液，加入2-肼基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，得衍生化内标溶液；

步骤四、以乙腈为溶剂，依次加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液；

步骤五、将剩余部分的脂肪酸混合标准品溶液等分并用乙腈稀释成多种浓度的脂肪酸混合标准品稀释液，分别加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，然后分别加入衍生化内标溶液，得各标准曲线待测溶液；

步骤六、采用lc-ms/ms法检测各标准曲线待测溶液，建立各种脂肪酸的标准曲线；

其中，液相色谱条件为：色谱柱：沃特世behc18(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：0.5ml/min；柱温：55℃；进样量：1μl；流动相：a为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，b为体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-3min，10-20％b；3-3.01min，20-70％b；3.01-7min，70-100％b；7-9min，100-100％b；9-9.01min，100-10％b；9.01-10min，10％b；分析时间：10min；

质谱条件为：使用正离子扫描，多反应监测的数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：30psi；

步骤七、取待测样品，加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，再加入衍生化内标溶液，混匀，离心后取上清液，采用lc-ms/ms法测量，得到脂肪酸的种类和含量。

优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法中，步骤七中的待测样品及步骤五中参与衍生化反应的各浓度的脂肪酸混合标准品稀释液的体积均相同，且步骤七中加入的2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液、衍生化内标溶液的体积均与在步骤五中各浓度的脂肪酸混合标准品稀释液中的加入量相同。

优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法中，所述待测样品溶液为血浆。

优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法中，所述酰胺反应缩合剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基-丙基]碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑水合物、2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基尿鎓六氟磷酸酯和乙基二异丙胺中的任意两种。

优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法中，所述酰胺反应缩合剂为2-(7-氮杂苯并三氮)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和乙基二异丙胺。

优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法中，所述酰胺反应缩合剂中各物质的质量比为1/5～5。

优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法中，所述脂肪酸混合标准品溶液与所述2-肼基嘧啶衍生化溶液、所述脂肪酸混合标准品稀释液与所述2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液、所述待测样品与所述2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液反应时间均小于60min，反应温度均为10～60℃。

优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法中，所述脂肪酸混合标准品溶液与所述2-肼基嘧啶衍生化溶液、所述脂肪酸混合标准品稀释液与所述2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液、所述待测样品与所述2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液旋涡混合反应时间均为60s，反应温度均为室温。

本发明中的2-肼基-4,6-二甲基嘧啶可简写为dmp，2-肼基嘧啶可简写为dp，1-乙基-3-[3-二甲基氨基-丙基]碳二亚胺盐酸盐可简写为edc，1-羟基苯并三唑水合物可简写为hobt，2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n，n，n'，n'-四甲基尿鎓六氟磷酸酯可简写为hatu，乙基二异丙胺可简写为diea，脂肪酸简写为fa，碰撞诱导解离简写为cid，电喷雾离子源简写为esi，检测限简写为lod，衍生化内标简写为tdis，相对标准偏差简写为rsd，多反应监测简写为mrm，微型离心管简写为ep管，室温简写为rt。

本发明的工作原理为：具有相似结构的同系物dmp和dp，作为衍生化试剂，在缩合剂hatu和diea的作用下，均可同脂肪酸发生反应，脂肪酸的羧基和dmp或dp的肼基可以迅速结合，脂肪酸的羧基被转化成酰胺键，同时由于dmp或dp结构中存在的多个氮原子，使得dmp或dp修饰后的脂肪酸在电喷雾离子源的离子化效率增加，从而显著提升了其质谱检测灵敏度，dmp和dp的衍生化机制分别如图1(a)和图1(b)所示，通过对脂肪酸衍生物的质谱分析间接对脂肪酸进行定量分析。被衍生化的脂肪酸可以在相同的碰撞能量下产生一致的最强离子，对于被dmp衍生化的脂肪酸可以产生m/z139的最强子离子，对于被dp衍生化的脂肪酸则是得到m/z111的最强子离子。脂肪酸经过dmp和dp衍生化得到的衍生化产物互为同系物，两者具有相似的化学结构。与经dp衍生化得到的脂肪酸衍生物相比，经dmp衍生化得到的脂肪酸衍生物结构中只多了两个甲基。将dp衍生化的脂肪酸混合标准品溶液作为衍生化内标溶液，加入至dmp衍生化的脂肪酸样本中可以降低脂肪酸定量分析的基质效应。

本发明至少包括以下有益效果：一、衍生化条件温和，衍生化试剂dmp或dp与脂肪酸可以在室温下1min内完成衍生化反应；二、衍生化效率高，dmp或dp与脂肪酸的衍生化效率大于99.9％；三、通过在结构中引入一个易于离子化的结构，脂肪酸在经过dmp或dp衍生化后，其质谱检测灵敏度显著提升，提升了10-1000倍，脂肪酸的质谱检测限(lod)可以达到25pg/ml，个别脂肪酸甚至达到10pg/ml；四、实现了对短链脂肪酸的分析，短链脂肪酸经过衍生化后，在反相色谱柱上的保留增加，加之灵敏度的提升，使得lc-ms/ms可以成功对衍生化后的短链脂肪酸进行测定；五、通用的质谱参数，经过dmp或dp衍生化的羧酸化合物均可以在相同的碰撞能量和去簇电压下产生一致的最强的子离子m/z139或m/z111，避免了每个化合物进行单独质谱参数优化的繁杂工作；六、特异性增强，脂肪酸在经过dmp或dp的衍生化后，可以得到高丰度的特征子离子，有效避免了在伪mrm扫描模式下特异性不足的问题；七、降低质谱检测的基质效应，本发明使用双衍生化的策略，衍生化试剂dmp和dp为一对同系物，两者结构高度相似，仅相差2个“-ch2”基团，脂肪酸标准品使用dp衍生化后，作为内标加入到dmp衍生化的待测样本，使用这种方式，每一个待测物均可以得到其一一对应的同系物作为内标，内标和待测物具有相似的结构和相近的色谱保留时间，可以显著降低脂肪酸质谱检测中的基质效应，有效提升了脂肪酸定量的准确度和精密度；八、本发明还实现了短链脂肪酸的lc-ms/ms分析，使得在10min内，耗费10μl的血浆样本，一次进样分析可以完成36种短链、中链、长链和超长链脂肪酸的准确定量分析。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1(a)和图1(b)分别为本发明中脂肪酸与dmp和dp衍生化机理；

图1(c)为本发明方法的流程示意图；

图2(a)和图2(b)为本发明中不同酰胺反应缩合剂条件下dmp或dp和脂肪酸的衍生化产物峰面积的雷达图；

图2(c)和图2(d)为不同反应温度、反应时间条件下dmp或dp对脂肪酸进行衍生化效率对比图；

图3(a)负离子模式下伪多反应监测未衍生化的花生四烯酸质谱图；

图3(b)花生四烯酸经dmp或dp衍生化后的质谱图；

图3(c)脂肪酸衍生化后的色谱图(横坐标上为dmp衍生化后的色谱峰，横坐标下为内标试剂dp的色谱峰)；

图4(a)和图4(b)分别为不同类脂肪酸经dmp和dp衍生化后的质谱图；

图5(a)和图5(b)分别为衍生化内标校正后和校正前花生四烯酸线性。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在其中一种技术方案中，本发明提供了一种基于双衍生化技术的脂肪酸lc-ms/ms分析方法，包括以下步骤：

步骤一、以乙腈为溶剂，加入含等质量脂肪酸的多种脂肪酸标准品，制备脂肪酸混合标准品溶液；

根据各种脂肪酸标准品的状态，与乙腈溶剂混合时，为使各种脂肪酸在制备的脂肪酸混合标准品溶液中的含量相同，可适当调整添加各脂肪酸标准品的量；

步骤二、以乙腈为溶剂，依次加入dp、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到dp衍生化溶液；

步骤三、取部分脂肪酸混合标准品溶液，加入dp衍生化溶液，在10～60℃下，旋涡混匀，静置反应0～60min，至脂肪酸均被衍生化，得衍生化内标溶液；

步骤四、以乙腈为溶剂，依次加入dmp、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到dmp衍生化溶液；

步骤五、将剩余部分的脂肪酸混合标准品溶液等分并用乙腈稀释成多种浓度的脂肪酸混合标准品稀释液，分别加入dmp衍生化溶液，在10～60℃下，旋涡混匀、静置反应0～60min，至脂肪酸均被衍生化，然后分别加入衍生化内标溶液，得各标准曲线待测溶液；

步骤六、采用lc-ms/ms法检测各标准曲线待测溶液，并以各脂肪酸在各标准曲线待测溶液中的真实浓度为横坐标，以标准曲线待测溶液中dmp标记的脂肪酸和对应的衍生化内标溶液中dp标记的脂肪酸的峰面积比率为纵坐标，建立各种脂肪酸的标准曲线；

其中，液相色谱条件为：色谱柱：沃特世behc18(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：0.5ml/min；柱温：55℃；进样量：1μl；流动相：a为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，b为体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-3min，10-20％b；3-3.01min，20-70％b；3.01-7min，70-100％b；7-9min，100-100％b；9-9.01min，100-10％b；9.01-10min，10％b；分析时间：10min；

质谱条件为：使用正离子扫描，多反应监测的数据采集模式，离子源参数为：喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：30psi；

本步骤中的横坐标可以为各脂肪酸在各标准曲线待测溶液中的真实浓度，因标准曲线待测溶液在配置过程中是在脂肪酸混合标准品稀释液中以一定比例添加dmp衍生化溶液和衍生化内标溶液，即各脂肪酸浓度呈一定比例变化，所以横坐标也可以是脂肪酸在各浓度的脂肪酸混合标准品稀释液中的浓度；

步骤七、取待测样品，加入dmp衍生化溶液，在10～60℃下，旋涡混匀、静置反应0～60min，至脂肪酸均被衍生化，再加入衍生化内标溶液，混匀，离心后取上清液，采用lc-ms/ms法测量，得到脂肪酸的种类和含量；

其中，待测样品是含脂肪酸的物质，如血浆等含游离脂肪酸的样品；根据待测样品的初步试验检测结果，若其纵坐标的响应值超出标准曲线的范围，可对待测样品进行稀释等操作，或待测样品浓度低于本发明方法中可检测的检测限范围内，可对待测样品进行浓缩等处理；

通过质谱仪初步对不同浓度的待测样品进行分析，根据检测结果中待测组分的峰面积，确定衍生化内标溶液的加入量；

在实验过程中为尽量减少变量，优选的是步骤七中的待测样品及步骤五中参与衍生化反应的各浓度的脂肪酸混合标准品稀释液的体积均相同，且步骤七中加入的dmp衍生化溶液、衍生化内标溶液的体积均与在步骤五中各浓度的脂肪酸混合标准品稀释液中的加入量相同；

本发明中的酰胺反应缩合剂为edc、hobt、hatu和diea中的任意两种，本发明方法中为保证脂肪酸均能顺利完成衍生化反应，添加的乙腈溶剂、dmp、dp、酰胺反应缩合剂均是过量的，所以对酰胺反应缩合剂中两种物质的比例无具体要求，根据常规实验操作，优选酰胺反应缩合剂中各物质的质量比为1/5～5；最优选酰胺反应缩合剂为等量的2-(7-氮杂苯并三氮)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和n,n-二异丙基乙胺。本发明方法流程示意图如图1(c)所示。

实验例

1准备化学品和实验仪器

乙腈(质谱级)购自fisherscientific(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。甲酸(质谱级)购自sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。超纯水使用milli-q纯化系统制备(美国马萨诸塞州贝德福德)。所有fa标准品均购自caymanchemicalco.(美国密歇根州安阿伯)。1-乙基-3-[3-二甲基氨基-丙基]碳二亚胺盐酸盐(edc)，1-羟基苯并三唑水合物(hobt)，2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n，n，n'，n'-四甲基尿鎓六氟磷酸酯(hatu)和乙基二异丙胺(diea)，2-肼基-4,6-二甲基嘧啶(dmp)和2-肼基嘧啶(dp)均购自sigma-aldrich。sparkholland液相色谱系统(spark，荷兰)，api5500质谱仪(加拿大absciex，加拿大)。

2制备待测样品

将8周龄的体重为250±5g雄性wistar大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)饲养在无特定病原体的条件下(12h光照/12h黑暗的光周期，23±2℃，55±5％相对湿度)。动物实验是按照机构指南进行的，并得到首都医科大学附属北京朝阳医院动物伦理委员会的批准。

所有大鼠在第4天禁食12h后处死，并使用肝素作为抗凝剂收集全血样本，4000rpm离心10min，分离得到血浆样品，即待测样品。所有血浆样品均保存在-80℃直至进一步分析。

3实验分析

步骤一、以乙腈为溶剂，加入多种脂肪酸标准品，制备各种脂肪酸浓度为1μg/ml的脂肪酸混合标准品溶液；

步骤二、以乙腈为溶剂，依次加入dp、hatu和diea，混合均匀，得到dp衍生化溶液；其中dp的浓度为1mg/ml、hatu和diea的浓度均为3.5mg/ml；

步骤三、取部分脂肪酸混合标准品溶液移入ep试管中，然后加入其6倍体积的dp衍生化溶液，在10～60℃下，旋涡混匀，静置反应0～60min，至脂肪酸均被衍生化，得衍生化内标溶液；

步骤四、以乙腈为溶剂，依次加入dmp、hatu和diea，混合均匀，得到dmp衍生化溶液；其中dmp的浓度为1mg/ml、hatu和diea的浓度均为3.5mg/ml；

步骤五、将剩余部分的脂肪酸混合标准品溶液等分并用乙腈稀释成浓度分别为10、50、500、1000、1500、2000ng/ml系列浓度的脂肪酸混合标准品稀释液，从中各取10μl，分别加入90μl的dmp衍生化溶液，在10～60℃下，旋涡混匀、静置反应0～60min，至脂肪酸均被衍生化，然后分别加入10μl衍生化内标溶液，得各标准曲线待测溶液；

步骤六、以乙腈为溶剂，加入一种脂肪酸标准品，制备浓度为5μg/ml的单一脂肪酸标准品溶液，然后将该单一脂肪酸标准品溶液分为两份，分别加入足量的dp衍生化溶液和dmp衍生化溶液，旋涡混匀、静置反应0～60min，至脂肪酸均被衍生化，分别得脂肪酸单标dp衍生化溶液和脂肪酸单标dmp衍生化溶液，重复以上操作分别制备不同种脂肪酸单标dp衍生化溶液和不同种脂肪酸单标dmp衍生化溶液；

使用流动注射泵将不同种5μg/ml脂肪酸单标dp或dmp衍生化溶液以10μl/min的流速泵入质谱仪，进行多反应监测离子对、碰撞能量和去簇电压等参数的优化；

然后采用lc-ms/ms法检测各标准曲线待测溶液，并以各脂肪酸在各标准曲线待测溶液中的真实浓度为横坐标，以标准曲线待测溶液中dmp标记的脂肪酸和对应的衍生化内标溶液中dp标记的脂肪酸的峰面积比率为纵坐标，建立各种脂肪酸的标准曲线；

其中，液相色谱条件为：色谱柱：沃特世behc18(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：0.5ml/min；柱温：55℃；进样量：1μl；流动相：a为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，b为体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-3min，10-20％b；3-3.01min，20-70％b；3.01-7min，70-100％b；7-9min，100-100％b；9-9.01min，100-10％b；9.01-10min，10％b；分析时间：10min；

质谱条件为：使用正离子扫描，多反应监测的数据采集模式，离子源参数为：喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：30psi；

步骤七、取10μl血浆样品，加入90μldmp衍生化溶液，在10～60℃下，旋涡混匀、静置反应0～60min，至脂肪酸均被衍生化，再加入衍生化内标溶液，混匀，离心后取上清液，采用lc-ms/ms法测量，得到脂肪酸的种类和含量。

4衍生化反应条件的选择

脂肪酸的结构中存在广泛的c＝c结构，过于严苛的衍生化条件可能会导致脂肪酸的结构降解，从而带来定量结果的偏差。所以建立温和高效的衍生化条件对于获取待测样本中脂肪酸的真实浓度至关重要。

在脂肪酸的衍生化过程中选用四对不同的酰胺反应缩合剂：edc/hobt、edc/diea、hatu/hbot、hatu/diea，具体步骤如下：将100μl100ng/ml的脂肪酸混合标准品溶液置于1.5ml的ep管中，在真空浓缩仪中挥干溶剂，重复制备12份，每3份为一组，各组中每份样品分别加入100μl以下四种不同的衍生化溶液：(1)edc/hobt法：以乙腈为溶剂，含1mg/ml的dmp或dp、3.5mg/ml的edc、3.5mg/ml的hobt的衍生化溶液；(2)edc/diea法：以乙腈为溶剂，含1mg/ml的dmp或dp、3.5mg/ml的edc、3.5mg/ml的diea的衍生化溶液；(3)hatu/hbot法：以乙腈为溶剂，含1mg/ml的dmp或dp、3.5mg/ml的hatu、3.5mg/ml的hbot的衍生化溶液；(4)hatu/diea法：以乙腈为溶剂，含1mg/ml的dmp或dp、3.5mg/ml的hatu、3.5mg/ml的diea的衍生化溶液。加入衍生化溶液后，涡旋混合反应1min后，60℃条件下静置反应1h，采用lc-ms/ms方法进行分析。结果如图2(a)和图2(b)所示，将采用edc/hobt为酰胺反应缩合剂得到的脂肪酸色谱峰面积定义为1，对其他酰胺反应缩合剂条件下得到的脂肪酸色谱峰面积进行对比，可得出采用hatu/diea为酰胺反应缩合剂可以得到最佳的衍生化效率，因此，优选hatu/diea作为脂肪酸和dmp或dp进行衍生反应的缩合剂。

本发明对脂肪酸和dmp或dp衍生化反应时间和温度进行了优化，对5种不同的衍生化反应时间(0min、10min、20min、30min、60min)和2种不同的反应温度(室温、60℃)进行的考察。具体步骤如下：将100μl100ng/ml的脂肪酸混合标准品溶液置于1.5ml的ep管中，在真空浓缩仪中挥干溶剂，分别加入100μl的衍生化溶液，并置于不同的衍生化反应温度和反应时间条件下进行衍生化反应，衍生化反应结束后立即采用lc-ms/ms方法进行分析。结果如图2(c)和图2(d)所示，衍生化反应时间和温度对dmp或dp与脂肪酸的衍生化反应效率均无显著影响，dmp或dp与脂肪酸的衍生化反应可瞬间完成，未给反应更充足时间，优选衍生化反应时间为60s，考虑到实验操作的便捷性，优选室温为衍生化反应温度。由于衍生化试剂中肼基的高亲核性，本发明方法中脂肪酸的衍生化反应十分的温和高效。得益于温和高效的反应条件，脂肪酸在衍生化过程中发生降解的风险较小，有效保证了其定量分析的准确度。

反应产率是评价衍生化方法的重要参数，本发明使用花生四烯酸(fa20:4)对dmp或dp的衍生化效率进行了考察，具体步骤如下：移取100μl1μg/ml的花生四烯酸溶液，置于1.5ml的ep管中，在真空浓缩仪中挥干溶剂，重复制备2份，分别加入100μldmp或dp衍生化溶液，涡旋混合1min，得到衍生化样本溶液采用lc-ms/ms法进行分析，使用负离子模式检测游离fa20:4的含量。如图3(a)所示，所有峰均在负离子的伪mrm模式下检测，衍生化样本中游离fa20:4低于10ng/ml游离的fa20:4质谱信号，说明衍生化样本中99％的fa20:4已经转化为其dmp或dp衍生物。本发明中脂肪酸发生衍生化反应的产率大于99％。

5方法学验证

从反应灵敏度、线性、精密度、准确度、稳定性5方面对本发明中脂肪酸分析方法进行考察，具体考察方法如下：

线性和灵敏度的考察：制备脂肪酸混合标准品溶液并等分，使用乙腈各稀释脂肪酸混合标准品溶液分别为10、50、500、1000、1500和2000ng/ml的脂肪酸混合标准品稀释液，从中各取10μl，分别加入90μl的dmp衍生化溶液，旋涡混匀、静置反应至脂肪酸均被衍生化，然后分别加入10μl衍生化内标溶液，选取信噪比为3时的脂肪酸标准品质量浓度为检测限。得到检测的脂肪酸的线性范围。将每个dmp标记的脂肪酸的峰面积除以其对应的dp标记的脂肪酸的峰面积，然后将比率相对于实际浓度作图，以权重为1/x²的最小二乘法绘制每种脂肪酸的校正曲线。

精密度和准确度的考察：制备脂肪酸混合标准品溶液并等分，使用乙腈稀释成浓度分别为40、200、800ng/ml的脂肪酸混合标准品稀释液，从中各取10μl，分别加入90μl的dmp衍生化溶液，在10～60℃下，旋涡混匀、静置反应0～60min，至脂肪酸均被衍生化，然后分别加入10μl衍生化内标溶液，得各浓度的质控样本，每个浓度的质控样本重复制备6份，并采用lc-ms/ms法进行分析，通过测量浓度和真实浓度的百分比来计算准确度。精密度通过计算各浓度的6份质控样本测量浓度的相对标准偏差来确定。

稳定性考察：将浓度为200ng/ml的质控样本置于4℃自动进样器中连续进样分析，考察脂肪酸衍生物的稳定性。

6数据处理与统计分析

使用multiquant软件(版本3.0.2，absciex)进行峰面积比率和各种脂肪酸浓度的计算。将dmp标记的脂肪酸的峰面积除以其对应的dp标记的脂肪酸的峰面积，得到的比率用于脂肪酸浓度计算。

7实验结果分析

7.1各种衍生化反应后的脂肪酸的质谱参数如表1所示，其中dmp-fa为脂肪酸经dmp衍生化后形成的衍生物，dp-fa为脂肪酸经dp衍生化后形成的衍生物。如表2所示，各类脂肪酸经dmp衍生化后形成的衍生物(即待测物)和其对应的各类脂肪酸经dp衍生化后形成的衍生物(即内标物)具有相似的保留时间，两者的保留时间差值在0～0.36min之间，待测物和内标物相似的化学结构和色谱保留时间可以有效降低基质效应。

由于衍生化试剂的高亲核性，dmp或dp可以在室温下与脂肪酸进行高效的衍生化反应。将dmp衍生化溶液直接加入到血浆中，同时完成蛋白质沉淀和脂肪酸的衍生化。此外，在生物样本预处理前加入tdis，可以有效校正生物样品预处理所引起的偏差。

表1衍生化脂肪酸的质谱参数

表236种脂肪酸的保留时间、最低检测限、准确度、精密度

7.2脂肪酸的衍生化显著改善了脂肪酸的检测灵敏度和色谱行为

脂肪酸的质谱检测灵敏度较低主要是由于其在esi中的离子化效率较低，无法满足生物样品，尤其是微量生物样品中低丰度脂肪酸的监测分析，提升质谱检测灵敏度是目前脂肪酸分析中亟待解决的问题。本发明通过脂肪酸与dmp或dp发生衍生反应，脂肪酸的羧基被转化成酰胺键，同时由于dmp或dp结构中存在的多个氮原子，使得dmp或dp修饰后的脂肪酸在esi中的离子化效率增加，从而显著提升了其质谱检测灵敏度，实现对低丰度脂肪酸的准确定量分析，检测限的结果如表2所示。本发明以fa20:4为例，比较了脂肪酸在dmp或dp衍生化前后的质谱检测灵敏度。如图3(b)所示，游离fa20:4的检测限为10ng/ml，而经过dmp或dp衍生化后的fa20:4的检测限为25pg/ml。dmp或dp对脂肪酸进行衍生化使得fa20:4的质谱检测灵敏度提升了400倍。如表2所示，dmp或dp标记的不同类的脂肪酸质谱检测限在10pg/ml～25ng/ml之间。根据化学结构的差异，衍生化后的脂肪酸质谱检测灵敏度比其游离形式提升10～1000倍，有效保证了低丰度脂肪酸的准确定量分析。基于dmp或dp衍生化的脂肪酸的质谱检测分析的灵敏度优于此前报导的基于ampp和3nph衍生化的脂肪酸的质谱检测分析。良好的灵敏度意味着更高的化合物覆盖率和更少的生物样本消耗。使用本发明方法，只需消耗10μl的血浆样本，即可满足36种脂肪酸的准确定量分析。

而对于短链和部分的中链脂肪酸，由于亲水性和挥发性较强，在常规的反相色谱柱上保留差，使用常规的lc-ms法很难进行定量分析。dmp或dp的衍生化在一定程度上增加了短链和中链脂肪酸的疏水性，使得它们在c18柱上的保留力更强，峰形更好。如图3(c)所示，经过衍生化，所有短链、中链和长链脂肪酸可以在9min中内得到良好的分离，并且峰形良好，所有衍生化产物的峰宽都在0.2min以内，且同分异构体得到了完全的分离。相比于此前的分析方法，本方法对脂肪酸的分析时间缩短了2/3，并且色谱峰形也得到了良好的改善。本发明方法通过dmp或dp对脂肪酸进行衍生化，缩短了脂肪酸的分析时间，增加了其分离效率，改善了色谱峰形，同时实现了短链、中链和长链脂肪酸的定量分析。

7.3衍生化的脂肪酸具有通用的多反应检测(mrm)条件

兼具高灵敏度和高特异性的mrm扫描模式是化合物定量分析过程中使用最为广泛的一种质谱扫描模式，但是在进行mrm分析前，首先需要使用标准品进行mrm参数的优化，包括离子对的选择和碰撞能量的优化。mrm条件的优化耗时耗力，且需要每一种待测物的标准品。如图4(a)所示，从左到右依次是4种不同脂肪酸标准品(fa18:0、fa18:1、fa18:2、fa22:5-n3)经过dpm衍生化后均可以在相同的碰撞能量下(35ev)下，发生酰胺键的断裂，产生最强子离子m/z139，而不受脂肪酸碳链长度及其不饱和度的影响。同样，如图4(b)所示，从左到右依次是4种不同脂肪酸标准品(fa18:0、fa18:1、fa18:2、fa22:5-n3)经过dp衍生化后均可以在相同的碰撞能量(30ev)下，发生酰胺键的断裂，产生最强子离子m/z111。以上结果表明，通用的子离子和碰撞能量可以适用于所有dmp或dp衍生化脂肪酸的mrm检测，如表1所示，m/z139和m/z111分别是与衍生化试剂dmp和dp相关的外源离子，提升了脂肪酸质谱分析的特异性。如图3(a)所示，相比于伪mrm模式下游离脂肪酸的检测，脂肪酸被dmp或dp衍生化后生成的衍生化物的质谱检测基线噪音显著降低。

7.4方法学验证结果

为了保证衍生化后的脂肪酸定量分析的准确度，从反应灵敏度、线性、精密度、准确度5方面对本发明中脂肪酸分析方法进行方法学考察，考察结果如下：

线性和灵敏度检测结果：如表2所示，所有衍生化后的脂肪酸均具有较宽的动态范围和良好的线性，线性相关系数(r)均大于0.99。图5比较了fa20:4在tdis校正前后的线性，表明基于dmp和dp的双衍生化技术可以显著改善脂肪酸衍生物的线性。如表2所示，dmp或dp标记的不同类的脂肪酸质谱检测限在10pg/ml～25ng/ml之间，根据化学结构的差异，衍生化后的脂肪酸质谱检测灵敏度比其游离形式提升10～1000倍。

准确度和精密度的考察结果：如表2所示，低、中、高三个浓度的质控样本的准确度考察结果都在80％～115％之间，并且所有类二十烷酸化合物精密度考察的rsd值小于10％，其中大部分化合物精密度的rsd值小于5％。

稳定性研究表明：所有衍生化的脂肪酸在4℃条件下放置48h的稳定性良好。

良好的线性、准确度、精密度和稳定性保证了脂肪酸衍生物定量的可靠性。

综上，本发明中，基于dmp和dp的两种结构类似物衍生化试剂，开发了一种灵敏度高和特异性好的lc-ms/ms分析方法，用于短，中和长链fa的全面定量。衍生化反应可以在室温下1min内完成，衍生化率大于99％，衍生反应更快，更温和，更有效。通过衍生化，fa的检测灵敏度得到了极大的提高，与未衍生化的fa相比，灵敏度通常提高了10到1000倍。dp衍生化的fa标准品被用作一对一的内部标准品，以确保准确定量。仅10μl血浆样品和10min即可满足36个fa的准确定量。通过这种双衍生化策略，成功解决了脂肪酸质谱检测中电离效率低的问题。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。