一种基于H-rGO-Pt@PdNPs纳米复合材料检测GPC3的方法与流程

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料特异性检测gpc3的方法。

背景技术：

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，gpc3）是近年来发现的一种新的最有希望成为hcc特异性肿瘤标志物的蛋白质。目前gpc3检测方法主要常采用酶联免疫吸附测定法(elisa)、血清肿瘤标记物、放射免疫分析法等。公开号cn105717104b的发明专利，公开了一种肝细胞癌患者外周血gpc3检测方法：利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的ctc，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测gpc3表达情况。公开号cn110872351a的发明专利，涉及一种特异性结合gpc3蛋白的纳米抗体gn1及其制备方法和应用。公开号为cn101290318b的发明专利公开了一种用于诊断肝癌的elisa试剂盒。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、检测灵敏度低且存在放射性污染，需要建立一种快速、灵敏、操作简便的gpc3检测方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于血红素/还原型氧化石墨烯/铂@钯(h-rgo-pt@pdnps)的纳米复合材料检测gpc3的方法，提高灵敏度、增强特异性。

为了解决该技术问题，采用电沉积技术以及静电吸附作用制作了基于h-rgo-pt@pdnps/aunps的gpc3纳米适配体电化学生物传感器。利用石墨烯及纳米金属对gpc3适配体的高负载能力和良好的电子传递效应，以及gpc3适配体对gpc3的特异性识别作用，采用电化学工作站的微分脉冲伏安法(dpv)，记录其峰电流。对gpc3的孵育温度、复合材料的浓度、gpc3适配体浓度、孵育时间、复合材料的量和pbs的ph值进行了优化，绘制了标准曲线，通过与标准工作曲线对比得到准确的gpc3浓度。与现有的方法相比，操作相对简单，特异性高，时间和费用的消耗更少，能达到0.1845ng/ml的最低检测限。

本发明的检测原理为：采用电沉积技术和戊二醛交联法将h-rgo-pt@pdnps/aunps修饰在丝网印刷电极表面。通过纳米技术以及分子间作用力将afp适配体负载在h-rgo-pt@pdnps/aunps材料表面，适配体因其不稳定的空间结构而以单链结构的形式存在生物传感界面。在生物传感界面上加入gpc3后，gpc3能够与gpc3适配体特异性结合，生成稳定的空间结构，从而可以有序的排列在电极表面。通过dpv方法检测gpc3前后在的pbs溶液（0.2mol/l，ph6.0）中的电化学信号（扫描速率为0.05v/s，扫描的电压区间是-0.4v-1.2v），并描绘出该电流与gpc3浓度的关系曲线，从而实现对gpc3的检测。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：h-rgo-pt@pdnps材料的制备

(1)还原性氧化石墨烯（rgo）的制备：氧化石墨烯（go）倒入蒸馏水中，使用超声细胞破碎仪超声，使其充分溶解均匀，制成go水溶液。取上述go水溶液置于烧杯中，加入抗坏血酸（aa）使其还原go，得rgo。

(2)血红素/还原性氧化石墨烯(h-rgo)的制备：将血红素（hemin）加入氨水中溶解，得血红素溶液。将血红素溶液与上述还原氧化石墨烯（rgo）溶液混合，以水合肼溶液混合，搅拌得h-rgo混合溶液。

(3)血红素/还原型氧化石墨烯/铂@钯(h-rgo-pt@pdnps)复合材料的制备：将邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(pdda)和氯化钠（nacl）加入到h-rgo溶液中，搅拌反应，得到pdda修饰的h-rgo溶液。将氯铂酸钠(na2ptcl6)和四氯钯酸钠(na2pdcl4)加入到pdda修饰的h-rgo溶液中搅拌反应,然后向溶液中加入乙二醇(eg)溶液进行混合，用氢氧化钠（naoh）调节混合溶液的ph值，回流反应。离心清洗即可得到h-rgo-pt@pdnps复合纳米材料。

步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建

(1)将丝网印刷电极（spce）置于h2so4溶液中，进行循环伏安扫描，得到活化后的丝网印刷电极，用水冲洗干净。

(2)将活化后的丝网印刷电极置入氯金酸溶液中，进行恒电位沉积，沉积结束后用水将电极冲洗干净，得到aunps/spce电极。

(3)将aunps/spce电极用戊二醛浸泡，用pbs洗涤，吹干，而后滴加h-rgo-pt@pdnps悬浊液孵育一段时间，pbs洗涤，晾干，得到h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce电极。

(4)取羧基化的gpc3适配体（gpc3apt）滴加到传感器界面，孵育一段时间，用pbs溶液洗涤未固定到界面的gpc3适配体，滴加牛血清蛋白（bsa）溶液进行封闭，得到gpc3apt/h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce传感界面，晾干备用。

步骤3：gpc3的标准曲线绘制

(1)将标准gpc3溶液滴加到步骤2得到的gpc3apt/h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce传感界面，孵育一段时间，用pbs溶液清洗，得到工作电极，晾干备用。

(2)将工作电极放入pbs溶液中，采用电化学工作站的dpv扫描，记录其峰电流。

(3)分别对不同浓度的gpc3进行检测，绘制标准曲线，计算出该方法的最低检测限。

步骤4：实际样品的检测

(1)在步骤2得到的gpc3apt/h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce传感界面，滴加待测实际样品，孵育一段时间，用pbs溶液清洗，得到工作电极，晾干备用。

(2)将工作电极放入pbs溶液中，采用电化学工作站的dpv扫描，记录其峰电流。

(3)根据步骤3所述标准曲线，得到所述待测实际样品中gpc3的浓度。

进一步，所述步骤1中go溶液浓度为1.0mg/ml。

进一步，所述步骤1中氨水溶液为10μl80%。

进一步，所述步骤1中水合肼溶液为8μl。

进一步，所述步骤1中h-rgo溶液浓度为1.0mg/ml。

进一步，所述步骤1中pdda为2ml0.2%。

进一步，所述步骤1中nacl为5ml0.2mol/l。

进一步，所述步骤1中na2ptcl6为2ml20mmol/l。

进一步，所述步骤1中na2pdcl4为2ml20mmol/l。

进一步，所述步骤1中naoh为1mol/l。

进一步，所述步骤1中eg为10ml。

进一步，所述步骤1中将制备好的材料混合，用naoh调节混合溶液的ph值，回流反应。离心清洗即可得到h-rgo-pt@pdnps复合纳米材料。

进一步，所述步骤1中h-rgo-pt@pdnps溶液浓度为0.5mg/ml。

进一步，所述步骤2中h2so4溶液浓度为0.5mol/l。

进一步，所述步骤2中扫描电压为-0.4v-1.2v，扫描段数为20。

进一步，所述步骤2中将电极置于h2so4中进行循环伏安扫描后，用纯水冲洗干净后，再将电极置于氯金酸溶液中分别进行循环伏安扫描，最后用纯水冲洗晾干备用。

进一步，所述步骤2中，使用的氯金酸浓度为0.01%，沉积条件为-0.5v，沉积时间120s。

进一步，所述步骤2中，戊二醛浓度为2.5%。

进一步，所述bsa溶液浓度为0.5%，pbs的浓度为0.2mol/l，ph值为7.0。

进一步，步骤2中gpc3适配体浓度为5μmol/l。

进一步，gpc3适配体在电极的孵育温度为25°c，孵育时间为1小时。

进一步，所述步骤2中，bsa浓度为0.5%。

进一步，所述步骤3中gpc3的最佳孵育温度为15℃，最佳孵育时间为60min。

优选，所述步骤3和步骤4中的线性扫描范围-0.4v-1.2v，扫描速率为0.05v/s。

其中，步骤1制备一种独特的h-rgo-pt@pdnps纳米复合材料，为gpc3apt的固定提供了优良的载体。步骤2构成特异性识别gpc3的生物传感界面，并有利于电子的传递。步骤2中生物传感界面的构建为步骤3中gpc3的电化学检测中必不可少的关键步骤。可见步骤1-3相互支撑，共同作用，才能利用以h-rgo-pt@pdnps复合材料和gpc3适配体为识别探针实现gpc3的检测。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、h-rgo-pt@pdnps复合材料具有比表面积大、生物兼容性好、表面反应活性强、催化效率高、电子传递能力强；其中纳米铂、钯和石墨烯的比表面积大、生物相容性好，电子传递能力强，可增加被固定的生物分子的负载量，促进电极和生物组分之间的电子传递，可以有效地将gpc3适配体固定到电极的表面，加速信号传导，以保证传感器的稳定性，提高检测能力；gpc3能够与gpc3适配体发生特异性结合反应，生成稳定的空间结构。与传统的传感器相比，新型纳米材料传感器不仅体积更小，速度更快，而且精度更高，可靠性更高。

2、采用以gpc3适配体为识别探针检测gpc3的背景干扰小，能达到0.1845ng/ml的检测限。适配体和目标物之间的亲和力常常比抗原和抗体之间的亲和力强。此外，适配体比抗体更易被化学方法标记和修饰，这些处理有助于纳米粒子和其表面的功能化。

附图说明

图1基于h-rgo-pt@pdnps的纳米适配体传感器检测gpc3的原理图；

图2h-rgo-pt@pdnps复合纳米材料的透射电镜图；

图3不同gpc3浓度的dpv曲线；

图4gpc3的工作曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一种基于血红素/还原型氧化石墨烯/铂@钯(h-rgo-pt@pdnps)的纳米复合材料检测gpc3的方法，检测原理见图1。首先，h2so4活化处理裸电极，金纳米粒子在裸电极表面进行电沉积。用戊二醛交联法将h-rgo-pt@pdnps纳米复合材料固定在aunps/spce表面，得到h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce生物传感平台，通过纳米技术以及分子间作用力将gpc3适配体负载在h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce材料表面，适配体因其不稳定的空间结构而以单链结构的形式存在复合材料表面，然后用牛血清蛋白封闭未反应的非特异性位点。在生物传感界面中加入gpc3后，gpc3能够与gpc3适配体特异性结合，生成稳定的空间结构，从而可以有序的排列在电极表面。通过dpv方法检测gpc3前后在的pbs溶液（0.2mol/l，ph6.0）中的电化学信号（扫描速率为0.05v/s，扫描的电压区间是-0.4v-1.2v），并描绘出该电流与gpc3浓度的关系曲线，从而实现对gpc3的检测。

具体实施步骤如下：

1、h-rgo-pt@pdnps复合纳米材料的制备

（1）称取30mg氧化石墨烯置于烧杯中，加入30ml的超纯水，用超声细胞破碎仪超声破碎氧化石墨烯，使其充分溶解均匀，得到浓度为1mg/ml的溶液，取溶解均匀的上述溶液10ml于烧杯中，然后加入10mg抗坏血酸并置于恒温磁力搅拌器，在室温下搅拌12h,即可得到还原氧化石墨烯（rgo）。图2a为rgo的透射电镜图，呈黑色片状结构，可见形成了一种新的还原氧化石墨烯粒子。

（2）将30mg血红素于10μl氨水中溶解，再向其中加入30ml的超纯水，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，得到浓度为1mg/ml的溶液，将血红素溶液和还原氧化石墨烯溶液按照1:1的比例混合，在混合溶液中加入8μl的水合肼溶液，涡旋10min后，将混合溶液在温度为60°c的水浴锅中水浴4h，然后离心机中以13500r/min的转速离心10min,去掉上清液，洗涤两次，烘干，即可得到h-rgo复合纳米材料。图2b为h-rgo的透射电镜图，黑色片状结构成功吸附着粒子颗粒，表明h-rgo材料构建成功。

（3）将2mlpdda(0.2%)和5mlnacl（0.2m）加入到10mlh-rgo(0.5mg/ml)溶液中搅拌反应12h，离心清洗，得到pdda修饰的h-rgo溶液。将2mlna2ptcl6(20mm)和2mlna2pdcl4(20mm)加入到pdda修饰的h-rgo(0.5mg/ml)溶液中搅拌反应12h，然后向溶液中加入10ml乙二醇溶液进行混合，用1mnaoh调节混合溶液的ph值到12，140°c回流反应4h。离心清洗即可得到h-rgo-pt@pdnps复合纳米材料。图2c为h-rgo-pt@pdnps的透射电镜图，与图2b相比，有较多球状小颗粒随机分布在黑色膜的表面，证明h-rgo-pt@pdnps材料构建成功。

2、电极的修饰与生物传感界面的构建

（1）丝网印刷电极（spce）在使用前首先浸泡在0.5mol/lh2so4溶液中进行循环伏安（cv）扫描，在-0.4v-1.2v的电压范围内扫描20段；扫描完成之后用水洗净，晾干，得到活化的spce。

（2）将活化后的spce电极放入5ml0.01%氯金酸溶液，在-0.5v恒电位沉积120s，沉积完成后用纯水洗涤3次，吹干得到aunps/spce电极。将aunps/spce电极用2.5%戊二醛浸泡15min，用ph7.0pbs洗涤3次，吹干，而后滴加5μl的h-rgo-pt@pdnps悬浊液孵育30min，pbs洗涤3次，晾干，得h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce。取2μl羧基化的gpc3适配体滴加于h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce传感界面上，孵育1h，洗涤未能固定到界面的适配体，滴加5μl0.5%的bsa溶液进行封闭，自然晾干，得到gpc3apt/h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce传感界面。在使用前存储在4°c冰箱中。

3、gpc3的标准曲线绘制

（1）将标准gpc3溶液滴加到步骤2得到的gpc3apt/h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce传感界面，放进25°c孵育箱中孵育1h，用pbs溶液清洗，得到gpc3电化学生物传感器。

（2）然后将上述所得的工作电极放到pbs支持液（0.2mol/l，ph6.0）中，采用电化学工作站的dpv扫描，记录其峰电流。gpc3浓度在0.001~10µg/ml范围内时，响应电流随gpc3浓度增加而增大，其dpv曲线如图3所示，传感器电流响应值（y）与gpc3浓度（x）之间的关系呈线性，标准曲线见图4，其线性回归方程为y=1.7814+1.3576x，相关系数为0.9963。将空白对照的三倍标准差定义为检测下限，计算gpc3的最低检测限为0.1845ng/ml。

4、实际样品的检测

将2μl已知浓度的gpc3溶液（1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）滴加在gpc3apt/h-rgo-pt@pdnps/aunps/spce传感界面，同时将100μl人血清样品加入到5mlpbs支持溶液（0.2mol/l，ph6.0）中。按照步骤3所述，将工作电极置于上述pbs支持溶液中进行dpv扫描，记录电流值。根据步骤3的标准曲线y=1.7814+1.3576x，计算可得到对应的实际样本中gpc3溶液的浓度，检测结果见表1。

表1实际血清样本中gpc3的检测结果（测试(n=3)）

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以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。