基于时间调控灵敏度的检测黄曲霉毒素B1的无标记比率电化学传感器的制备方法与流程

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于灵敏度可调控的无标记比率电化学生物传感器制备方法及其应用，可用于对黄曲霉毒素b1(afb1)检测。

背景技术：

afb1是农作物中存在最广泛、毒性最强的一类真菌毒素，具有很强的抗降解性，不仅可以在食品加工过程中生存，还会通过食物链损害动物或人的肝脏，甚至导致癌症。因此，实现对afb1的精准检测，对保障农作物质量安全、保护人类身体健康具有重要意义。

目前，针对afb1的分析方法主要包括酶联免疫法(elisa)、薄层色谱法(tlc)、液-质连用法(hplc-ms)。这些方法以其自身特有的优势被广泛使用，并取得较好的检测结果，然而假阳性高、操作步骤复杂、仪器昂贵等问题限制了这些方法的进一步应用。近年来，电化学方法以其灵敏度高、成本低、操作简单等优点成为目前应用最广泛的方法之一，为afb1传感分析方法的建立提供良好的参考基础。其中，为进一步提高电化学传感器对afb1的特异性，通过引入选择性高的适配体作为识别元件实现对afb1的特异性检测。

然而，电化学传感器由于在构建和应用过程中难以避免的外部变化，导致其稳定性、再现性、鲁棒性和可靠性较差，从而使其实际应用受到很大限制。为了解决这一难题，引入比率策略构建比率电化学传感器目前受到了科研工作者的广泛关注。然而，大多数传感器利用电化学分子标记dna链并根据信号分子与电极之间距离的变化实现比率传感分析，因此，在设计传感器时，电化学分子的选择与dna链的结构关系是不可忽视的一部分。因为并不是所有与电极连接的dna都处于理想的直立状态，dna链的纠缠、倾斜、弹性弯曲、旋转运动和非特异性相互作用可能会干扰氧化还原标签与电极表面的距离变化，进而影响生物传感器的性能。因此，基于上述分析，克服依赖距离调整信号策略，构建性能良好的无标记比率电化学生物传感器至关重要。

但是，农作物在收获、储存、运输等过程中受空间不足或天气的影响而发生霉变的程度有所不同，所以产生afb1的量不在同一个数量级。因此，针对处于不同过程中的农作物，构建灵敏度可控的无标记比率电化学传感器，对afb1进行有针对性的分析。

技术实现要素：

本文旨在发明一种准确性、选择性、稳定性良好的灵敏度可控的无标记比率电化学生物传感器直接检测afb1。提出了一种新型比率电化学传感器的构建方法对afb1进行检测。本发明介绍了一种无标记信号探针-硫堇与还原氧化石墨烯(thi-rgo)复合材料，通过硫堇(thi)与还原氧化石墨烯(rgo)的非共价作用形成；金纳米粒子(aunps)将巯基修饰的适配体互补链通过au-s共价键固定在传感界面；3’和5’末端被电化学活性分子fc标记的适配体通过碱基互补配对作用固定在被修饰的传感界面，从而构建新型传感器。进一步，通过调控被fc修饰的afb1适配体与传感界面的cdna作用时间，进而调控比率信号的比值(ithi/ifc)，获得新型灵敏度可控的无标记比率电化学生物传感器，用于对实际样品afb1的灵敏、快速分析。

本发明通过如下技术方案实现：

(1)无标记电化学探针thi-rgo复合材料的制备：

thi、rgo用超纯水溶解并室温保存，thi需要避光；细胞粉碎机处理rgo，提高其在水中的分散性；thi溶液与处理的rgo溶液磁力搅拌并离心水洗，得到thi-rgo复合材料，室温储存备用；

(2)玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后于空气中干燥；

(3)将步骤(1)制备的无标记电化学探针thi-rgo复合材料修饰到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，所得传感界面在室温下自然晾干；记为thi-rgo/gce；

(4)将aunps固定在步骤(3)所制得的传感界面，记为aunps/thi-rgo/gce；

(5)被巯基修饰的afb1适配体互补链(cdna)通过与步骤(4)传感界面的aunps形成au-s共价键固定在传感界面，记为cdna/aunps/thi-rgo/gce；

(6)灵敏度可控的无标记比率电化学传感器的构建：

被fc修饰的afb1适配体通过与步骤(5)传感界面的cdna作用而固定在传感界面，获得基于时间调控灵敏度的无标记比率电化学生物传感器记为fc-apt/cdna/aunps/thi-rgo/gce。

步骤(1)中，thi的浓度为5μg·ml^-1，rgo浓度为0.1mg·ml^-1，细胞粉碎机处理rgo时间为30min，两个材料混合搅拌时间为12h，离心水洗，离心转速为8000rpm，每次15min，最终得到沉淀溶解在超纯水中；thi溶液：rgo溶液的体积比为1:3。

步骤(2)中，玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。

步骤(3)中，无标记电化学探针thi-rgo复合材料的用量为6μl。

步骤(4)中，aunps的用量为6μl。

步骤(5)中，cdna浓度为6.0μm，用量为6μl，反应温度为4℃，反应时间为8h。

步骤(6)中，被fc修饰的afb1适配体浓度为6.0μm，用量为6μl，反应温度为4℃，被fc修饰的afb1适配体与传感界面的cdna作用时间为80-120min。

在上述制得的灵敏度可控的比率电化学生物传感器表面依次修饰不同浓度的afb1，室温下绑定时间为1.2-1.4h，afb1浓度依次为0.05ng·ml^-1,0.12ng·ml^-1,0.5ng·ml^-1,1ng·ml^-1,3ng·ml^-1,5ng·ml^-1,10ng·ml^-1,20ng·ml^-1，之后用tris-hcl(ph＝7.4)溶液对电极进行清洗，传感器为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为chi750e的电化学工作站记录与检测交流伏安(acv)电化学信号。在0.1mpbs(ph＝7.0)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围-0.4-0.7v，振幅为0.025v，频率为25hz。

本发明的有益效果：

(1)本发明提出的灵敏度可控的无标记比率电化学生物传感器，通过调控被fc修饰的afb1适配体与传感界面的cdna作用时间进而调控比率信号的比，获得灵敏度不同的比率电化学传感器，可实现对目标物的不同状态进行检测。

(2)本发明提出的无标记比率电化学生物传感器，通过将电化学探针修饰在电极表面作为传感器的内标分子，提高了传感器的精准度。

(3)本发明提出的比率电化学生物传感器可同时获得两个检测信号，信息量大，精准度、可信度高。

(4)本发明引入特异性识别元件afb1的适配体，提高了比率生物传感器的选择性，降低了与afb1同时存在毒素的干扰，实现对afb1的特异性分析。

(5)本发明构建的比率电化学生物传感器用于afb1的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽,为0.05-20ng·ml^-1。

(6)本发明构建的电化学生物传感器具有通用性，通过适配体的替换实现对一类毒素的分析。

附图说明

图1为调控被fc修饰的afb1适配体与传感界面的cdna结合时间(80min,100min,120min)的示意图；

图2(a)为实施例2制备的三个不同的调控时间对应的传感器比率信号的响应；(b)为三个传感器对不同浓度目标物afb1的比率信号响应，并得到afb1浓度对数(logcafb1)与两个信号强度比(ithi/ifc)的线性关系；(c)为三个传感器的灵敏度。

图3(a)为实施例5制备的灵敏度最佳的比率传感器对不同浓度afb1(0.05ng·ml^-1,0.12ng·ml^-1,0.5ng·ml^-1,1ng·ml^-1,3ng·ml^-1,5ng·ml^-1,10ng·ml^-1,20ng·ml^-1)的acv响应；(b)为目标物afb1浓度对数(logcafb1)与两个信号强度比(ithi/ifc)的线性关系；(c)为目标物afb1浓度对数(logcafb1)与信号ifc的线性关系；(d)为灵敏度最佳的比率电化学传感器在干扰物(fb1,afb2,zen,ota)作用下的选择性。

具体实施方式：

实施例1

比率电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤：

(1)thi-rgo复合材料的制备：

称量1mgthi用超纯水溶解，得到50ml浓度为20μg·ml^-1的thi溶液，并逐级稀释至5μg·ml^-1，避光室温储存；称量3mgrgo并分散在30ml超纯水中从而得到浓度为0.1mg·ml^-1的rgo分散溶液，利用细胞粉碎机处理分散液30min并置于室温储存待用。

取3ml5μg·ml^-1的thi与15ml0.1mg·ml^-1的rgo在100ml的烧杯中混合并搅拌12h，搅拌结束，将溶液置于10ml离心管，在转速为8000rpm，离心时间为15min条件下，离心水洗，得到沉淀。将所得沉淀溶解在3ml超纯水中，室温保存备用。

(2)玻碳电极(d＝3mmgce)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥。

(3)将步骤(1)制备的无标记电化学探针thi-rgo复合材料修饰6μl到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，所得传感界面在室温下自然晾干；此时传感器表示为thi-rgo/gce；

(4)将6μlaunps固定在步骤(3)所制得的传感界面，此时传感器表示为aunps/thi-rgo/gce；

(5)6μl且浓度为6μm被巯基修饰的afb1适配体互补链(cdna)通过与步骤(4)传感界面的aunps形成au-s共价键固定在传感界面，此时传感器表示为cdna/aunps/thi-rgo/gce；

(6)6μl且浓度为6μm被fc修饰的afb1适配体通过与步骤(5)传感界面的cdna作用而固定在传感界面，获得灵敏度可控的无标记比率电化学生物传感器，此时传感器表示为fc-apt/cdna/aunps/thi-rgo/gce；

灵敏度可控的无标记比率电化学传感器为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为chi750e的电化学工作站记录与检测acv电化学信号。在0.1mpbs(ph＝7.0)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围-0.4-0.7v，振幅为0.025v，频率为25hz。

实施例2

调控被fc修饰的afb1适配体与传感界面的cdna作用时间并获得具有不同比率信号的传感器：

将实施例1步骤(6)中fc修饰的afb1适配体在传感界面的孵育时间进行调控，如图1所示，分别得到fc修饰的afb1适配体孵育时间为80min(a)，100min(b)，120min(c)的比率传感器。

实施例3

对实施例2中通过调控获得的传感器进行acv测试，所得三个传感器的电化学信号ithi与ifc如图2a所示。

实施例4

测试实施例2所得三个传感器对不同浓度afb1的响应，并通过logcafb1与ithi/ifc之间的线性关系得到与之对应的线性曲线，如图2b所示。

实施例5

实施例4中所得三条线性曲线的斜率分别代表三个传感器的对不同浓度afb1的灵敏度响应，通过图2c对比三个传感器的灵敏度，得出，传感器c的灵敏度最佳且为0.076。证明传感器构建过程中，当fc修饰的afb1适配体在传感界面的接触时间为120min时，传感器的灵敏度最佳。

实施例6

将实施例5所得的灵敏度最佳的无标记比率电化学传感器对不同浓度afb1进行测试，其acv曲线如图3a所示，thi电化学信号强度随afb1浓度的增大而增大，fc信号强度呈现相反趋势，证明当目标物afb1存在时，afb1与其被fc标记的适配体结合并远离电极表面且fc信号降低，传感器表面的位阻效应降低，从而导致thi信号强度增大。并且在一定范围内ithi/ifc与afb1浓度的对数呈线性关系，如图3b所示。传感器线性相关系数r²为0.998，对afb1检测范围为0.05-20ng·ml^-1。

实施例7

为进一步对比比率信号与单信号方法分别对afb1的检测效果，研究ithi与logcafb1、ifc与logcafb1的线性关系，并得到如图3c的线性曲线，ithi与ifc单信号检测范围最高为0.1-10ng·ml^-1，线性相关系数r²为0.942、0.944，证明比率传感器性能要优于单信号的性能。

实施例8

对实施例5研究的的灵敏度最佳的比率电化学生物传感器的选择性进行考察，干扰物fb1(10ng·ml^-1)、afb2(10ng·ml^-1)、zen(10ng·ml^-1)和ota(ng·ml^-1)分别与传感器进行孵育，所得电化学响应结果与空白试验结果基本一样，然而0.5ng·ml^-1afb1与传感器孵育后，电化学信号响应明显高于空白。当生物传感器与0.5ng·ml^-1afb1和4种干扰物(10ng·ml^-1)的混合物共同孵育时，其响应与单纯afb1响应相比，基本保持不变(图3d)。结果表明，电化学生物传感器具有良好的特异性，可用于afb1的检测。