一组子宫内膜受容性的生物标志物、其筛选方法及应用与流程

本发明涉及一组子宫内膜受容性的生物标志物、其筛选方法及应用，属于医学和蛋白质组学
技术领域：
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背景技术：
：不孕不育是继心脑血管疾病和肿瘤后的世界第三大疑难病种，严重影响人类健康与社会和谐。我国育龄人群中，不孕不育率已经高达12.5％，而在经济发达的地区，不孕不育率甚至已经超过15％。这不仅严重干扰患者身心健康和家庭幸福，同时也给社会稳定和全民医疗卫生等诸多方面带来严峻挑战。辅助生殖技术，特别是体外受精-胚胎移植技术的大力发展，给无数不孕不育家庭带来了新的希望。据不完全估计，全球目前已出生超过500万“试管婴儿”。低胚胎种植率仍然是长期困扰辅助生殖技术医护人员的难题之一。胚胎移植后，种植率仅为30％-45％，无形中增加了社会医疗和患者家庭的经济负担。胚胎的种植是个复杂而精细的生理过程。作为妊娠的起始，胚胎的成功种植不止取决于胚胎强大的侵入能力，同时也受限于良好且与胚胎发育同步的子宫内膜容受性。子宫内膜的容受性是指子宫内膜在胚胎及母体释放的激素刺激下，内膜局部包括上皮和间质细胞等发生多种生理变化，以促进胚胎黏附、允许胚胎侵入并最终植入内膜，形成胎盘的一种状态。这段内膜接受胚胎的时间，也被称为种植窗期，一般出现在排卵或hcg扳机后的第7-9天。早于或者晚于这段时间，子宫内膜的着床期尚未开放或已经闭合，均不利于胚胎的植入。因此，建立准确高效地子宫内膜容受性评价体系，并探寻新的改善子宫内膜容受性的临床方法，将会对提高辅助生殖技术的妊娠率意义重大。如何评估和改善内膜容受性，并提高临床妊娠率是生殖医学，是辅助生殖领域长期关注的重点。理想的内膜容受性标志物应该符合如下条件：a)时间特异性表达，即主要出现在胚胎种植窗期；b)空间特异性表达，即主要表达在着床部位及其周围表达。以往的内膜容受性评估主要通过观察内膜的显微结构(如胞饮突的出现)、子宫的超声检查、细胞标志物等，这些评价手段一定程度上可以评价子宫内膜容受性，但对评价者的经验要求较高，且主观性强，容易出现错误识别和漏辨等风险，因而限制了这些技术在大规模不孕症容受性筛查中的应用。蛋白质组学是近年来兴起的热门学科，已逐渐成为研究细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成及其功能重要手段，具备大规模、高通量、系统化等特点，不仅可以用于定量反应蛋白质组的表达谱，同时可以定性揭示蛋白定位、功能和修饰如酰基化、泛素化、磷酸化或糖基化等信息。同位素标记相对和绝对定量技术(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification，简称itraq)是一种基于体外同种同位素的标记技术，对样本蛋白进行定性和定量分析的方法。该技术常被用于寻找和筛选不同样本间的差异表达蛋白，结合差异蛋白生物通路分析、蛋白功能注释等生物信息学分析揭示机体组织、细胞生理功能。虽然目前有过子宫内膜容受性的生物标志物的相关报道，但都属于单一的容受性标志物，检测准确率有限、特异性不高。近年来，一些内膜容受性相关标志物也被发现，并且有一些也已经被应用于临床探索阶段，但是单一的容受性标志物检测准确率有限、特异性不高。这些容受性相关分子大致可分为细胞黏附分子(细胞外基质受体如整合素(intergrins)、选择素(selectins)、钙黏蛋白(cadherins)与细胞间黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,icam-1))、细胞因子(白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,lif)、前列腺素(prostaglandins,pgs)、白细胞介素(interleukins,ils))、激素及其受体(雌激素受体(estrogenreceptor,er)和孕激素受体(progesteronereceptor,pr)，降钙素(calcitonin)、瘦素(leptin)及其受体等，参与内膜准备、胚胎黏附、侵袭、植入和免疫耐受等各个妊娠相关分子事件。这些分子指标常被用作单一指标或者简单组合，在一定程度上解决了部分患者的临床问题。但由于疾病发展的个体化差异，这些单指标检测的特异性和灵敏性也受到质疑，因为并不是所有的不孕患者都存在这些功能相关分子异常，许多未知的尚未被关注的功能分子有待进一步挖掘与开发。鉴于此，有必要研发一组子宫内膜容受性的生物标志物，以解决现有技术的不足，以期提高胚胎反复种植失败患者的早期发现和诊断，并提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。技术实现要素：本发明的目的之一，是提供一组子宫内膜受容性的生物标志物。本发明首次提供了一组子宫内膜受容性的生物标志物，可以为不孕症患者的早期发现和诊断、靶向干预及指导胚胎移植时机提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一组子宫内膜受容性的生物标志物，鉴定5213个可信蛋白，与妊娠阳性组相比，妊娠阴性组中鉴定到的1.3倍以上表达的差异蛋白共84个，其中上调蛋白17个，下调蛋白67个，上调蛋白如下：s1、检索号为q15545，蛋白注释为transcriptioninitiationfactortfiidsubunit7，中文名称为转录起始因子tfiid亚基7；s2、检索号为p05387，蛋白注释为60sacidicribosomalproteinp2，中文名称为60s酸性核糖体蛋白p2；s3、检索号为p15121，蛋白注释为aldosereductase，中文名称为醛糖还原酶；s4、检索号为p09936，蛋白注释为ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozymel1，中文名称为泛素羧基末端水解酶l1；s5、检索号为p10155，蛋白注释为60kdass-a/roribonucleoprotein，中文名称为60kdass-a/ro核糖核蛋白；s6、检索号为p27695，蛋白注释为dna-(apurinicorapyrimidinicsite)lyase，中文名称为dna-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶；s7、检索号为q16401，蛋白注释为26sproteasomenon-atpaseregulatorysubunit5，中文名称为26s蛋白酶体调节亚基5非atp酶；s8、检索号为p49736，蛋白注释为dnareplicationlicensingfactormcm2，中文名称为dna复制许可因子mcm2；s9、检索号为q9nrx4，蛋白注释为14kdaphosphohistidinephosphatase，中文名称为14kda磷酸组氨酸磷酸酶；s10、检索号o75368，蛋白注释为sh3domain-bindingglutamicacid-rich-likeprotein，中文名称为sh3域结合谷氨酸丰富蛋白样蛋白；s11、检索号为p25205，蛋白注释为dnareplicationlicensingfactormcm3，中文名称为dna复制许可因子mcm3；s12、检索号为p06312，蛋白注释为immunoglobulinkappavariable4-1，中文名称为免疫球蛋白kappa变量4-1；s13、检索号为p50897，蛋白注释为palmitoyl-proteinthioesterase1，中文名称为棕榈酰蛋白硫酯酶1；s14、检索号为p07741，蛋白注释为adeninephosphoribosyltransferase，中文名称为腺嘌呤磷酸核糖转移酶；s15、检索号o95864，蛋白注释为acyl-coa6-desaturase，中文名称为酰基辅酶a去饱和酶；s16、检索号为q14566，蛋白注释为dnareplicationlicensingfactormcm6，中文名称为dna复制许可因子mcm6；s17、检索号为p27348，蛋白注释为14-3-3proteintheta，中文名称为14-3-3蛋白θ；下调蛋白如下：x1、检索号为p15311，蛋白注释为ezrin，中文名称为埃兹蛋白；x2、检索号为q9y6n5，蛋白注释为sulfide:quinoneoxidoreductase,mitochondrial，中文名称为线粒体硫化物醌氧化还原酶；x3、检索号为q9uhl4，蛋白注释为dipeptidylpeptidase2，中文名称为二肽基肽酶2；x4、检索号为p55809，蛋白注释为succinyl-coa:3-ketoacidcoenzymeatransferase1,mitochondrial，中文名称为线粒体琥珀酰辅酶a:3酮酸辅酶a转移酶；x5、检索号为p14923，蛋白注释为junctionplakoglobin，中文名称为连接桥粒斑珠蛋白；x6、检索号为p33121，蛋白注释为long-chain-fatty-acid--coaligase1，中文名称为长链脂肪酸辅酶a连接酶1；x7、检索号为o95870，蛋白注释为proteinabhd16a，中文名称为abhd16a蛋白；x8、检索号为q14160，蛋白注释为proteinscribblehomolog，中文名称为蛋白scribble类似物；x9、检索号为p12830，蛋白注释为cadherin-1，中文名称为钙粘素1；x10、检索号为q8ney4，蛋白注释为v-typeprotonatpasesubunitc2，中文名称为v型质子atp酶亚基c2；x11、检索号为p36578，蛋白注释为60sribosomalproteinl4，中文名称为60s核糖体蛋白l4；x12、检索号为p43304，蛋白注释为glycerol-3-phosphatedehydrogenase,mitochondrial，中文名称为线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶；x13、检索号为o95359，蛋白注释为transformingacidiccoiled-coil-containingprotein2，中文名称为转化酸性含卷曲螺旋蛋白2；x14、检索号为q14764，蛋白注释为majorvaultprotein，中文名称为穹窿体主蛋白；x15、检索号为p25705，蛋白注释为atpsynthasesubunitalpha,mitochondrial，中文名称为线粒体atp合酶α亚基；x16、检索号为p04040，蛋白注释为catalase，中文名称为过氧化氢酶；x17、检索号为q7z3d6，蛋白注释为d-glutamatecyclase,mitochondrial，中文名称为线粒体谷氨酸环化酶；x18、检索号为p23229，蛋白注释为integrinalpha-6，中文名称为整合素α6；x19、检索号为q53fz2，蛋白注释为acyl-coenzymeasynthetaseacsm3,mitochondrial，中文名称为线粒体丁酰基辅酶a合成酶3；x20、检索号为q13740，蛋白注释为cd166antigen，中文名称为白细胞分化抗原166；x21、检索号为q14244，蛋白注释为ensconsin，中文名称为上皮细胞微管相关蛋白7；x22、检索号为q9upn3，蛋白注释为microtubule-actincross-linkingfactor1,isoforms1/2/3/5，中文名称为微管肌动蛋白交联因子1,1/2/3/5亚基；x23、检索号为o95831，蛋白注释为apoptosis-inducingfactor1,mitochondrial，中文名称为线粒体凋亡诱导因子1；x24、检索号为q9nz43，蛋白注释为vesicletransportproteinuse1，中文名称为囊泡转运蛋白use1；x25、检索号为p05023，蛋白注释为sodium/potassium-transportingatpasesubunitalpha-1，中文名称为钠钾atp酶α亚基1；x26、检索号为q6ian0，蛋白注释为dehydrogenase/reductasesdrfamilymember7b，中文名称为脱氢酶/还原酶sdr家族成员7b；x27、检索号为q9h6s3，蛋白注释为epidermalgrowthfactorreceptorkinasesubstrate8-likeprotein2，中文名称为表皮生长因子受体激酶底物8类蛋白2；x28、检索号为q7z404，蛋白注释为transmembranechannel-likeprotein4，中文名称为跨膜离子通道样蛋白4；x29、检索号为p17931，蛋白注释为galectin-3，中文名称为半乳糖凝集素3；x30、检索号为q9nnw7，蛋白注释为thioredoxinreductase2,mitochondrial，中文名称为线粒体硫氧还蛋白还原酶2；x31、检索号为p16435，蛋白注释为nadph--cytochromep450reductase，中文名称为nadph-细胞色素p450还原酶；x32、检索号为p06576，蛋白注释为atpsynthasesubunitbeta,mitochondrial，中文名称为线粒体atp合成酶β亚基；x33、检索号为q15067，蛋白注释为peroxisomalacyl-coenzymeaoxidase1，中文名称为过氧化物酶酰基辅酶a氧化酶1；x34、检索号为q6ibs0，蛋白注释为twinfilin-2，中文名称为双解丝蛋白2；x35、检索号为p35232，蛋白注释为prohibitin，中文名称为抗增殖蛋白；x36、检索号为q9udy2，蛋白注释为tightjunctionproteinzo-2，中文名称为紧密连接蛋白zo-2；x37、检索号为p30043，蛋白注释为flavinreductasenadph，中文名称为黄素还原酶nadph；x38、检索号为p16144，蛋白注释为integrinbeta-4，中文名称为整合素β4；x39、检索号为q99685，蛋白注释为monoglyceridelipase，中文名称为单甘油酯脂肪酶；x40、检索号为q9hcc0，蛋白注释为methylcrotonoyl-coacarboxylasebetachain,mitochondrial，中文名称为线粒体甲基丁烯酰辅酶a羧化酶β链；x41、检索号为q93050，蛋白注释为v-typeprotonatpase116kdasubunitaisoform1，中文名称为v型质子atp酶116kda亚基a亚型1；x42、检索号为q9y2e5，蛋白注释为epididymis-specificalpha-mannosidase，中文名称为附睾特异甘露糖苷酶α；x43、检索号为q14573，蛋白注释为inositol1,4,5-trisphosphatereceptortype3，中文名称为肌醇1,4,5-三磷酸受体；x44、检索号为p05166，蛋白注释为propionyl-coacarboxylasebetachain,mitochondrial，中文名称为线粒体丙酰辅酶a羧化酶β链；x45、检索号为o95571，蛋白注释为persulfidedioxygenaseethe1,mitochondrial，中文名称为线粒体硫双加氧酶ethe1；x46、检索号为o15229，蛋白注释为kynurenine3-monooxygenase，中文名称为犬尿氨酸-3-单加氧酶；x47、检索号为p55196，蛋白注释为afadin，中文名称为丝状肌动蛋白结合蛋白抗体；x48、检索号为p16615，蛋白注释为nadph--cytochromep450reductase，中文名称为肌浆/内质网钙atp酶2；x49、检索号为p24752，蛋白注释为acetyl-coaacetyltransferase,mitochondrial，中文名称为线粒体乙酰辅酶a乙酰转移酶；x50、检索号为p52943，蛋白注释为cysteine-richprotein2，中文名称为富含半胱氨酸蛋白2；x51、检索号为q99623，蛋白注释为prohibitin-2，中文名称为抗增殖蛋白2；x52、检索号为q02487，蛋白注释为desmocollin-2，中文名称为桥粒芯胶蛋白2；x53、检索号为p16422，蛋白注释为epithelialcelladhesionmolecule，中文名称为上皮细胞粘附分子；x54、检索号为q9uh62，蛋白注释为armadillorepeat-containingx-linkedprotein3，中文名称为arm重复x连锁蛋白3；x55、检索号为q9uk76，蛋白注释为jupitermicrotubuleassociatedhomolog1，中文名称为微管相关蛋白1-jupiter；x56、检索号为q13423，蛋白注释为nad(p)transhydrogenase,mitochondrial，中文名称为线粒体nad(p)转氢酶；x57、检索号为q9c040，蛋白注释为tripartitemotif-containingprotein2，中文名称为三结构域蛋白2；x58、检索号为p47914，蛋白注释为60sribosomalproteinl29，中文名称为60s核糖体蛋白l29；x59、检索号为q9p2r7，蛋白注释为succinate--coaligase[adp-forming]subunitbeta,mitochondrial，中文名称为线粒体琥珀酸辅酶a连接酶β亚基；x60、检索号为q96ag4，蛋白注释为leucine-richrepeat-containingprotein59，中文名称为富含亮氨酸重复蛋白59；x61、检索号为q8wuy1，蛋白注释为proteinthem6，中文名称为硫酯酶超家族成员6；x62、检索号为p22695，蛋白注释为cytochromeb-c1complexsubunit2,mitochondrial，中文名称为线粒体细胞色素b-c1复合体亚基2；x63、检索号为o00515，蛋白注释为ladinin-1，中文名称为线皮素-1；x64、检索号为q15063，蛋白注释为periostin，中文名称为骨膜蛋白；x65、检索号为p23786，蛋白注释为carnitineo-palmitoyltransferase2,mitochondrial，中文名称为线粒体肉毒碱棕榈酰基转移酶2；x66、检索号为q92522，蛋白注释为histoneh1x，中文名称为组蛋白h1x；x67、检索号为p62424，蛋白注释为60sribosomalproteinl7a，中文名称为60s核糖体蛋白l7a。本发明的子宫内膜受容性的生物标志物的有益效果是：本发明首次提供了一组子宫内膜受容性的生物标志物，可以为不孕症患者的早期发现和诊断、靶向干预及指导胚胎移植时机提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。本发明的目的之二，是提供上述子宫内膜受容性的生物标志物的筛选方法。本发明首次通过同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification，简称itraq)蛋白质组学技术筛选在子宫内膜受容性中差异表达的蛋白质，为子宫内膜受容性标志物的筛选开辟了一条新的途径，为不孕症患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述子宫内膜受容性的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：步骤1：蛋白质提取；步骤2：对步骤1提取后的蛋白质进行蛋白质定量、fasp酶解、itraq试剂标记、第一维高ph反向色谱分离、第二维反相液质联用质谱分析；步骤3：对步骤2得到的数据进行进行检索和分析，筛选出差异大于1.3倍的差异蛋白，即得到子宫内膜受容性的生物标志物。本发明的子宫内膜受容性的生物标志物的筛选方法的有益效果：本发明首次通过同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification，简称itraq)蛋白质组学技术筛选在子宫内膜受容性中差异表达的蛋白质，为子宫内膜受容性标志物的筛选开辟了一条新的途径，为不孕症患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，步骤1中，所述蛋白质提取的具体方法为：取300mg子宫内膜的组织样本，用液氮研磨成粉末，加入500μl的l3裂解液和5μl苯甲基磺酰氟溶液，溶解后，超声处理，离心，收集上清液；取250μl上清液，加入1ml丙酮，-20℃沉淀过夜，再离心，倒去上清液，干燥，即得到提取后的蛋白质样品。采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以将子宫内膜的组织样本中的蛋白质提取出来。更进一步，所述l3裂解液由如下方法配制得到：取尿素210g、硫脲76g、三羟甲基氨基甲烷1.2g和十二烷基硫酸钠1g，调节ph值为8.4，纯水定容到500ml；所述苯甲基磺酰氟溶液的浓度为1.32mol/l；所述超声处理的功率为300w，开1s，停1s，共10min；所述离心的转速均为12000r/min，时间均为20min；所述干燥的温度为25℃，时间为20s。进一步，步骤2中，所述蛋白质定量的具体方法为：在步骤1提取后的蛋白质中，按质量体积比为10mg:1ml，加入l3裂解液，溶解后，超声处理，吸出上清液；分别取5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg和35μg的牛血清白蛋白制作标准曲线；取2μl步骤1提取后的蛋白质样品，加入1ml考马斯亮蓝g-250染色剂进行染色，涡旋振荡20s，充分混匀后测定595nm下的吸光值，根据标准曲线计算各样品的蛋白质浓度。更进一步，所述l3裂解液由如下方法配制得到：取尿素210g、硫脲76g、三羟甲基氨基甲烷1.2g和十二烷基硫酸钠1g，调节ph值为8.4，纯水定容到500ml；所述超声处理的功率为100w，开0.8s，关0.8s，共4个循环。进一步，步骤2中，所述fasp酶解具体为：取200μg定量后的蛋白质样品，加入4μl三羧乙基膦还原剂，于60℃反应1h；加入2μl甲基甲烷巯基磺酸阻断剂，室温反应30min；离心，弃掉底部溶液后，加入ph值为8.5、100μl8mol/l的尿素溶液，弃掉底部溶液，再重复本操作1次；加入100μl0.25mol/l的四乙基溴化铵缓冲溶液，弃掉底部溶液后，再重复本操作2次；加入50μl0.5mol/l的四乙基溴化铵缓冲溶液，加入2μg胰蛋白酶，37℃反应过夜；加入2μg胰蛋白酶，37℃反应4h，离心，得沉淀物和上清液；将沉淀物加入50μl0.5mol/l的四乙基溴化铵缓冲溶液，离心，与前一步离心后的上清液合并，得到酶解后的样品。采用上述进一步的有益效果是：fasp酶解，即滤器辅助样品制备(filteraidedproteomepreparation,简称fasp)酶解。fasp酶解是最近几年发展起来的一种对质谱样品前期处理的方法。该方法首先通过sds完全溶解蛋白质组样品，然后通过超滤装置用8mol/l尿素缓冲液将sds缓冲液替换出来，避免sds对蛋白质消化和质谱分析的干扰。超滤装置被认为是一个“蛋白质组反应器”，可除去去污剂，实现缓冲液的替换，减少化学修饰。随后通过两步酶切，从而实现蛋白的完全溶液酶切。更进一步，所述离心的转速均为12000r/min，时间均为20min，温度均为4℃。采用上述更进一步的有益效果是：采用上述参数，离心的效果更好。进一步，步骤2中，所述第一维高ph反向色谱分离具体为：流动相a为ddh2o，ph值为10，色谱纯氨水调节ph值；流动相b为80％乙腈，20％ddh2o，ph值为10，色谱纯氨水调节ph值；先用95％体积的a相和5％体积的b相平衡柱子30min，然后将标记后抽干的混合多肽用100μl的a相复溶；进样，以0.2ml/min的流速进行梯度洗脱；梯度洗脱条件如下，其中流动相b的比例均为体积百分比：0min-5min，5％b；5min-10min，5％-10％b；10min-60min，10％-40％b；60min-65min，40％-95％b；65min-75min，保持95％b；75min-85min，95％-5％b；整个洗脱过程在214nm吸光度下进行监测，从线性梯度开始根据峰型收取20个组分，每1管每60s接1次，梯度为85min，反复循环接样；根据峰型和时间共收取20个组分，真空干燥后，进行第二维反相液质联用质谱分析。采用上述更进一步的有益效果是：采用上述参数，将itraq标记处理后的肽段分离更加充分。进一步，步骤2中，所述第二维反相液质联用质谱分析具体为：流动相a为0.1％体积甲酸，流动相b为0.1％体积甲酸，80％体积乙腈；肽段用样品溶解液溶解，所述样品溶解液为0.1％体积甲酸和5％体积乙腈，充分振荡涡旋，13500rpm，4℃离心20min，每个组分取3μg上清液进行第二维反相液质联用质谱分析；梯度洗脱条件如下，其中流动相b的比例均为体积百分比：0min-5min，5％b；5min-8min，5％-10％b；8min-40min，10％-30％b；40min-45min，30％-35％b；45min-50min，35％-90％b；50min-55min，保持90％b；55min-56min，90％-5％b；56min-65min，保持5％b；每个组分分析时间为65min，流速为300nl/min；质谱参数：分离后的肽段直接进入质谱仪thermoscientificqexactive进行在线检测，具体参数如下：一级质谱参数：分辨率70,000atm/z，最大离子强度：3e6，最大注入时间：100ms，扫描范围：350m/z-1800m/z；二级质谱参数：分辨率：17,500atm/z，最大离子强度：5e4，最大注入时间：120ms，母离子选择20个，碰撞能量：30ev。采用上述更进一步的有益效果是：采用上述方法，可以将肽段进行快速鉴定。本发明的目的之三，是提供一种用于检测子宫内膜受容性的试剂盒。本发明的用于检测子宫内膜受容性的试剂盒中含有上述子宫内膜受容性标志物，可以为不孕症患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于检测子宫内膜受容性的试剂盒，包括上述子宫内膜受容性标志物。本发明的用于检测子宫内膜受容性的试剂盒的有益效果：本发明的用于检测子宫内膜受容性的试剂盒中含有上述子宫内膜受容性标志物，可以为不孕症患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。附图说明图1为本发明的实施例中，牛血清白蛋白的标准曲线。图2为本发明的实施例中，子宫内膜受容性的生物标志物的差异蛋白表达的热图。具体实施方式以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。一、入排标准入组标准：女方年龄小于等于40岁、月经周期规律(25-31天)、自然周期、月经周期19-21天时取样、内膜腺体与间质发育同步、取样时内膜厚度大于等于7毫米、内膜取样与胚胎移植间隔小于等于3个月。排除标准：患者患有亲本染色体异常、地中海贫血、子宫病变(疤痕子宫、子宫肌瘤、子宫内膜异位症)、盆腔黏连、复发性流产、胚胎反复种植失败任一疾病。定义：妊娠阳性组，胚胎移植3-4周后，b超下有可见孕囊及胎心，妊娠满三个月未流产；妊娠阴性组：胚胎移植3-4周后，b超下未见孕囊及胎心。二、依据上述入组标准，本实验共招募妊娠阳性组9例、妊娠阴性组8例。患者基本信息如表1所示：表1患者基本信息组别年龄(岁)内膜厚度(毫米)移植胚胎数获卵数妊娠阳性组(9例)32.6±4.510.0±0.71.6±0.914.6±3.0妊娠阴性组(8例)31.9±1.911.0±1.91.4±0.514.7±3.6三、子宫内膜受容性的生物标志物的筛选上述样本进行宫内膜受容性的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：步骤1：蛋白质提取，具体方法为：取300mg子宫内膜的组织样本，用液氮研磨成粉末，加入500μl的l3裂解液和5μl苯甲基磺酰氟溶液，溶解后，超声处理，离心，收集上清液；取250μl上清液，加入1ml丙酮，-20℃沉淀过夜，再离心，倒去上清液，干燥，即得到提取后的蛋白质样品。其中，所述l3裂解液由如下方法配制得到：取尿素210g、硫脲76g、三羟甲基氨基甲烷1.2g和十二烷基硫酸钠1g，调节ph值为8.4，纯水定容到500ml；所述苯甲基磺酰氟溶液的浓度为1.32mol/l；所述超声处理的功率为300w，开1s，停1s，共10min；所述离心的转速均为12000r/min，时间均为20min；所述干燥的温度为25℃，时间为20s。随机从两组标本中各抽取6例标本，进行以下实验。步骤2：对步骤1提取后的蛋白质进行蛋白质定量、fasp酶解、itraq试剂标记、第一维高ph反向色谱分离、第二维反相液质联用质谱分析。其中，所述蛋白质定量的具体方法为：在步骤1提取后的蛋白质样品中，按质量体积比为10mg:1ml，加入l3裂解液，溶解后，超声处理，吸出上清液；分别取5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg和35μg的牛血清白蛋白制作标准曲线；取2μl步骤1提取后的蛋白质样品，加入1ml考马斯亮蓝g-250染色剂进行染色，涡旋振荡20s，充分混匀后测定595nm下的吸光值，根据图1的标准曲线，计算各样品的蛋白浓度。所述l3裂解液由如下方法配制得到：取尿素210g、硫脲76g、三羟甲基氨基甲烷1.2g和十二烷基硫酸钠1g，调节ph值为8.4，纯水定容到500ml；所述超声处理的功率为100w，开0.8s，关0.8s，共4个循环。所述fasp酶解具体为：取200μg定量后的蛋白质样品，加入4μl三羧乙基膦还原剂，于60℃反应1h；加入2μl甲基甲烷巯基磺酸阻断剂，室温反应30min；离心，弃掉底部溶液后，加入ph值为8.5、100μl8mol/l的尿素溶液，弃掉底部溶液，再重复本操作1次；加入100μl0.25mol/l的四乙基溴化铵缓冲溶液，弃掉底部溶液后，再重复本操作2次；加入50μl0.5mol/l的四乙基溴化铵缓冲溶液，加入2μg胰蛋白酶，37℃反应过夜；加入2μg胰蛋白酶，37℃反应4h，离心，得沉淀物和上清液；将沉淀物加入50μl0.5mol/l的四乙基溴化铵缓冲溶液，离心，与前一步离心后的上清液合并，得到酶解后的样品。所述第一维高ph反向色谱分离具体为：流动相a为ddh2o，ph值为10，色谱纯氨水调节ph值；流动相b为80％乙腈，20％ddh2o，ph值为10，色谱纯氨水调节ph值；先用95％体积的a相和5％体积的b相平衡柱子30min，然后将标记后抽干的混合多肽用100μl的a相复溶；进样，以0.2ml/min的流速进行梯度洗脱；梯度洗脱条件如下，其中流动相b的比例均为体积百分比：0min-5min，5％b；5min-10min，5％-10％b；10min-60min，10％-40％b；60min-65min，40％-95％b；65min-75min，保持95％b；75min-85min，95％-5％b；整个洗脱过程在214nm吸光度下进行监测，从线性梯度开始根据峰型收取20个组分，每1管每60s接1次，梯度为85min，反复循环接样；根据峰型和时间共收取20个组分，真空干燥后，进行第二维反相液质联用质谱分析。所述第二维反相液质联用质谱分析具体为：流动相a为0.1％体积甲酸，流动相b为0.1％体积甲酸，80％体积乙腈；肽段用样品溶解液溶解，所述样品溶解液为0.1％体积甲酸和5％体积乙腈，充分振荡涡旋，13500rpm，4℃离心20min，每个组分取3μg上清液进行第二维反相液质联用质谱分析；梯度洗脱条件如下，其中流动相b的比例均为体积百分比：0min-5min，5％b；5min-8min，5％-10％b；8min-40min，10％-30％b；40min-45min，30％-35％b；45min-50min，35％-90％b；50min-55min，保持90％b；55min-56min，90％-5％b；56min-65min，保持5％b；每个组分分析时间为65min，流速为300nl/min；质谱参数：分离后的肽段直接进入质谱仪thermoscientificqexactive进行在线检测，具体参数如下：一级质谱参数：分辨率70,000atm/z，最大离子强度：3e6，最大注入时间：100ms，扫描范围：350m/z-1800m/z；二级质谱参数：分辨率：17,500atm/z，最大离子强度：5e4，最大注入时间：120ms，母离子选择20个，碰撞能量：30ev。步骤3：对步骤2得到的数据进行进行检索和分析，最终共鉴定5213个可信蛋白，与妊娠阳性组相比，妊娠阴性组中鉴定到的1.3倍以上表达的差异蛋白共84个，其中上调蛋白17个，下调蛋白67个，如表2和图2所示。表2妊娠阴性组与阳性组差异蛋白汇总由此可见，本发明首次通过同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification，简称itraq)蛋白质组学技术筛选在子宫内膜受容性中差异表达的蛋白质，为子宫内膜受容性标志物的筛选开辟了一条新的途径，为不孕症患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12