一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试剂盒，属于新型冠状病毒2019-ncov检测
技术领域：
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背景技术：
：免疫印迹法(westernblotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，用于组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。传统免疫印迹法分三个阶段进行。第一阶段为sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)：抗原等蛋白样品经sds处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向原理阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压和大电流，通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的hrp底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据sds-page时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。传统免疫印迹法综合了sds-page的高分辨力和elisa法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。但是该方法操作繁琐、步骤多，生产工艺复杂，不易形成商品化的产品。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征(sars)等较严重的疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。世界卫生组织将这种新型冠状病毒引起的疾病命名为2019年冠状病毒病(covid-19)，致死性病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sars-cov-2)。冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白(spikeprotein)、包膜蛋白(envelopeprotein，e蛋白)、膜蛋白(membraneprotein)和核衣壳蛋白(nucleocapsid，n蛋白)。棘突蛋白(spikeprotein)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基(subunit)，s1和s2。其中s1主要包含有受体结合区(receptorbindingdomain，rbd蛋白)，负责识别细胞的受体。s2含有膜融合过程所需的基元件。棘突蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。sars-cov-2(2019-ncov)的棘突蛋白与人ace2互作来感染人的呼吸道上皮细胞。核衣壳蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。在病毒体组装过程中，n蛋白与病毒rna结合并导致螺旋核衣壳的形成。核衣壳蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。目前，血清抗体检测主要是免疫层析法，该方法操作简单，对设备要求低，甚至无需检测设备；检测时间短；对于检测环境要求不高，一般15分钟左右即可出结果。该方法的缺点是侧向层析方法使用1种最多2种蛋白进行检测，没有清洗过程，由于个别患者血液中含有类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体，以及药物和肿瘤细胞等，易造成试验的交叉反应，出现假阳性的结果。也有少部分的免疫印迹法，但是试纸条制备需要通过电泳和转膜操作，仪器和操作要求高。因此，急需一种使用方便、适合大规模的人群筛查、能避免假阴性和假阳性问题、灵敏度和特异性高、可以用于病程监控和疫苗效果评价的新型冠状病毒检测试剂盒。技术实现要素：针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试剂盒。该检测试剂盒中含有检测所需的特制膜条(多种新冠抗原组合划线)、孵育槽、镊子以及样本稀释液等液体组分，并且合理使用容器盛装，设置各组分的位置摆放，使用人员按照说明书操作手工即可完成体外定性检测人血清或血浆样本中的新型冠状病毒抗体，同时也能适用自动免疫印迹分析仪高效完成检测，该试剂盒能有效增加灵敏度和特异性，及时发现早期感染者，同时可以用于康复患者体内抗体的评价诊断进行病程监控，未来更可广泛用于疫苗人体效果的评估。本发明提供了一种新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试剂盒，技术方案如下：一种新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试剂盒，所述检测试剂盒中含检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体、底物、孵育槽、镊子、说明书和自封袋；所述检测试纸条包括划有3条或4条检测线和1条质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线上固定有新型冠状病毒抗原；所述新型冠状病毒抗原为重组s1蛋白、重组rbd蛋白、重组n蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组s1蛋白、重组rbd蛋白、重组e蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组s1蛋白、重组rbd蛋白、重组n蛋白、重组e蛋白。进一步地，所述底物由底物a和底物b等体积混合而得，底物a为ph为7-8的三羟甲基氨基甲烷溶液；底物b为h2o2和3,3-二氨基联苯胺的混合溶液；所述检测试纸条使用白色聚丙烯材质的桶装；所述样本稀释液、底物a和洗脱液使用白色聚丙烯材质的瓶装；所述检测抗体和底物b使用棕色聚丙烯材质的瓶装。进一步地，所述说明书为纸质；所述镊子和孵育槽为聚丙烯材质；所述自封袋为聚乙烯材质。进一步地，所述质控线上固定有羊抗鼠igg。进一步地，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg抗体或igm抗体或iga抗体或ige抗体。进一步地，所述样本稀释液为ph为7-8的磷酸盐缓冲液。进一步地，所述洗脱液为添加了吐温-20的ph为7-8的磷酸盐缓冲液。进一步地，所述检测试纸条的宽度为3.5-4.0mm。进一步地，所述新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试纸条中，pvc胶板长度为5-6cm，印有流水号的标签纸长度为1.1-1.2cm，硝酸纤维素膜长度为4-5cm，交互重叠部分为0.1-0.2cm，重叠部分印有流水号的标签纸在上，硝酸纤维素膜在下，质控线与印有流水号的标签纸间隔0.9-1.1cmm，质控线与相邻的检测线间隔0.9-1.1cm，各检测线间隔0.4-0.6cm。进一步地，所述检测试剂盒中还含有说明书。进一步地，所述重组s1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。进一步地，所述重组rbd蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。进一步地，所述重组n蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。进一步地，所述重组e蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示。进一步地，所述重组抗原s1蛋白、重组抗原rbd蛋白、重组抗原n蛋白、重组抗原e蛋白的划线浓度分别为0.2-0.5mg/ml(1μl/cm)、0.2-0.5mg/ml(1μl/cm)、0.1-0.2mg/ml(1μl/cm)、0.1-0.2mg/ml(1μl/cm)。进一步地，所述羊抗鼠igg的划线浓度为0.2-1mg/ml(1μl/cm)。本发明还提供了上述的一种新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试剂盒的使用方法，技术方案如下：一种新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试剂盒的使用方法，所述使用方法具体包括以下步骤：(1)润湿：在反应槽中放入检测试纸条，加入样本稀释液，15-25℃条件下，混匀1-2min；所述样本稀释液为ph为7-8的磷酸盐缓冲液；(2)一次孵育：加入人血清或血浆样本，15-25℃条件下进行孵育30-60min；(3)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入洗脱液，15-25℃条件下进行孵育4-6min；重复清洗一次；(4)二次孵育：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入检测抗体，15-25℃条件下进行孵育30-60min；所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg抗体或igm抗体或iga抗体或ige抗体；(5)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入洗脱液，15-25℃条件下进行孵育4-6min；(6)清洗：倒掉反应槽内液体，重复清洗一次；(7)显色：倒掉反应槽内液体，将反应槽进行控干，在反应槽中加入底物，避光反应2-10min；若有两条以上的条带显色，则新型冠状病毒抗体检测结果为阳性；若无条带显色，则新型冠状病毒抗体检测结果为阴性。本发明有益的技术效果在于：本发明提供的检测试剂盒通过多种新型冠状病毒特异性重组抗原联合检测血清或血浆样本中的抗体，可用于体外定性检测人血清或血浆样本中的新型冠状病毒抗体，有效增加灵敏度和特异性，及时发现早期感染者，同时可以用于康复患者体内抗体的评价诊断进行病程监控，未来更可广泛用于疫苗人体效果的评估。本发明提供的试剂盒组分少，生产过程简单，生产成本降低，易于放大生产；检测过程便捷，易于实现全自动化。附图说明图1为本发明中使用的检测试纸条的侧面示意图，其中，t1、t2、t3、t4分别表示不同的检测线，不同的检测线上划有不同的新型冠状病毒抗原条带。图2为本发明实施例1中使用的检测试纸条示意图。图3为本发明实施例2中使用的检测试纸条示意图。图4为本发明实施例3中使用的检测试纸条示意图。具体实施方式重组s1蛋白制备：通过合成编码新型冠状病毒2019-ncovspike蛋白的全长基因，并利用pcr的方法将合成的基因构建到小鼠iggfc的表达载体pcmv6-c.mfc上，得到重组质粒；将重组质粒转染hek293细胞分泌表达融合蛋白，并通过proteina进行亲和纯化而获取。理论mw:76.5kd。重组rbd蛋白制备：通过合成编码新型冠状病毒2019-ncovspike蛋白的第319位arg到541位phe的基因，并利用pcr的方法将合成的基因构建到小鼠iggfc的表达载体pcmv6-c.mfc上，得到重组质粒；将重组质粒转染hek293细胞分泌表达融合蛋白，并通过proteina进行亲和纯化而获取。理论mw:52kd。重组n蛋白制备：通过合成编码新型冠状病毒2019-ncov核衣壳蛋白完整的基因，并利用pcr的方法将合成的基因构建到pet28a-n-his的表达载体上得到重组质粒；将重组质粒转大肠杆菌，表达重组蛋白，并通过镍柱进行亲和纯化而获取。理论mw:46.5kd。重组e蛋白制备：通过合成编码新型冠状病毒2019-ncov包膜蛋白完整的基因，并利用pcr的方法将合成的基因构建到his-c-pet28a-n-gst的表达载体上。测序正确的质粒制备后转大肠杆菌，表达重组蛋白，并通过镍柱进行亲和纯化而获取。理论mw:36.8kd。检测试纸条蛋白划线浓度选择：显色深度以“+”表示；“+++”代表最强。检测方法：蛋白划线制成检测试纸条后，加入胶体金平台假阳样本和阳性样本、检测抗体和底物，观察条带显色强度。如表1-5所示。表1不同羊抗鼠igg抗体划线浓度对颜色的影响；单位：mg/ml(1μl/cm)阳性样本假阳样本1#假阳样本2#假阳样本3#1mg/ml++++++++++++0.5mg/ml++++++++++++0.2mg/ml++++++++0.1mg/ml++++表2不同重组s1蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/ml(1μl/cm)阳性样本假阳样本1#假阳样本2#假阳样本3#1mg/ml++++--0.5mg/ml+++---0.2mg/ml++---0.1mg/ml----表3不同重组rbd蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/ml(1μl/cm)阳性样本假阳样本1#假阳样本2#假阳样本3#1mg/ml+++--+0.5mg/ml+++---0.2mg/ml++---0.1mg/ml----表4不同重组n蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/ml(1μl/cm)表5不同重组e蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/ml(1μl/cm)阳性样本假阳样本1#假阳样本2#假阳样本3#1mg/ml++++--0.5mg/ml+++---0.2mg/ml+++---0.1mg/ml++---确定划线浓度如下：0.2-1mg/ml(1μl/cm)的羊抗鼠igg抗体；0.2-0.5mg/ml(1μl/cm)的重组s1蛋白；0.2-0.5mg/ml(1μl/cm)的重组rbd蛋白；0.1-0.2mg/ml(1μl/cm)的重组n蛋白；0.1-0.2mg/ml(1μl/cm)的重组e蛋白。检测时间和温度的选择：室温下，样本孵育时间设置为30min、40min、1h；检测抗体孵育时间设置为30min、40min、1h；根据不同孵育时间，对阳性样本的检测显色强度，确定检测孵育的适宜时间为：样本：40min、检测抗体：40min。温度设置为4℃、22℃、37℃，孵育时间设置为样本：40min、检测抗体：40min；根据不同温度，对阳性样本的检测显色强度，确定检测孵育的适宜温度为：室温(15-25℃)利用本发明提供的检测试剂盒检测新型冠状病毒2019-ncov抗体的方法：(1)润湿：在反应槽中放入检测试纸条，加入样本稀释液1ml，室温(15-25℃)条件下，混匀1min；(2)一次孵育：加入样本(人血浆或血清)1ml，室温(15-25℃)条件下进行孵育40min；(3)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1ml洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育5min；重复清洗一次；(4)二次孵育：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1ml检测抗体，室温(15-25℃)条件下进行孵育40min；(5)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1ml洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育5min；(6)清洗：倒掉反应槽内液体，重复清洗一次；(7)显色：倒掉反应槽内液体，将反应槽进行控干，在反应槽中加入200μl底物，避光反应5min。观察条带是否显色以及条带深浅。当两个及两个以上条带显色时，新型冠状病毒抗体检测结果为阳性，显色越深，抗体含量越高；当所有条带均不显色时，新型冠状病毒抗体检测结果为阴性。下面结合实施例，对本发明进行具体描述。下述实施例中的检测试纸条宽度为3.5-4.0mm，pvc胶板长度为5-6cm，印有流水号的标签纸长度为1.1-1.2cm，硝酸纤维素膜长度为4-5cm，交互重叠部分为0.1-0.2cm，重叠部分印有流水号的标签纸在上，硝酸纤维素膜在下，质控线与印有流水号的标签纸间隔0.9-1.1cmm，质控线与相邻的检测线间隔0.9-1.1cm，各检测线间隔0.4-0.6cm。实施例1检测试纸条的制备：1、试剂制备：1.1蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999ml溶解，吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。1.2封闭液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g，牛血清白蛋白10g，加纯水900ml溶解，加入naoh溶液调整ph至7.4。吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。2-8℃条件下放置备用。2、制备步骤：2.1硝酸纤维素膜裁成长宽为31cm×5cm大小，将4种高纯度的特异性的重组s1蛋白、重组rbd蛋白、重组n蛋白、重组e蛋白分别在硝酸纤维素膜上进行划线，得到4条检测线(划线浓度分别为0.2mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.1mg/ml，划线量均为1μl/cm)，如图1和图2所示(各检测线在硝酸纤维素膜上的分布次序对检测结果不产生显著影响)；2.2将羊抗鼠igg在膜板上进行划线(质控线，c线；划线浓度为0.5mg/ml，划线量为1μl/cm)；2.337℃进行烘干2小时；2.4将烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，室温(15-25℃)条件下，完全浸泡1小时；2.537℃进行烘干2小时；2.6将第二次烘干后的硝酸纤维素膜和印有流水号的标签纸依次粘贴在pvc胶板上，切成3.5-4.0mm宽度，即为新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试纸条。样本稀释液的配制：0.1m、ph7.4磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999ml溶解，吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。洗脱液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5ml溶解，分别吸取1mlproclin300和1.5ml吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。底物a的配制：称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900ml溶解，加hcl调整ph至ph7.5。定容至1000ml。常温放置备用。底物b的配制：量取30％h2o20.1ml，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100ml。2-8℃条件放置备用。底物制备：将底物a和底物b等体积混合。现配现用。抗体稀释液制备：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白20g，加纯水900ml溶解，加naoh溶液调整ph至ph7.5。吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。2-8℃条件下放置备用。检测抗体制备方法：将辣根过氧化物酶(hrp)标记的鼠抗人igg抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓度为0.5μg/ml，混匀，2-8℃条件下放置备用。将检测试纸条、样本稀释液、检测抗体、洗脱液、底物a、底物b、孵育槽、自封袋分别按不小于某一检测次数的用量组合、包装，形成试剂盒，将镊子、说明书一同放入试剂盒中。其中，检测试纸条使用白色聚丙烯材质的桶装；所述样本稀释液、底物a和洗脱液使用白色聚丙烯材质的瓶装；所述检测抗体和底物b使用棕色聚丙烯材质的瓶装；所述说明书为纸质；所述镊子和孵育槽为聚丙烯材质；所述自封袋为聚乙烯材质。实施例2检测试纸条的制备：1、试剂制备：1.1蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999ml溶解，吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。1.2封闭液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白10g，加纯水900ml溶解，加入naoh溶液调整ph至7.4。吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。2-8℃条件下放置备用。2、制备步骤：2.1硝酸纤维素膜裁成长宽为31cm×5cm大小，将3种高纯度的特异性的重组s1蛋白、重组rbd蛋白、重组n蛋白分别在硝酸纤维素膜上进行划线，得到3条检测线(划线浓度分别为0.3mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml，划线量均为1μl/cm)，如图3所示(各检测线在硝酸纤维素膜上的分布次序对检测结果不产生显著影响)；2.2将羊抗鼠igg在膜板上进行划线(质控线，c线；划线浓度为0.2mg/ml，划线量为1μl/cm)；2.337℃进行烘干2小时；2.4将烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，室温(15-25℃)条件下，完全浸泡1小时；2.537℃进行烘干2小时；2.6将第二次烘干后的硝酸纤维素膜和印有流水号的标签纸依次粘贴在pvc胶板上，切成3.5-4.0mm宽度，即为新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试纸条。样本稀释液的配制：0.1m、ph7.4磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999ml溶解，吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。洗脱液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5ml溶解，分别吸取1mlproclin300和1.5ml吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。底物a的配制：称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900ml溶解，加hcl调整ph至ph7.5。定容至1000ml。常温放置备用。底物b的配制：量取30％h2o20.1ml，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100ml。2-8℃条件放置备用。底物制备：将底物a和底物b等体积混合。现配现用。抗体稀释液制备：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白20g，加纯水900ml溶解，加naoh溶液调整ph至ph7.5。吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。2-8℃条件下放置备用。检测抗体制备方法：将辣根过氧化物酶(hrp)标记的鼠抗人igg抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓度为0.5μg/ml，混匀，2-8℃条件下放置备用。将检测试纸条、样本稀释液、检测抗体、洗脱液、底物a、底物b、孵育槽、自封袋分别按不小于某一检测次数的用量组合、包装，形成试剂盒，将镊子、说明书一同放入试剂盒中。其中，检测试纸条使用白色聚丙烯材质的桶装；所述样本稀释液、底物a和洗脱液使用白色聚丙烯材质的瓶装；所述检测抗体和底物b使用棕色聚丙烯材质的瓶装；所述说明书为纸质；所述镊子和孵育槽为聚丙烯材质；所述自封袋为聚乙烯材质。实施例3检测试纸条的制备：1、试剂制备：1.1蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999ml溶解，吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。1.2封闭液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白10g，加纯水900ml溶解，加入naoh溶液调整ph至7.4。吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。2-8℃条件下放置备用。2、制备步骤：2.1硝酸纤维素膜裁成长宽为31cm×5cm大小，将3种高纯度的特异性的重组s1蛋白、重组rbd蛋白、重组e蛋白分别在硝酸纤维素膜上进行划线，得到3条检测线(划线浓度分别为0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml，划线量均为1μl/cm)，如图4所示(各检测线在硝酸纤维素膜上的分布次序对检测结果不产生显著影响)；2.2将羊抗鼠igg在硝酸纤维素膜上进行划线(质控线，c线；划线浓度为1mg/ml，划线量为1μl/cm)；2.337℃进行烘干2小时；2.4将烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，室温(15-25℃)条件下，完全浸泡1小时；2.537℃进行烘干2小时；2.6将第二次烘干后的硝酸纤维素膜和印有流水号的标签纸依次粘贴在pvc胶板上，切成3.5-4.0mm宽度，即为新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试纸条。样本稀释液的配制：0.1m、ph7.4磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999ml溶解，吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。洗脱液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5ml溶解，分别吸取1mlproclin300和1.5ml吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。常温放置备用。底物a的配制：称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900ml溶解，加hcl调整ph至ph7.5。定容至1000ml。常温放置备用。底物b的配制：量取30％h2o20.1ml，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100ml。2-8℃条件放置备用。底物制备：将底物a和底物b等体积混合。现配现用。抗体稀释液制备：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白20g，加纯水900ml溶解，加naoh溶液调整ph至ph7.5。吸取1mlproclin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000ml。2-8℃条件下放置备用。检测抗体制备方法：将辣根过氧化物酶(hrp)标记的鼠抗人igg抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓度为0.5μg/ml，混匀，2-8℃条件下放置备用。将检测试纸条、样本稀释液、检测抗体、洗脱液、底物a、底物b、孵育槽、自封袋分别按不小于某一检测次数的用量组合、包装，形成试剂盒，将镊子、说明书一同放入试剂盒中。其中，检测试纸条使用白色聚丙烯材质的桶装；所述样本稀释液、底物a和洗脱液使用白色聚丙烯材质的瓶装；所述检测抗体和底物b使用棕色聚丙烯材质的瓶装；所述说明书为纸质；所述镊子和孵育槽为聚丙烯材质；所述自封袋为聚乙烯材质。测试例对200例阴性血清样本(包含9例胶体金试剂盒检测出来的假阳性样本；包含5个乙肝，甲、乙流抗体阳性和2个乙肝抗原阳性样本等)和20例阳性血清样本进行检测，实施例1制得的检测试剂盒的预测灵敏度和特异性分别为100％、100％；使用全自动免疫分析仪在2h内就能得到200例样本的检测结果。操作过程方便、快捷、检测结果准确。实施例2和实施例3制得的检测试剂盒也能实现这些检测效果。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>无锡市孚维尔生物医疗科技有限公司<120>一种新型冠状病毒2019-ncov抗体谱检测试剂盒<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>681<212>prt<213>人工序列<400>1valasnleuthrthrargthrglnleuproproalatyrthrasnser151015phethrargglyvaltyrtyrproasplysvalpheargserserval202530leuhisserthrglnaspleupheleuprophepheserasnvalthr354045trpphehisalailehisvalserglythrasnglythrlysargphe505560aspasnprovalleupropheasnaspglyvaltyrphealaserthr65707580glulysserasnileileargglytrpilepheglythrthrleuasp859095serlysthrglnserleuleuilevalasnasnalathrasnvalval100105110ilelysvalcysglupheglnphecysasnasppropheleuglyval115120125tyrtyrhislysasnasnlyssertrpmetgluserglupheargval130135140tyrserseralaasnasncysthrpheglutyrvalserglnprophe145150155160leumetaspleugluglylysglnglyasnphelysasnleuargglu165170175phevalphelysasnileaspglytyrphelysiletyrserlyshis180185190thrproileasnleuvalargaspleuproglnglypheseralaleu195200205gluproleuvalaspleuproileglyileasnilethrargphegln210215220thrleuleualaleuhisargsertyrleuthrproglyaspserser225230235240serglytrpthralaglyalaalaalatyrtyrvalglytyrleugln245250255proargthrpheleuleulystyrasngluasnglythrilethrasp260265270alavalaspcysalaleuaspproleusergluthrlyscysthrleu275280285lysserphethrvalglulysglyiletyrglnthrserasnphearg290295300valglnprothrgluserilevalargpheproasnilethrasnleu305310315320cyspropheglygluvalpheasnalathrargphealaservaltyr325330335alatrpasnarglysargileserasncysvalalaasptyrserval340345350leutyrasnseralaserpheserthrphelyscystyrglyvalser355360365prothrlysleuasnaspleucysphethrasnvaltyralaaspser370375380phevalileargglyaspgluvalargglnilealaproglyglnthr385390395400glylysilealaasptyrasntyrlysleuproaspaspphethrgly405410415cysvalilealatrpasnserasnasnleuaspserlysvalglygly420425430asntyrasntyrleutyrargleuphearglysserasnleulyspro435440445phegluargaspileserthrgluiletyrglnalaglyserthrpro450455460cysasnglyvalgluglypheasncystyrpheproleuglnsertyr465470475480glypheglnprothrasnglyvalglytyrglnprotyrargvalval485490495valleuserphegluleuleuhisalaproalathrvalcysglypro500505510lyslysserthrasnleuvallysasnlyscysvalasnpheasnphe515520525asnglyleuthrglythrglyvalleuthrgluserasnlyslysphe530535540leupropheglnglnpheglyargaspilealaaspthrthraspala545550555560valargaspproglnthrleugluileleuaspilethrprocysser565570575pheglyglyvalservalilethrproglythrasnthrserasngln580585590valalavalleutyrglnaspvalasncysthrgluvalprovalala595600605ilehisalaaspglnleuthrprothrtrpargvaltyrserthrgly610615620serasnvalpheglnthrargalaglycysleuileglyalagluhis625630635640valasnasnsertyrglucysaspileproileglyalaglyilecys645650655alasertyrglnthrglnthrasnserproargargalaargalahis660665670hishishishishishishishishis675680<210>2<211>457<212>prt<213>人工序列<400>2argvalglnprothrgluserilevalargpheproasnilethrasn151015leucyspropheglygluvalpheasnalathrargphealaserval202530tyralatrpasnarglysargileserasncysvalalaasptyrser354045valleutyrasnseralaserpheserthrphelyscystyrglyval505560serprothrlysleuasnaspleucysphethrasnvaltyralaasp65707580serphevalileargglyaspgluvalargglnilealaproglygln859095thrglylysilealaasptyrasntyrlysleuproaspaspphethr100105110glycysvalilealatrpasnserasnasnleuaspserlysvalgly115120125glyasntyrasntyrleutyrargleuphearglysserasnleulys130135140prophegluargaspileserthrgluiletyrglnalaglyserthr145150155160procysasnglyvalgluglypheasncystyrpheproleuglnser165170175tyrglypheglnprothrasnglyvalglytyrglnprotyrargval180185190valvalleuserphegluleuleuhisalaproalathrvalcysgly195200205prolyslysserthrasnleuvallysasnlyscysvalasnpheala210215220aspaspaspasplysalavalproargaspserglycyslysprocys225230235240ilecysthrvalprogluvalserservalpheilepheproprolys245250255prolysaspvalleuthrilethrleuthrprolysvalthrcysval260265270valvalaspileserlysaspaspprogluvalglnphesertrpphe275280285valaspaspvalgluvalhisthralaglnthrglnproarggluglu290295300glnpheasnserthrpheargservalsergluleuproilemethis305310315320glnasptrpleuasnglylysgluphelyscysargvalasnserala325330335alapheproalaproileglulysthrileserlysthrlysglyarg340345350prolysalaproglnvaltyrthrileproproprolysgluglnmet355360365alalysasplysvalserleuthrcysmetilethraspphephepro370375380gluaspilethrvalglutrpglntrpasnglyglnproalagluasn385390395400tyrlysasnthrglnproilemetaspthraspglysertyrpheval405410415tyrserlysleuasnvalglnlysserasntrpglualaglyasnthr420425430phethrcysservalleuhisgluglyleuhisasnhishisthrglu435440445lysserleuserhisserproglylys450455<210>3<211>425<212>prt<213>人工序列<400>3methishishishishishisseraspasnglyproglnasnglnarg151015asnalaproargilethrpheglyglyproseraspserthrglyser202530asnglnasnglygluargserglyalaargserlysglnargargpro354045glnglyleuproasnasnthralasertrpphethralaleuthrgln505560hisglylysgluaspleulyspheproargglyglnglyvalproile65707580asnthrasnserserproaspaspglnileglytyrtyrargargala859095thrargargileargglyglyaspglylysmetlysaspleuserpro100105110argtrptyrphetyrtyrleuglythrglyproglualaglyleupro115120125tyrglyalaasnlysaspgly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