本发明涉及的是一种基于功能化磁性二氧化硅的化学发光传感器的制备方法及应用技术，属于化学发光传感领域，具体涉及磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点的制备及其在化学发光检测凝血酶中的应用。
背景技术：
化学发光（cl）是物质在进行化学反应过程中的一种光辐射现象。在发光过程中，外部能量使原子的电子从基态跃迁到激发态，在可见光区域以光的形式释放能量后返回基态。化学发光分析法是一种很有优势的检测方法，可通过测量发射光的强度，将该强度与分析物的浓度关联起来，其固有特点是不需要外部激发源，读出的信噪比高，且以其选择性好、灵敏度高、操作简单、稳定性好等优点，在生命科学、临床诊断、环境监测、食品安全以及药物分析领域得到了越来越多的关注。构建化学发传感器是应用化学发光法的重要步骤，但大多数发光体系的信号微弱，发光强度低且发光时间短，所以需要引入催化剂来进一步增强其发光效率，提高灵敏度，延长发光时间，同时引入适配体、抗体复合材料等来提高该方法的选择性。
纳米二氧化硅材料以其独特的性质，受到了许多科研工作者的关注。它是一种具有三维链状结构的工业纳米材料，粒径约为20nm，其表面有许多不饱和的残基和羟基，使得纳米二氧化硅分子具有很好的生物相容性、吸附性、稳定性以及表面活性，具有其他颗粒材料所不具备的光学性能，同时由于其颗粒尺寸小，比表面积大，球形直径可调，孔径和结构可控，以及具有表面界面效应的特点，被经常用来增强涂料等有机高分子的韧性、耐磨性、耐老化性等综合性能，在塑料、橡胶和光电材料工业中发挥着重要作用，而且还可以在对其进行功能化之后广泛应用于各种高分子材料的改性，催化剂和吸附剂的开发。磁性二氧化硅材料是将磁性纳米材料与sio2复合得到的复合材料，它有优异的顺磁性、好的生物相容性和分散性，且具有极佳的吸附性能，在吸附、涂层、传感等领域应用广泛。
本发明旨在制备一种基于识别和催化功能化磁性二氧化硅的化学发光传感器。适配体作为识别元件、石墨烯量子点作为催化剂，形成双功能的磁性二氧化硅复合材料；并将该材料用于化学发光检测凝血酶中，实现对凝血酶的高灵敏、高选择性、准确快速检测，发明了一种检测凝血酶等疾病标志物的新方法。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种基于功能化磁性二氧化硅的化学发光传感器的制备方法，首先制备磁性二氧化硅/适配体和互补链dna@石墨烯量子点，再通过碱基互补配对作用将两种材料复合，得到功能化磁性二氧化硅复合材料（磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点），并将该功能化材料用于化学发光传感器的构建，实现对凝血酶等生物标志物的检测。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
（1）磁性二氧化硅/适配体的制备：将0.05~0.10g磁性二氧化硅均匀分散在100mlph为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液中；移取1.0ml该分散液于5ml离心管中，并向管中加入0.5~2.0μmol的适配体，在室温下振荡孵化4~6h；在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，去除未反应的适配体；将分离后的产物用ph为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到磁性二氧化硅/适配体分散液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（2）互补链dna@石墨烯量子点的制备：用ph为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液将石墨烯量子点配制成25ml浓度为1.0~2.5μmol/l的石墨烯量子点溶液；移取2ml该溶液于5ml离心管中，并向其中加入1.0~2.5μmol的互补链dna，在室温下振荡孵化4~6h；在8000r/min的转速下离心5~10min，除去未能与石墨烯量子点结合的互补链dna，将分离后的产物用ph为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到互补链dna@石墨烯量子点溶液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（3）磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点的制备：移取2.0~5.0ml上述（1）中制备的磁性二氧化硅/适配体分散液于15ml离心管中，并加入3.0~6.0ml上述（2）中制备的互补链dna@石墨烯量子点溶液，在室温下振荡孵化3~5h；在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，去除未反应的互补链dna@石墨烯量子点；将分离后的产物用ph为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点分散液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（4）待检测样品的预处理：用ph为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液对待测样品进行稀释，稀释至100~1000倍；取5.0ml稀释后的待测液放入25ml比色管中，并在比色管中加入2.0~5.0ml上述（3）中制备的磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点分散液；离心管中的待测物分子和适配体因特异性识别作用紧密结合在一起，形成磁性二氧化硅/适配体-待测物分子，互补链dna@石墨烯量子点从磁性二氧化硅/适配体处脱离，在外加磁铁的作用下对管内合成物进行磁性分离，保留上清液用于后续检测；
（5）化学发光传感器的制备：启动流动注射化学发光仪器的主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、鲁米诺溶液及样品管合并流动311s，记录产生的化学发光强度，即为一定浓度待测物分子对应的化学发光强度；其中，样品管中的溶液为上述（4）中保留的上清液，上清液中的互补链dna@石墨烯量子点催化鲁米诺-过氧化氢-强氧化钠化学发光体系，引起化学发光强度的变化，实现对待测物分子的定量检测。
步骤（1）中所述的磁性二氧化硅的粒径小于100nm。
步骤（2）中所述的石墨烯量子点为可发蓝光的氧化石墨烯量子点。
通过改变适配体的种类，可以对不同的待测物分子进行检测。
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备了一种以适配体作为识别元件、互补链dna@石墨烯量子点作为化学发光催化剂的功能化磁性二氧化硅复合材料，磁性二氧化硅/适配体和磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点间通过碱基互补配对作用即可复合，条件操作均简单；
（2）本发明制备了一种基于功能化磁性二氧化硅的化学发光传感器，通过改变适配体的种类，可以实现不同待测物分子的检测；
（3）本发明制备了一种基于功能化磁性二氧化硅的化学发光传感器，该传感器表现出优异的选择性和高的灵敏度，为该传感器进一步应用于疾病标志物的检测提供了理论支撑。
具体实施方式
实施例1
（1）磁性二氧化硅/适配体的制备：将0.05g磁性二氧化硅均匀分散在100mlph为7.0的磷酸盐缓冲液中；移取1.0ml该分散液于5ml离心管中，并向管中加入0.5μmol的适配体，在室温下振荡孵化4h；在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，去除未反应的适配体；将分离后的产物用ph为7.0的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到磁性二氧化硅/适配体分散液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（2）互补链dna@石墨烯量子点的制备：用ph为7.0的磷酸盐缓冲液将石墨烯量子点配成25ml浓度为1.0μmol/l的石墨烯量子点溶液；移取2ml该溶液于5ml离心管中，并向其中加入1.0μmol的互补链dna，在室温下振荡孵化4h；在8000r/min的转速下离心5min，除去未能与石墨烯量子点结合的互补链dna，将分离后的产物用ph为7.0的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到互补链dna@石墨烯量子点溶液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（3）磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点的制备：移取2.0ml上述（1）中制备的磁性二氧化硅/适配体分散液于15ml离心管中，并加入3.0ml上述（2）中制备的互补链dna@石墨烯量子点溶液，在室温下振荡孵化3~5h；在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，去除未反应的互补链dna@石墨烯量子点；将分离后的产物用ph为7.0的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点分散液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（4）凝血酶样品的预处理：用ph为7.0的磷酸盐缓冲液对凝血酶样品进行稀释，稀释至500倍；取5.0ml稀释后的凝血酶液放入25ml比色管中，并在比色管中加入2.0ml上述（3）中制备的磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点分散液；凝血酶分子和适配体因特异性识别作用紧密结合在一起，形成磁性二氧化硅/适配体-凝血酶分子，互补链dna@石墨烯量子点分散液从磁性二氧化硅/适配体处脱离，在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，保留上清液用于后续检测；
（5）化学发光传感器的制备：启动流动注射化学发光装置的主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、鲁米诺溶液及样品管合并流动311s，记录产生的化学发光i，即为一定浓度凝血酶分子对应的化学发光强度；其中，样品管中的溶液为上述（4）中保留的上清液，上清液中的互补链dna@石墨烯量子点催化鲁米诺-过氧化氢-强氧化钠化学发光体系，引起化学发光强度的变化，实现对凝血酶分子的定量检测。
实施例2
（1）磁性二氧化硅/适配体的制备：将0.08g磁性二氧化硅均匀分散在100mlph为7.2的磷酸盐缓冲液中；移取1.0ml该分散液于5ml离心管中，并向管中加入1.0μmol的适配体，在室温下振荡孵化4h；在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，去除未反应的适配体；将分离后的产物用ph为7.2的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到磁性二氧化硅/适配体分散液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（2）互补链dna@石墨烯量子点的制备：用ph为7.2的磷酸盐缓冲液将石墨烯量子点配成25ml浓度为2.0μmol/l的石墨烯量子点溶液；移取2ml该溶液于5ml离心管中，并向其中加入1.5μmol的互补链dna，在室温下振荡孵化4h；在8000r/min的转速下离心8min，除去未能与石墨烯量子点结合的互补链dna，将分离后的产物用ph为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到互补链dna@石墨烯量子点溶液，放入ºc的冰箱中保存备用；
（3）磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点的制备：移取4.0ml上述（1）中制备的磁性二氧化硅/适配体分散液于15ml离心管中，并加入5.0ml上述（2）中制备的互补链dna@石墨烯量子点溶液，在室温下振荡孵化4h；在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，去除未反应的互补链dna@石墨烯量子点；将分离后的产物用ph为7.24的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点分散液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（4）凝血酶样品的预处理：用ph为7.2的磷酸盐缓冲液对凝血酶样品进行稀释，稀释至800倍；取5.0ml稀释后的凝血酶溶液放入25ml比色管中，并在比色管中加入4.0ml上述（3）中制备的磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点分散液；凝血酶分子和适配体因特异性识别作用紧密结合在一起，形成磁性二氧化硅/适配体-凝血酶分子，互补链dna@石墨烯量子点分散液从磁性二氧化硅/适配体处脱离，在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，保留上清液用于后续检测；
（5）化学发光传感器的制备：启动流动注射化学发光装置的主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、鲁米诺溶液及样品管合并流动311s，记录产生的化学发光i，即为一定浓度凝血酶分子对应的化学发光强度；其中，样品管中的溶液为上述（4）中保留的上清液，上清液中的互补链dna@石墨烯量子点催化鲁米诺-过氧化氢-强氧化钠化学发光体系，引起化学发光强度的变化，实现对凝血酶分子的定量检测。
实施例3
（1）磁性二氧化硅/适配体的制备：将0.10g磁性二氧化硅均匀分散在100mlph为7.4的磷酸盐缓冲液中；移取1.0ml该分散液于5ml离心管中，并向管中加入2.0μmol的适配体，在室温下振荡孵化6h；在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，去除未反应的适配体；将分离后的产物用ph为7.4的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到磁性二氧化硅/适配体分散液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（2）互补链dna@石墨烯量子点的制备：用ph为7.4的磷酸盐缓冲液将石墨烯量子点配成25ml浓度为2.5μmol/l的石墨烯量子点溶液；移取2ml该溶液于5ml离心管中，并向其中加入2.5μmol的互补链dna，在室温下振荡孵化4~6h；在8000r/min的转速下离心10min，除去未能与石墨烯量子点结合的互补链dna，将分离后的产物用ph为7.4的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到互补链dna@石墨烯量子点溶液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（3）磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点的制备：移取5.0ml上述（1）中制备的磁性二氧化硅/适配体分散液于15ml离心管中，并加入6.0ml上述（2）中制备的互补链dna@石墨烯量子点溶液，在室温下振荡孵化5h；在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，去除未反应的互补链dna@石墨烯量子点；将分离后的产物用ph为7.4的磷酸盐缓冲液定容至50ml，得到磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点分散液，放入4ºc的冰箱中保存备用；
（4）凝血酶样品的预处理：用ph为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液对凝血酶样品进行稀释，稀释至1000倍；取5.0ml稀释后的凝血酶溶液放入25ml比色管中，并在比色管中加入5.0ml上述（3）中制备的磁性二氧化硅/适配体-互补链dna@石墨烯量子点分散液；凝血酶分子和适配体因特异性识别作用紧密结合在一起，形成磁性二氧化硅/适配体-凝血酶分子，互补链dna@石墨烯量子点分散液从磁性二氧化硅/适配体处脱离，在外加磁铁的作用下对管内合成物进行分离，保留上清液用于后续检测；
（5）化学发光传感器的制备：启动流动注射化学发光装置的主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、鲁米诺溶液及样品管合并流动311s，记录产生的化学发光i，即为一定浓度凝血酶分子对应的化学发光强度；其中，样品管中的溶液为上述（4）中保留的上清液，上清液中的互补链dna@石墨烯量子点催化鲁米诺-过氧化氢-强氧化钠化学发光体系，引起化学发光强度的变化，实现对凝血酶分子的定量检测。