一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法及其应用与流程
本发明属于代谢组学和化合物分析技术领域，具体涉及一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法及其应用。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
蜂胶是蜜蜂从胶源植物的芽苞、树皮或树干上采集来的树脂类物质，并混入其上颌腺分泌物、蜂蜡和少量花粉反复加工而成的一种具有芳香气味的胶状混合物，多为黄褐色、青褐色，是较为珍贵的蜜蜂产品。据研究，蜂胶中含有300多种化合物，包括酚酸及其酯、黄酮类化合物(黄酮类和查尔酮)、萜烯类、芳香醛类、醇类、脂肪酸、甾体类、氨基酸、木脂素和糖，萜类化合物和矿物元素，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抑菌等生物学活性，目前已广泛应用于食品、制药等领域。
蜂胶的生物活性成分主要依赖于采集地胶源植物的树脂成分，采集地周围的季节、地理特征及植被类型都会对蜂胶品质产生影响。magdalena
目前蜂胶类型依据胶源植物的不同分为杨树型蜂胶、巴西绿蜂胶(酒神菊属型baccharis)、桦树型蜂胶、桉树型蜂胶(土耳其)、太平洋型(血桐属型macarangathou)蜂胶、地中海蜂胶、克鲁西亚型蜂胶和红蜂胶七大类。其中杨树型蜂胶的胶源植物为杨属植物，广泛分布于亚洲、欧洲、北美和新西兰等地，其主要的生物活性物质为黄酮类、黄烷酮类、酚类物质肉桂酸及其衍生物等，我国蜂胶的植物来源主要以杨属和其杂交属的芽苞分泌物为主，属于杨树型蜂胶，但近代引入我国的蜜蜂可能还没有适应采集我国本土杨树品种的树脂，如毛白杨、钻天杨等，主要采集欧洲黑杨及其杂交品种——加拿大杨的树脂。
国内外对蜂胶的研究多采用气相色谱法、液相色谱法、红外光谱法、电子鼻法、核磁指纹图谱法或与各技术联用以及对单一物质鉴别法如水杨苷、叶绿素等，但发明人发现，其仍存在一定的局限性，比如gc只能分析蜂胶中的挥发性物质如酚酸等；hplc可分析蜂胶中的高沸点和热不稳定化合物，但存在分离度不够、只检测具有紫外吸收特性的成分、流动相消耗量大、分析时间长等缺点；电子鼻虽响应时间短但检测结果易受环境因素的影响；特征物质鉴别如叶绿素、水杨苷等的单一标准无法对蜂胶进行精确鉴定，需要辅助抗氧化活性等指标，且大多并不适用于生物活性成分相差较小的蜂胶质控。
技术实现要素：
针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法及其应用。本发明利用代谢组学方法非靶向的寻找差异性代谢物对蜂胶及蜂胶产品进行鉴别，分析对象为蜂胶产品中相对差异性大的物质，而不是绝对含量高的物质。利用超高效液相色谱串联高分辨质谱(uplc-qexactive)对不同产地、不同加工程度蜂胶产品进行分析，获得的原始数据结合多元变量统计分析方法探究不同产地、不同加工程度蜂胶产品之间代谢物的区别，从极小的代谢物水平解释不同蜂胶产品之间的差异，为蜂胶及其制品的规范使用提供一定的理论基础，基于上述研究结果，从而完成本发明。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
本发明的第一方面，提供一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法，所述方法包括：将待测蜂胶产品样品采用有机溶剂进行前处理后，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱技术实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到待测蜂胶产品样品的uplc-qexactive原始数据进行非靶向筛选，应用多元统计分析方法主成分分析(pca)模型对不同蜂胶产品差异性代谢物进行鉴定和分析。
其中，所述蜂胶产品包括不同产地和/或不同加工程度的蜂胶；
所述产地包括但不限于山东、四川和河北；
所述不同加工程度的蜂胶包括但不限于蜂胶原胶和蜂胶胶囊。
本发明的第二个方面，提供上述分析方法在如下1)-6)中任意一种或多种的应用：
1)蜂胶产品产地溯源；
2)蜂胶产品胶原植物分析；
3)蜂胶产品的合理使用；
4)蜂胶产品的质量控制；
5)蜂胶产品的品质评价；
6)蜂胶产品的鉴定。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
(1)上述技术方案基于uplc-qexactive技术结合代谢组学采用非靶向筛选方法，能够检测到不同蜂胶产品中的低分子量和相对含量较少的代谢物，同时也大大缩短了检测分析时间。
(2)上述技术方案对样品前处理较为简易，同时通过优化提取试剂，从而可以较为完整保留蜂胶中化合物，为后续分离鉴定奠定基础。
(3)采用本发明技术方案可以有效筛选定性出的显著差异性的代谢物，即这些代谢物虽然不是在蜂胶中绝对含量高的物质，但确是对差异性贡献较大的物质，从而可以在极微量的代谢物水平解释不同蜂胶样品的差异，从而为蜂胶产地溯源和蜂胶产品的合理使用等提供了数据支撑，因此具有良好的实际应用之价值。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中不同省份蜂胶的多元统计分析；其中，a,pca得分图；b，pls-da得分图；c，pls-da得分图；d，opls-da置信检验结果。
图2为本发明实施例1中山东和四川省蜂胶的多元统计分析；其中，a,pca得分图；b，pls-da得分图；c，pls-da得分图；d，opls-da置信检验结果。
图3为本发明实施例1中四川和河北省蜂胶的多元统计分析；其中，a,pca得分图；b，pls-da得分图。
图4为本发明实施例1中山东和河北省蜂胶的多元统计分析；其中，a，pca得分图；b，pls-da得分：c，opls-da得分图；d，opls-da置信检验结果。
图5为本发明实施例1中蜂胶原胶与网购蜂胶的多元统计分析；其中，a,pca得分图；b，pls-da得分图；c，pls-da得分图；d，opls-da置信检验结果。
图6为本发明实施例1中蜂胶原胶与蜂胶胶囊的多元统计分析；其中，a，pca得分图；b，pls-da得分图；c，pls-da得分图；d，opls-da置信检验结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，国内外对蜂胶的研究多采用气相色谱法、液相色谱法、红外光谱法、电子鼻法、核磁指纹图谱法或与各技术联用以及对单一物质鉴别法如水杨苷、叶绿素等，其仍存在一定的局限性，且大多并不适用于生物活性成分相差较小的蜂胶质控。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法，所述方法包括：将待测蜂胶产品样品采用有机溶剂进行前处理后，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱技术实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到待测蜂胶产品样品的uplc-qexactive原始数据进行非靶向筛选，应用多元统计分析方法主成分分析(pca)模型对不同蜂胶产品差异性代谢物进行鉴定和分析。
其中，所述蜂胶产品包括不同产地和/或不同加工程度的蜂胶；
所述产地包括但不限于山东、四川和河北；
所述不同加工程度的蜂胶包括但不限于蜂胶原胶和蜂胶胶囊。
本发明的又一具体实施方式中，样品前处理使用的有机溶剂包括但不限于甲醇和乙醇；其中，所用甲醇体积分数包括25～100％；所用乙醇体积分数包括25～100％；通过试验验证，体积分数为95％的甲醇溶液作为提取剂提取蜂胶产品中的代谢物数目最多，提取效果最佳。
本发明的又一具体实施方式中，所述前处理过程具体方法包括：将待测蜂胶产品样品加入有机溶剂，超声、离心后得上清液，稀释过滤后得待测样品液，进行上机检测。
本发明的又一具体实施方式中，蜂胶产品与有机溶剂的质量体积比为1g：30～50ml；优选为1g：40ml。
本发明的又一具体实施方式中，超声时间为10～60min，优选30min；离心条件：低温条件下6000～12000rpm离心4～8min，优选4℃条件下8000rpm离心5min；过滤采用有机滤膜进行，所述有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm，优选0.22μm。
本发明的又一具体实施方式中，色谱条件包括：色谱柱为acquityuplcbehc18色谱柱(2.1x50mm，1.7μm)，流动相：乙腈(a)-0.1％甲酸水(b)，负谱条件下进行梯度洗脱；柱温为25℃，流速为0.3ml/min，进样量为3μl。
本发明的又一具体实施方式中，梯度洗脱具体程序为：0-2min1％a，2-3.25min1％-5％a，3.25-4.25min5％a，2.25-7.75min5％-55％a，7.75-9.75min55％-90％a，9.75-11.75min90％a，11.75-12min90％-1％a，12-15min1％a。
本发明的又一具体实施方式中，质谱条件包括一级质谱条件和二级质谱条件；
其中，一级质谱条件为分辨率70000(fwhm)；鞘气，40arb；辅助气，10arb；反吹气，0arb；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，320℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：fullms。
二级负谱条件：分辨率，175000(fwhm)；分辨率70000(fwhm)；鞘气，40arb；辅助气，10arb；反吹气，0arb；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，320℃。辅助气温度，350℃，扫描范围，m/z：75-1050。hcd高能碰撞池碰撞能量nce：50、100、150。扫描模式：fullms-ddms2(top5)。
本发明通过使用超高效液相色谱串联高分辨质谱技术同时优化检测参数和条件，从而提高了检测灵敏度，同时可以实现对复杂基质中痕量代谢物质准确地定性分析，充分保障结果的准确性。
本发明的又一具体实施方式中，所述对得到待测蜂胶产品样品的uplc-qexactive原始数据进行非靶向筛选具体方法包括：
将二级质谱原始数据进行代谢物分子式的拟合和数据库的搜索，将一级质谱筛选后可能的差异性代谢物信息与二级质谱搜库定性后的准确信息进行比对，进行假阳性离子的排除；其中，所述假阳性离子即依据保留时间和离子相对丰度比两个指标与原始质谱碎片比对时无法定性的物质；
排除后得到的数据即是阴离子模式下的差异性代谢物的信息，根据阴离子模式下利用分子或离子峰的精确质量数对可能的差异性代谢物进行推测；
将筛选后的差异性代谢物的一级质谱信息与二级质谱信息进行比对后，带入原始数据中寻找碎片离子，碎片离子信息匹配成功后，最终确定差异性代谢物。
本发明的又一具体实施方式中，差异性代谢物的信息主要包括分子式、分子精确质量数，保留时间、ratio值和p值等，其中分子准确质量数的最大偏差在5ppm内，保留时间的偏差为0.2min。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述分析方法在如下1)-6)中任意一种或多种的应用：
1)蜂胶产品产地溯源；
2)蜂胶产品胶原植物分析；
3)蜂胶产品的合理使用；
4)蜂胶产品的质量控制；
5)蜂胶产品的品质评价；
6)蜂胶产品的鉴定。
其中，所述蜂胶产品包括不同产地和/或不同加工程度的蜂胶；
所述产地包括但不限于山东、四川和河北；
所述不同加工程度的蜂胶包括但不限于蜂胶原胶和蜂胶胶囊。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1、材料与仪器
(1)实验材料
蜂胶原胶共26个，其中山东蜂胶21个(编号sd1-sd21)、四川蜂胶3个(编号sc22-24)、河北蜂胶2个(编号hb25、hb26)均由当地养蜂合作社提供；网购蜂胶(未加工)8个(编号fj1-fj8)，经网络电商购入；品牌蜂胶软胶囊10个(编号jn1-jn10)，由网络电商购入。样品详细编号见表1。
表1蜂胶样品信息表
(2)试剂与仪器
乙腈(色谱级)，默克集团(merckkgaa)；甲醇(色谱级)，无水甲酸(ar)，国药集团化学试剂有限公司。
超高效液相-高分辨质谱仪(thermoscientificdionexultimate3000-qexactivemassspectrometer)，美国thermofisher公司；milli-q-a-11超纯水机，密理博公司；ikams3basic涡旋混合器，ika公司；超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司；sigma3-18k高速冷冻离心机，德国sigma公司。
2、实验方法
(1)样品前处理
将蜂胶原胶或网购蜂胶粉碎至100目的粒度，称取0.5g蜂胶原胶或网购蜂胶样品(n＝3)加入20ml提取剂，涡旋混合5min，将离心管置于超声机中超声30min，8000rpm、4℃离心5min，取上清液进行10倍稀释，涡旋混匀，取稀释液用0.22μm有机滤膜过滤后上机测定。
称取蜂胶胶囊内容物0.5g(n＝3)加入20ml提取剂，涡旋混合5min，将离心管置于超声机中超声30min，8000rpm、4℃离心5min，取上清液进行10倍稀释并涡旋混匀，取稀释液用0.22μm有机滤膜过滤后上机测定。
(2)提取剂的优化
分别选取各自体积分数为25％、50％、75％、95％、100％的甲醇和乙醇对蜂胶样品进行提取，提取后上机测定。得到的原始数据导入compounddiscoverer软件分析，通过对原始数据中特征峰处理，得到不同体积分数提取剂条件下各样品中代谢物的数量(见表2)，最后选取提取代谢物数目最多的提取剂进行后续实验，即体积分数为95％的甲醇溶液作为提取剂。
表2不同体积分数提取剂下代谢物的数量
(3)色谱条件
色谱柱：acquityuplcbehc18色谱柱(2.1x50mm，1.7μm)，流动相乙腈(a)-0.1％甲酸水(b)，负谱条件下洗脱梯度为0-2min1％a，2-3.25min1％-5％a，3.25-4.25min5％a，2.25-7.75min5％-55％a，7.75-9.75min55％-90％a，9.75-11.75min90％a，11.75-12min90％-1％a，12-15min1％a。柱温为25℃，流速为0.3ml/min，进样量为3μl。
(4)质谱条件
一级负谱条件：分辨率70000(fwhm)；鞘气，40arb；辅助气，10arb；反吹气，0arb；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，320℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：fullms。
二级负谱条件：分辨率，175000(fwhm)；分辨率70000(fwhm)；鞘气，40arb；辅助气，10arb；反吹气，0arb；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，320℃。辅助气温度，350℃，扫描范围，m/z：75-1050。hcd高能碰撞池碰撞能量nce：50、100、150。扫描模式：fullms-ddms2(top5)
(5)数据分析
采用compounddiscoverer2.1软件对一级和二级质谱的原始数据进行处理，处理后的数据采用simca14.1软件进行多元统计分析。将二级质谱原始数据导入cd软件，进行代谢物分子式的拟合和数据库的搜索，选择的数据库为mzcloud、kegg、hmdb、chemspider。将一级质谱筛选后可能的差异性代谢物信息与二级质谱搜库定性后的准确信息进行比对，进行假阳性离子的排除，即依据保留时间和离子相对丰度比两个指标与原始质谱碎片比对时无法定性的物质，排除后得到的数据即是阴离子模式下的差异性代谢物的信息，主要包括分子式、分子精确质量数，保留时间、ratio值和p值等，其中分子准确质量数的最大偏差在5ppm内，保留时间的偏差为0.2min，由此可以根据阴离子模式下利用分子或离子峰的精确质量数对可能的差异性代谢物进行推测。将筛选后的差异性代谢物的一级质谱信息与二级质谱信息进行比对后，带入原始数据中寻找碎片离子，碎片离子信息匹配成功后，最终确定差异性代谢物。
3、结果展示
(1)不同省份蜂胶原胶差异性代谢物分析
多元统计分析结果见图1，其中a为不同省份蜂胶pca得分图，从图中可以看出山东和河北省的蜂胶原胶与四川蜂胶在第一主成分上有较好的区分，但山东和河北的蜂胶不能很好分离。在pls-da和opls-da分析中，三个省份的蜂胶分离度较好，且opls-da分析的置信检验结果呈现良好拟合，表明模型可靠。
(1-1)山东省和四川省蜂胶原胶差异性代谢物的鉴定
在图2中，在pca，pls-da和opls-da中二省蜂胶在第一主成分上分离度较好，具有显著差异。
由一级质谱数据，找出了可能的差异性代谢物，用二级质谱对样品信息进行采集，并进行二级搜库。在定性过程中筛选了ratio≤0.025，ratio≥40，p值＜0.01的物质，且去除了前一分钟和后一分钟的代谢物。最后定性出19种差异性代谢物，包括黄酮类物质2种：异甘草素、光甘草酚；酚酸类物质2种：姜黄素、knipholone；酯类物质5种：异丁酸香兰素乙酯、氧化前胡内酯、6-羟基-1,2-己二烯二酸二辛酯、1,2-二草酸盐甘油酯、3,22-二羟基-28-氧代-12-烯-16-乙酸酯；醇类物质1种：2-羟基苯甲醇；醛酮类5种：北美芹素、邻苯二甲醛、乙基香兰素丙二醇缩醛、姜辣二酮、8-[(3e)-5,6-二甲基-3-庚-2-基]-16-羟基-9,13-二甲基-18,19-二氧戊环[10.5.2.0～1,13～.0～4,12～.0～5,9～]壬烯-3-烯-2-酮；烯酸类物质1种：(2z)-3-[4,5-二羟基-2-(2-羟基-2-丙基)-2,3-二氢-1-苯并呋喃-7-基]丙烯酸；其它类物质3种：in00295、2704846、异丁酸(见表3)。异甘草素、光甘草酚、姜黄素、香兰素衍生物(异丁酸香兰素乙酯、乙基香兰素丙二醇缩醛、姜辣二酮)、香豆素衍生物(北美芹素、氧化前胡内酯)、2-羟基苯甲醇、邻苯二甲醛共10种物质来源于植物，其中光甘草酚、异甘草素在蜂胶文献中均有报道，但未将其作为差异性物质进行探究。
表3山东蜂胶与四川蜂胶差异性代谢物的分子信息
与四川蜂胶相比，山东蜂胶原胶含有较多的邻苯二甲醛、异甘草素、姜黄素、香豆素衍生物(氧化前胡内酯、北美芹素)等，黄酮类和酚类物质含量较高且多为植物来源代谢物。四川蜂胶中来源于植物代谢物包括2-羟基苯甲醇、香兰素衍生物(乙基香兰素丙二醇缩醛、异丁酸香兰素乙酯、姜辣二酮)、光甘草酚、1,2-二草酸盐甘油酯、knipholone，四川蜂胶原胶中代谢物多为酯类、醛酮类和烯酸类物质。
山东和四川的地理位置相距较远，山东为温带季风气候，四川为亚热带气候，研究表明蜂胶采集地的气候及地理特征会造成蜂胶品质的改变；川西高原为四川蜂胶提供的胶源植物多为青杨派杨树和加拿大杨，山东蜂胶的胶源植物为温带分布广泛的加拿大杨和毛白杨，以青杨和毛白杨为胶源物质的蜂胶中黄酮类和酯类物质含量较多，加杨中酚酸类含量较高。树脂成分的不同导致蜂胶中代谢物的不同，可以将这些差异性代谢物作为不同种地区蜂胶的标志物，从而为鉴别山东蜂胶和四川蜂胶提供了一定的理论基础。
(1-2)四川省和河北省蜂胶原胶差异性代谢物的鉴定
在图3中，在pca图中，可以看出，这两个省份的蜂胶在第一主成分有较好的区分度。在pls-da中只存在一个组分，且在该组分中分离度较好，造成这种情况的原因是这两个省份的蜂胶样品相对较少，且四川蜂胶的组内差异较大。
通过筛选ratio≥75，ratio≤0.012，p值＜0.01的代谢物，最后共定性出19种差异性代谢物，主要包括酯类物质6种：12-羟基硬脂酸甲酯、(3s，5r)-3-羟基-5-(甲氧基甲氧基)十六酸甲酯、洛伐他汀、甲基(2e)-3-甲氧基-4-氧代-5-[(8e，11e)-8,11,14-十五碳三烯-1-基]-2-己二酸酯、3,3-二(4-羟基-3,5-二甲基苯基)戊二酸二乙酯、iriomoteolide1a；酚酸类物质4种：银杏酸、2-羟基马尿酸、腰果酸、12-脱氧酚-20-乙酸-13-(2-甲基丁酸)；肉桂酸衍生物1种：香豆素；烯酸类2种：卡波前列素、18-β-甘草次酸；醛酮类3种：瑞美松龙、环-3,20-双(1,2-乙二醇缩醛)-11α-(乙酰氧基)-5α，6α-环氧孕烷-3,20-二酮，其他类物质3种，来源于植物芽及其树脂的代谢物有6种：丙酸、香豆素、银杏酸、12-羟基硬脂酸甲酯、腰果酸、18-β-甘草次酸，霉菌代谢物：洛伐他汀，详细信息见表4。其中香豆素、腰果酸在蜂胶研究文献中均有报道，香豆素作为蜂胶中相对含量较高的物质报道研究较多，但腰果酸鲜有研究。
表4四川省和河北省蜂胶差异性代谢物的分子信息
四川蜂胶来源为植物树脂的特异性的代谢物有12-羟基硬脂酸甲酯、银杏酸、腰果酸、18-β-甘草次酸。河北蜂胶中特异性代谢物有丙酸、香豆素、2-羟基马尿酸。四川蜂胶含有较多的酯类物质，且多为植物来源的代谢物。相比于四川蜂胶，河北蜂胶多为易挥发性植物代谢物。
河北和四川在气候和地理位置上有较大差异，四川属于亚热带气候，河北属温带大陆性气候，蜂胶品质随环境因素变化较大。从胶源植物的树脂成分方面分析，四川蜂胶胶源植物为青杨和加杨，河北蜂胶胶源植物为白杨属的河北杨(populushopeiensishuetchow)和黑杨属的加杨，相比于河北杨，青杨含有更多的酯类物质和酚酸类物质。
(1-3)山东省和河北省蜂胶原胶差异性代谢物的鉴定
在图4的pca图中，可以看出，山东和河北两个省份的蜂胶差异度较小，在pls-da和opls-da中分离度较好，且opls-da的置信检验结果呈现良好拟合，表明模型可靠。在定性过程中筛选了ratio≤0.05，ratio≥20，p值＜0.01的物质，且去除了前一分钟和后一分钟的代谢物。经过筛选定性，得到了9种差异性代谢物，包括酚酸类物质2种：2-羟基马尿酸、银杏酸；黄酮类物质2种：异甘草素、山豆根素；酯类物质3种：氧化前胡素、甲羟孕酮17-乙酸酯、洛伐他汀；烯酸类1种：艾考莫瑞；酮类物质1种：(2e)-2,6-双[4-(二乙氧基甲基)亚苄基]环己酮，来源于植物代谢物有：银杏酸、异甘草素、山豆根素、氧化前胡素，其中有文献记载异甘草素存在于蜂胶中，但未对其含量进行限定，差异性代谢物信息详见表5。
表5山东省和河北省蜂胶差异性代谢物的分子信息
相比较而言，山东和河北地理位置相近，两个省份的蜂胶差异性较小，山东蜂胶含有的植物代谢物为银杏酸，河北蜂胶为异甘草素、山豆根素、氧化前胡素。河北蜂胶胶源植物为河北杨和加杨，山东蜂胶植物为加杨和毛白杨，河北杨和毛白杨同属于杨属白杨组植物，其在树脂成分上虽有差异但区分度较小，河北杨的酚类、黄酮类和酯类物质含量较多。在非植物代谢物水平上，河北蜂胶含有较多的醛酮和酯类物质。
山东、四川和河北三个省区的原蜂胶，从胶源植物上区分，四川蜂胶为加杨和青杨，山东蜂胶为加杨和毛白杨，河北蜂胶为加杨和河北杨，在树脂成分上存在一定差距，四川蜂胶与其他二省蜂胶相比具有显著差异。山东和四川省原蜂胶共定性出19种差异性代谢物；四川和河北原蜂胶共定性出19种差异性代谢物；山东和河北由于差异性较小则共定性出9种差异性代谢物，其中山东蜂胶中黄酮类含量较高，四川蜂胶中的酯类和黄酮类物质含量最高，河北蜂胶中酚类物质含量最高。
(2)蜂胶原胶和网购蜂胶的差异性代谢物分析
图5为蜂胶原胶与网购蜂胶的多元统计分析图，由pca得分图和pls-da可知，网购蜂胶和部分蜂胶原胶在第一主成分得到了良好的分离度，但差异度较小，在opls-da中，蜂胶原胶和网购蜂胶存在明显差别，具有显著差异。
二级质谱原始数据在筛选差异性化合物时，设置ratio≤0.1，ratio≥10，p值＜0.01的代谢物，排除假阳性离子后，共筛选定性出6种差异性代谢物，包括酚酸类1种：腰果酸；黄酮类1种：二甲基倒捻子素；醛酮类2种：黄柏酮、2,4,6-三羟基-5-{(1s)-1-[(1ar,4r,4ar,7s,7as,7br)-4-羟基-1,1,4,7-四甲基十氢-1h-环丙烷[e]天青-7-基]-3-甲基丁基}间苯甲醛；羧酸类2种：月桂酸酐、2-羟基四环素酸，其中有3种来源于植物的代谢物：腰果酸、二甲基倒捻子素、黄柏酮，详细信息见表6。
表6蜂胶原胶(yj)和网购蜂胶(fj)的差异性代谢物分子信息
本实施例的网购蜂胶主要来自山东、河北和安徽三省，实验所用蜂胶原胶来源为山东、四川和河北三省，从植物来源代谢物上分析，网购蜂胶含有较多腰果酸，蜂胶原胶中月桂酸酐、二甲基倒捻子素和黄柏酮等3种物质含量较多。结果表明网购蜂胶和蜂胶原胶显著差异性较小，因而差异性代谢物较少，网购蜂胶加工程度较轻，商家将蜂胶在微加热条件下捏团过程中化学成分基本没有损失，因而这两类蜂胶的差异性代谢物较少。
(3)蜂胶原胶和蜂胶胶囊的差异性代谢物分析
结果表明，将蜂胶原胶和蜂胶胶囊内容物的原始数据导入compounddiscoverer软件内进行处理，得到的一级数据用simca软件进行多元统计分析。在图6的pca图，蜂胶胶囊与蜂胶原胶和网购蜂胶有良好的分离度在第二主成分中差异度较大，在pls-da和opls-da中分离度较好，具有显著差异。
设置ratio≤0.02，ratio≥50，p值＜0.01的代谢物，假阳性离子的排除后共筛选定性出21种差异性代谢物，包括酚酸类5种：间苯三酚、银杏酸、莽草素、4-(1,5-二羟基-9,10-二氢-9,10-二氢蒽-2-基)-3-羟基-3-甲基丁酸、β，β-二甲基丙烯酸紫草素；肉桂酸及其衍生物4种：肉桂酸、(e)-4-甲氧基肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸松柏酯；黄酮类2种：(+/-)-橙皮素、四甲基黄芩素；酯类物质2种：氧化前胡内酯、[3,4,6-三乙酰氧基-5-(苯甲氧基)-1-环己烯]苯甲酸甲酯；醛酮类2种：邻苯二甲醛、茚三酮；羧酸类3种：2-羟基二十四烷酸、7-酮脱氧胆酸、3-氧代-12-烯-29-油酸；其他类3种：2,6-双(3,4-亚甲基二氧苯基)-3,7-二氧杂环(3.3.0)辛烷、lv1850000、in00150。造成差异来源于植物的代谢物包括11种：间苯三酚、银杏酸、莽草素、四甲基黄芩素、β，β-二甲基丙烯酸紫草素、肉桂酸、(e)-4-甲氧基肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸松柏酯、(+/-)-橙皮素、氧化前胡内酯，详细信息见表7。
表7蜂胶原胶(yj)和网购蜂胶胶囊(jn)的差异性代谢物的分子信息
蜂胶胶囊中富含莽草素、lv1850000、四甲基黄芩素、2,6-双(3,4-亚甲基二氧苯基)-3,7-二氧杂环(3.3.0)辛烷、阿魏酸松柏酯、β,β-二甲基丙烯酸紫草素、[3,4,6-三乙酰氧基-5-(苯甲氧基)-1-环己烯]苯甲酸甲酯等7种物质，其余14种物质在蜂胶原胶中含量较多。与胶囊相比，蜂胶原胶中含有较多的生物活性成分，多为酚酸类、酯类和肉桂酸衍生物，网购蜂胶也富含多种黄酮和酯类物质，与三省的原蜂胶代谢物相差无几，但胶囊中的酚酸类、酯类和肉桂酸及其衍生物等生物活性成分含量较少，原因可能是胶囊加工过程中除蜂蜡时过高的温度造成挥发油、黄酮和低沸点的酚类物质流失，脱除蜂胶重金属时的络合会造成酯类物质的损失；同时比蜂胶原胶多了紫草素等天然色素类物质。紫草素属于萘醌类化合物，具有良好抗氧化和抑菌效果，紫草素存在原因有两个，一为蜂胶胶囊的原料蜂胶中富含紫草素，二为胶囊加工过程中引入，由于蜂胶胶囊中含有的黄酮和酚酸类物质不稳定，所以加入天然色素和着色剂以防止光线的透过，使胶囊中的生物活性成分趋于稳定。综上所述，蜂胶加工程度的不同导致蜂胶胶囊中代谢物的差异，蜂胶原胶中含有更多的生物活性成分，蜂胶胶囊虽作为蜂胶提取物的浓缩液，但加工过程中有效成分损失和辅料的加入，都会直接影响胶囊中生物活性成分的含量，在后续实验中会针对蜂胶胶囊中的黄酮类物质进行定量分析，从而为蜂胶胶囊的质控提供数据支持。
与常规靶向分析方法相比，本实施例基于uplc-qexactive技术结合代谢组学采用非靶向方法，能够检测到不同蜂胶中的低分子量和相对含量较少的代谢物，例如其它蜂胶研究中未提到的北美芹素、氧化前胡内酯、山豆根素、银杏酸等植物代谢物，这些物质相对于蜂胶中的主要成分含量较少，但通过uplc-qexactive的高分辨率和高灵敏度可以对其进行定性检测，同时也大大缩短了检测分析时间。样品前处理较简易，采用微波辅助提取，可以较为完整保留蜂胶中化合物。三个省份的原蜂胶中，山东和四川蜂胶共筛选定性出19种差异性代谢物，四川和河北省原蜂胶共筛选定性出19种差异性代谢物，山东和河北蜂胶差异性较小，共定性出9种差异性代谢物；由于网购蜂胶的加工程度较轻，生物活性成分损失较少，因此三个省份的原蜂胶与网购蜂胶差异较小，共筛选定性出6种差异性代谢物；蜂胶加工程度的不同导致蜂胶胶囊中代谢物的差异，胶囊制作工艺繁琐且复杂，原胶中的生物活性成分的部分损失和加工辅料的加入造成蜂胶胶囊与原蜂胶具有显著差异，通过筛选共定性21种差异性代谢物。筛选定性出的显著差异性的代谢物，虽不是在蜂胶中绝对含量高的物质，但确是对差异性贡献较大的物质，他们可以在极微量的代谢物水平解释不同蜂胶样品的差异，着重从相对含量水平而不是绝对含量上解释差异，从而为蜂胶产地溯源和蜂胶产品的合理使用提供了数据支撑。
综上，本实施例首次利用uplc-qexactive法对三个不同省份原蜂胶、网购蜂胶和蜂胶胶囊进行代谢组学分析，以95％的甲醇做提取剂，乙腈-0.1％甲酸水进行梯度洗脱，上机测定后的数据进行非靶向筛选，得到不同省份原蜂胶、网购蜂胶和蜂胶胶囊的差异性代谢物，从而在极微量代谢物水平解释不同样品间的差异。此方法应用于成分复杂的蜂胶研究中具有提取充分、分离度高、精密度高，灵敏度高等优点，对蜂胶原胶及其制品的合理使用具有一定的实用意义。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！