一种左奥硝唑或其前体化合物中异构体的分离检测方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及一种左奥硝唑或其前体化合物中异构体的分离检测方法。


背景技术：

2.左奥硝唑是第三代硝基咪唑类抗菌药奥硝唑的左旋异构体，临床上主要用于治疗由脆弱拟杆菌、狄氏拟杆菌、卵园拟杆菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、梭状芽胞杆菌、真杆菌、消化球菌和消化链球菌、幽门螺杆菌、黑色素拟杆菌、梭杆菌、co2噬织维菌、牙龈类杆菌等厌氧菌所引起的多种感染性疾病，或者用于术前预防此类感染。左旋奥硝唑化学名称为(s)-(-)-1-(3-氯-2-羟丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑，其具有下式所示的化学结构：
[0003][0004]
已有研究表明，相对于奥硝唑的右旋异构体或其消旋体，左旋奥硝唑具有较低的神经毒性，为此其用药安全性得到显著改善。此外，现已开发出左旋奥硝唑的前体药物，包括左奥硝唑的磷酸酯或其盐(如磷酸左奥硝唑酯二钠)等。此类前体药物给药后，可在体内磷酸脂酶作用下迅速降解为左奥硝唑进而发挥药效。
[0005]
由于左奥硝唑或其前体药物在毒性、中枢抑制方面比右旋异构体均低，且药代动力学特性方面也优于右旋异构体，因此建立一个良好的对映体分离检测方法非常必要。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种左奥硝唑或其前体化合物中异构体的分离检测方法。左旋奥硝唑具有如下式(i)所示的结构：
[0007][0008]
根据本发明的实施方案，所述左旋奥硝唑的前体化合物选自左旋奥硝唑药学上可接受的前体药物，例如可以选自左旋奥硝唑的酯或所述酯药学上可接受的盐，其实例可以选自左奥硝唑氨基酸酯、磷酸左奥硝唑酯、磷酸左奥硝唑酯氨基酸盐、以及磷酸左奥硝唑酯与碱金属或碱土金属离子形成的盐中的至少一种；例如，磷酸左奥硝唑酯的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等中的至少一种，示例性为磷酸左奥硝唑酯二钠盐；所述左奥硝唑或其前体化合物中异构体为相应化合物的右旋异构体。
[0009]
根据本发明的实施方案，左旋奥硝唑或左旋奥硝唑的前体化合物可以其无定型或多晶型物的形式存在于药物组合物中。或者作为选择，左旋奥硝唑药学上可接受的前体药
物还可以选自所述酯药学上可接受的盐的溶剂合物，例如其水合物，例如所述酯药学上可接受的盐的1、2、3、4、5、6或7水合物中的至少一种，其实例可以选自磷酸左奥硝唑酯二钠盐的水合物，如其5水合物、6水合物、7水合物中的至少一种。
[0010]
根据本发明的实施方案，具体方法如下：
[0011]
一种左奥硝唑或左奥硝唑前体化合物中异构体的分离检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行检测，包括以下步骤：
[0012]
1)取左奥硝唑或左奥硝唑前体化合物待测药物，以及其异构体，用水、与水混溶的有机溶剂或流动相溶解，配成待测药物、其异构体的10～500μg/ml的溶液；
[0013]
2)取上述溶液适量，注入到高效液相色谱柱中，用流动相进行冲洗，所述高效液相色谱柱以硅胶健合蛋白质为填充剂，流动相为磷酸盐缓冲液与有机溶剂混合液，比例为98～100:2～0；流速为0.1-1.2ml/min，柱温为20-35℃，检测波长为320-322nm，进样量为1～100μl。
[0014]
进一步地，步骤2)中高效液相色谱柱以硅胶表面共价键合有人体血清白蛋白、α1-酸性糖蛋白或纤维二糖水解酶作为填充剂。
[0015]
进一步地，步骤1)中所述与水混溶有机溶剂选自异丙醇或甲醇；步骤2)中所述有机溶剂选自甲醇或乙醇，磷酸盐缓冲液选自磷酸盐-磷酸体系、磷酸盐-氢氧化钠体系或磷酸盐-氢氧化钾体系；所述磷酸盐选自磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵或磷酸氢二胺；磷酸盐缓冲液中磷酸盐浓度为0.01-0.1mol/l，优选0.01-0.05mol/ml；磷酸盐缓冲液与有机溶剂体积比优选99～100:1～0；磷酸盐缓冲液ph值为4.0-7.0，优选4.8-5.2。
[0016]
进一步地，所述步骤2)中流速为0.4-0.8ml/min，柱温为20-30℃，进样量为1-10μl。
[0017]
上述方法可用于分离检测左奥硝唑或其前体化合物的原料及其制剂中左奥硝唑或其前体化合物的异构体，同时也可将该异构体与其他杂质分离；所述制剂为胃肠道给药制剂或非胃肠道给药制剂；所述所述胃肠道给药制剂可以为片剂、分散片、胶囊剂、缓释剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂等；所述非胃肠道给药制剂可以为输液制剂、注射剂(如液体注射剂)、冻干剂(如冻干粉剂)、泡腾片、栓剂、舌下片剂等。
[0018]
本发明通过对检测条件的筛选和多次实验，提供一种左奥硝唑或其前体化合物中异构体的分离检测方法，能用于不同的检测目的，可用于分离检测左奥硝唑或其前体化合物中异构体，更适用于分析检测含杂质左奥硝唑或其前体化合物异构体的其制剂，特别是磷酸左奥硝唑酯二钠及其制剂。
[0019]
本发明提供的方法操作简便、系统适用性好。采用本发明提供的方法测定磷酸左奥硝唑酯二钠及其制剂时，空白溶剂为水，系统适用性溶液为磷酸左奥硝唑酯二钠与异构体(取磷酸左奥硝唑酯二钠与异构体适量，加水配制成磷酸左奥硝唑酯二钠与异构体浓度约为10μg/ml的溶液)，空白溶剂进样1针；系统适用性溶液连续进样6针，结果显示：异构体峰面积rsd为1.1％(＜5.0％)，保留时间rsd为0.2％(＜1.0％)；磷酸左奥硝唑酯二钠峰面积rsd为1.9％(＜5.0％)，保留时间rsd为0.3％(＜1.0％)，异构体与主成分之间分离度均＞1.5。
[0020]
本发明提供的方法灵敏度高、专属性强，以磷酸左奥硝唑酯二钠为例，采用本发明提供的方法测定磷酸左奥硝唑酯二钠及其制剂时，空白溶剂为水，各已知杂质定位溶液分
别为左奥硝唑、杂质ⅰ、杂质ⅱ、杂质ⅲ及环合物杂质(各成分适量加水溶解制成各杂质浓度分别约为0.1mg/ml的溶液)，以及异构体定位溶液(取异构体适量，加水配制成浓度约0.05mg/ml的异构体杂质对照储备液，取该储备液10ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得)。结果显示：空白溶剂无干扰；已知杂质无干扰；混合溶液中异构体与相邻杂质组分之间的分离度＞1.5。
[0021][0022]
其中：杂质ⅰ为2-甲基-5-硝基咪唑；杂质ⅱ为1-(2,3-环氧丙烷)-2-甲基-5-硝基咪唑；杂质ⅲ为1-(2，3-二羟基丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑；环合物杂质为(s)-4-((2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)甲基)-1,3,2-磷杂环戊烷-2-油酸酯钠盐-2-氧化物；
[0023]
本发明提供的方法准确性佳，具有良好的分离度和低的检测限，以磷酸左奥硝唑酯二钠为例，采用本发明提供的方法测定磷酸左奥硝唑酯二钠及其制剂时，取高浓度异构体对照品溶液，加水逐级稀释至系列浓度，进样，当信噪比s/n约为3时浓度定为检测限。信噪比s/n约为10时的浓度定为定量限，并将定量限溶液平行配制6份，各进样1针，考察精密度。结果显示：异构体的定量限浓度为0.43μg/ml，检测限浓度为0.26μg/ml，定量限溶液进样6针保留时间rsd为0.2％，小于1.0％，峰面积rsd为8.5％，小于10.0％，均符合规定，该方法在定量限浓度水平精密度良好。
[0024]
异构体检测限与定量限
[0025]
名称浓度(μg/ml)信噪比(s/n)相当于供试品溶液浓度(％)定量限0.4312.30.022检测限0.267.50.013
[0026]
异构体定量限精密度
[0027]
loq重复性123456rsd(％)保留时间(min)11.01811.04411.05111.04811.01511.0650.2峰面积2.001.962.232.211.912.368.5
[0028]
本发明提供的方法线性关系良好，用于分析检测磷酸左奥硝唑酯二钠及其制剂时，取异构体对照品适量，加水溶解，在定量限至限度浓度150％浓度范围内配制6份浓度不同的溶液，分别精密量取2μl注入液相色谱仪，以浓度为横坐标(x)，异构体峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归分析。结果显示：磷酸右奥硝唑酯二钠在0.4272～12.8156μg/ml浓度范围内，线性回归方程为y＝5.8368x-0.2341，相关系数r为0.9999，大于0.990，y轴截距为100％响应值的0.5％，小于25％，符合规定，表明异构体在0.4272～12.8156μg/ml浓度范围内线性关系良好。
[0029]
附图说明
[0030]
图1：本发明检测条件下实施例2的检测图谱；
[0031]
图2：本发明检测条件下实施例3的检测图谱；
[0032]
图3：本发明检测条件下实施例18的检测图谱；
[0033]
图4：对比例1检测条件下的检测图谱；
[0034]
图5：对比例9检测条件下的检测图谱；
[0035]
图6：对比例17检测条件下的检测图谱；
具体实施例
[0036]
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
[0037]
实施例1-14
[0038]
色谱柱：has，0.40cm
×
15cm，5μm色谱柱，硅胶表面共价键合有人体血清白蛋白作为填充剂；
[0039]
稀释剂：水；
[0040]
柱温：28℃；
[0041]
进样体积：2μl；
[0042]
运行时间：25min；
[0043]
检测波长：321nm
[0044][0045]
检测步骤：
[0046]
1)溶液配制：取磷酸左奥硝唑酯二钠工作对照品与磷酸右奥硝唑酯二钠对照品各适量，加水稀释成所需浓度的溶液。
[0047]
2)检测：精密量取上述溶液2μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0048]
3)结果：实施例1-13中中磷酸右奥硝唑酯二钠、磷酸左奥硝唑酯二钠分离度均大于1.5，但实施例1-7缓冲液浓度为0.01-0.05mol/l，ph 4.8-5.2范围内，峰型良好，以实施例2-3为例，见图2-3。实施例8-13中缓冲液浓度升为0.08-0.1mol/l时，峰型差，塔板数较低。
[0049]
实施例14-35
[0050]
色谱柱：has，0.40cm
×
15cm，5μm色谱柱，硅胶表面共价键合有人体血清白蛋白作为填充剂；
[0051]
稀释剂：水；
[0052]
柱温：25℃；
[0053]
进样体积：2μl；
[0054]
检测波长：321nm
[0055]
流动相：
[0056]
实施例流动相ph(磷酸调节)流速(ml/min)结果140.01mol/lna3po4：乙醇＝99:17.00.3r>1.5，峰型差150.01mol/lna3po4：乙醇＝98:27.00.5r>1.5，峰型差160.01mol/lna3po4：乙醇＝99.8:0.27.00.4r>1.5，峰型差170.01mol/lna3po4：乙醇＝99:16.00.4r>1.5，峰型差180.01mol/lna3po4：乙醇＝99:15.00.4r>1.5，峰型良好190.01mol/lna3po4：乙醇＝99.8:0.25.00.4r>1.5，峰型良好200.01mol/lna3po4：甲醇＝99:17.00.4r>1.5，塔板数低210.01mol/lna3po4：甲醇＝99:16.00.4r>1.5，塔板数低220.02mol/lna3po4：甲醇＝99:15.00.5r>1.5，峰型良好230.03mol/lna3po4：甲醇＝99:15.00.5r>1.5，峰型良好240.05mol/lna3po4：甲醇＝99:15.00.4r>1.5，峰型良好250.01mol/lna3po4：甲醇＝99.8:0.25.00.5r>1.5，峰型良好260.02mol/lna3po4：甲醇＝99.8:0.25.00.5r>1.5，峰型良好
270.03mol/lna3po4：甲醇＝99.8:0.25.00.5r>1.5，峰型良好280.05mol/lna3po4：甲醇＝99.8:0.25.00.5r>1.5，峰型良好290.01mol/lna3po47.00.5r>1.5，峰型拖尾300.01mol/lna3po46.00.5r>1.5，峰型较宽310.01mol/lna3po45.00.8r>1.5，峰型良好320.02mol/lna3po47.00.5r>1.5，峰型拖尾330.03mol/lna3po45.00.4r>1.5，峰型良好340.05mol/lna3po45.00.5r>1.5，峰型良好350.1mol/lna3po45.00.8r>1.5，塔板数低
[0057]
检测步骤：
[0058]
1)溶液配制：取磷酸左奥硝唑酯二钠工作对照品与磷酸右奥硝唑酯二钠对照品各适量，加水稀释成约0.5mg/ml浓度的溶液。
[0059]
2)检测：精密量取上述溶液2μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0060]
3)结果：实施例15-35中磷酸右奥硝唑酯二钠、磷酸左奥硝唑酯二钠分离度均大于1.5，但实施例15-18、21-22、30、31、33显示，流动相ph为5时，峰型良好，以实施例19为例，见图3；流动相ph≥6时出现理论塔板数差，出现峰型宽、拖尾等问题。
[0061]
对比例1-8:
[0062]
色谱柱：ultron es-ovm(150*4.6mm*5μm)色谱柱，卵粘蛋白键合硅胶作为填充剂；
[0063]
稀释剂：水；
[0064]
流速：1.0ml/min；
[0065]
柱温：25℃；
[0066]
进样体积：3μl；
[0067][0068]
检测步骤：
[0069]
1)溶液配制：取磷酸左奥硝唑酯二钠对照品与磷酸右奥硝唑酯二钠对照品各适量，精密称定，加水稀释成每1ml中均约含10μg的溶液。
[0070]
2)检测：精密量取上述溶液2μl注入液相色谱仪，记录色谱图，对比例1-8中磷酸右奥硝唑酯二钠、磷酸左奥硝唑酯二钠均均未能分离，以对比例1为例，见图4。
[0071]
对比例9-16：
[0072]
色谱柱：has，0.40cm
×
15cm，5μm色谱柱，硅胶表面共价键合有人体血清白蛋白作为填充剂；
[0073]
稀释剂：水；
[0074]
柱温：25℃；
[0075]
进样体积：2μl；
[0076]
检测波长：321nm
[0077]
流动相：
[0078][0079]
检测步骤：
[0080]
1)溶液配制：取磷酸左奥硝唑酯二钠工作对照品与磷酸右奥硝唑酯二钠对照品各适量，加水稀释成约0.5mg/ml浓度的溶液。
[0081]
2)检测：精密量取上述溶液2μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0082]
3)结果：对比例9-16中磷酸右奥硝唑酯二钠、磷酸左奥硝唑酯二钠均未能分离，以对比例9为例，见图5。
[0083]
对比例17-18
[0084]
色谱柱：has，0.40cm
×
15cm，5μm色谱柱，硅胶表面共价键合有人体血清白蛋白作为填充剂；
[0085]
稀释剂：水；
[0086]
柱温：25℃；
[0087]
进样体积：2μl；
[0088]
检测波长：321nm
[0089]
流动相：
[0090]
对比例流动相ph(氢氧化钾)流速(ml/min)结果170.02mol/l kh2po4：异丙醇＝99:15.00.8r<1.5，未能分离180.02mol/l kh2po4：异丙醇＝99:13.00.4r<1.5，未能分离
[0091]
检测步骤：
[0092]
1)溶液配制：取磷酸左奥硝唑酯二钠工作对照品与磷酸右奥硝唑酯二钠对照品各适量，加水稀释成约0.5mg/ml浓度的溶液。
[0093]
2)检测：精密量取上述溶液2μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0094]
3)结果：对比例17-18显示中流动相以异丙醇为有机溶剂时磷酸右奥硝唑酯二钠、磷酸左奥硝唑酯二钠均未能分离，以对比例17为例，见图6。