一种基于高效液相色谱-二极管阵列法检测小麦粉中有机污染物的方法与流程

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱-二极管阵列法检测小麦粉中有机污染物的方法。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

苯甲羟肟酸，易溶于水，甲醇等，由于苯甲羟肟酸分子的极性基团中存在着两种带孤对电子的氧原子和氮原子，而且这两种原子的距离相隔较近，因此很容易与cu²⁺、ni²⁺、fe³⁺等金属离子形成稳定的杂环配合物，是一种十分重要的选矿药剂，现有通常将其作为菱锌矿、黑钨矿和白钨矿及锡石等难选矿物的有效捕收剂。但由于苯甲羟肟酸含有苯环结构及n元素，属较难降解有机物，给人类和生态环境带来了潜在的风险和危害。小麦粉是我国北方民众最常食用的主食之一，也是许多烘焙等加工食品的主要原料来源。近期有舆情报道小麦粉中掺入苯甲羟肟酸非食品原料的报道，所以建立小麦粉中苯甲羟肟酸的测定方法并对其进行监测至关重要。

目前报道的测定苯甲羟肟酸的方法仍然相对较少，已有报道中针对苯甲羟肟酸的检测方法主要有红外光谱法、紫外光度法、直接分光光度法、反相高效液相法等，但发明人发现，上述检测方法存在假阳性、检测灵敏度低、分析误差大等诸多问题，同时现有技术中尚未有关于针对在小麦粉中对苯甲羟肟酸进行检测的报道，因此，需要考虑多种因素选择合适的检测方法从而实现对小麦粉中苯甲羟肟酸的检测。

技术实现要素：

针对目前现有技术的不足，本发明提供一种基于高效液相色谱-二极管阵列法检测小麦粉中有机污染物的方法，本发明通过采用甲醇提取样品中的苯甲羟肟酸，并进一步建立了液相色谱-二极管阵列检测方法，本发明方法简便、灵敏，非常适用于小麦粉中苯甲羟肟酸的测定，因此具有良好的实际应用之价值。

为了实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种基于高效液相色谱-二极管阵列法检测小麦粉中有机污染物的方法，所述方法包括：

将待测样品加入溶剂溶解进行前处理后，采用高效液相色谱-二极管阵列法进行检测。

其中，所述待测样品为小麦粉；

所述有机污染物为苯甲羟肟酸。

所述溶剂包括但不限于水和甲醇，及其组合；优选为甲醇，由于苯甲羟肟酸为弱酸，易溶于水及甲醇。根据相似相溶原理，本发明比较了水、甲醇/水(5:5，v:v)、甲醇三种提取剂的回收率，发现三种提取剂下小麦粉中苯甲羟肟酸的回收率都在90％以上，但考虑到含水溶液提取出的极性杂质较多，最终选择甲醇作为最佳提取剂。

所述前处理方法具体为：向待测样品中加入甲醇，涡旋，超声提取，离心，取上层有机层过滤膜，得待测液进行上机检测。

液相色谱条件为：色谱柱：watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，3.5μm)；流动相：a为磷酸二氢钾溶液(ph＝3.7)，b为甲醇；检测波长：228nm；流速1.0ml/min，进样体积：10μl；柱温40℃；梯度洗脱。

梯度洗脱程序见下表：

本发明的第二个方面，上述检测方法在如下中的应用：

a)面粉质量控制；

b)面粉有机污染物监测。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案建立了小麦粉中苯甲羟肟酸的液相色谱方法。目标化合物经甲醇提取后，直接上机测定，前处理操作简单。经试验验证，上述技术方案在0.1～10μg/ml范围内线性关系良好(r²＞0.999)；方法检出限为0.1mg/kg，定量限为0.5mg/kg；在loq、2loq和10loq三个添加水平下重复测定6次的回收率为93.7％～102.7％，rsd为1.1％～3.8％。

因此优化后的液相色谱方法去除干扰能力强，检测方法操作简单、灵敏度高、准确度好、稳定可靠，适用于小麦粉中苯甲羟肟酸的测定，同时为建立相关标准及监管部门风险监控提供技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1a为本发明实施例中以甲醇-磷酸盐为流动相时标准溶液的色谱峰；

图1b为本发明实施例中以甲醇-醋酸铵为流动相时标准溶液的色谱峰；

图1c为本发明实施例中以甲醇-水为流动相时标准溶液的色谱峰；

图2为本发明实施例中苯甲羟肟酸及干扰物的紫外光谱图；

图3a为本发明实施例中以5％甲醇为流动相时标准溶液的色谱峰；

图3b为本发明实施例中以10％甲醇为流动相时标准溶液的色谱峰；

图3c为本发明实施例中以20％甲醇为流动相时标准溶液的色谱峰；

图3d为本发明实施例中以30％甲醇为流动相时标准溶液的色谱峰；

图3e为本发明实施例中以40％甲醇为流动相时标准溶液的色谱峰；

图4为本发明实施例中苯甲羟肟酸的校正曲线图；

图5a为本发明实施例中阴性小麦粉的hplc色谱图；

图5b为本发明实施例中添加量为定量限(0.5mg/kg)的小麦粉的hplc色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，目前报道的测定苯甲羟肟酸的方法仍然相对较少，已有报道中针对苯甲羟肟酸的检测方法主要有红外光谱法、紫外光度法、直接分光光度法、反相高效液相法等，但上述检测方法存在假阳性、检测灵敏度低、分析误差大等诸多问题，同时现有技术中尚未有关于针对在小麦粉中对苯甲羟肟酸进行检测的报道。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种基于高效液相色谱-二极管阵列法检测小麦粉中有机污染物的方法，所述方法包括：

将待测样品加入溶剂溶解进行前处理后，采用高效液相色谱-二极管阵列法进行检测。

其中，所述待测样品为小麦粉；

所述有机污染物为苯甲羟肟酸。

本发明的又一具体实施方式中，所述溶剂包括但不限于水和甲醇，及其组合；优选为甲醇，由于苯甲羟肟酸为弱酸，易溶于水及甲醇。根据相似相溶原理，本发明比较了水、甲醇/水(5:5，v:v)、甲醇三种提取剂的回收率，发现三种提取剂下小麦粉中苯甲羟肟酸的回收率都在90％以上，但考虑到含水溶液提取出的极性杂质较多，最终选择甲醇作为最佳提取剂。

本发明的又一具体实施方式中，所述前处理方法具体为：向待测样品中加入甲醇，涡旋，超声提取，离心，取上层有机层过滤膜，得待测液进行上机检测。

本发明的又一具体实施方式中，所述待测样品与甲醇的质量体积比为1g：3～6ml，优选为1g：5ml。

涡旋处理0.5～3min，优选为1min；

超声提取10～20min，优选为15min；

离心处理条件为：5000～10000r/min离心2～8min，优选为9000r/min离心5min；

本发明的又一具体实施方式中，所述滤膜为有机滤膜，滤膜孔径为0.22μm。

本发明的又一具体实施方式中，液相色谱条件为：色谱柱：watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，3.5μm)；流动相：a为磷酸二氢钾溶液(ph＝3.7)，b为甲醇；检测波长：228nm；流速1.0ml/min，进样体积：10μl；柱温40℃；梯度洗脱。

本发明的又一具体实施方式中，梯度洗脱程序见下表：

本发明的又一具体实施方式中，采用外标法进行定量。

本发明的又一具体实施方式中，上述检测方法在如下中的应用：

a)面粉质量控制；

b)面粉有机污染物监测。

其中，所述面粉为小麦粉；

所述有机污染物为苯甲羟肟酸。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

1.材料与方法

1.1仪器与试剂

型号s6000高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(华谱科技有限公司，中国)；bt125d电子天平(德国sartorius公司)；ms3型涡旋混合器(德国ika公司)；sb-800dtd超声清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；mili-q超纯水机(美国millipore公司)。

苯甲羟肟酸(购于美国cato公司)；甲醇(色谱纯)；磷酸二氢钾(kh2po4)，分析纯，国药集团；磷酸(h3po4)，分析纯，国药集团。

1.2标准溶液配制

准确称取苯甲羟肟酸标准品，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1mg/ml的标准储备液，于-18℃避光保存。准确移取苯甲羟肟酸标准储备液，用甲醇稀释配制成浓度为10μg/ml的混合标准中间液。然后用甲醇稀释配制成浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的系列标准工作溶液。

1.3样品前处理

准确称取试样2g(精确至0.001g)，置于50ml具塞离心管中，准确加入10ml甲醇，涡旋1min，超声提取15min，9000r/min离心5min，取上层有机层过0.22μm有机滤膜，供液相色谱仪测定。

1.4液相色谱条件

色谱柱:watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，3.5μm)；流动相：a为磷酸二氢钾溶液(ph＝3.7)，b为甲醇；检测波长：228nm；流速1.0ml/min，进样体积：10μl；柱温40℃；洗脱方式：梯度洗脱见表1。

表1液相色谱方法流动相梯度洗脱程序

2结果与讨论

2.1前处理条件的优化

苯甲羟肟酸为弱酸，易溶于水及甲醇。根据相似相溶原理，实验比较了水、甲醇/水(5:5，v:v)、甲醇三种提取剂的回收率，发现三种提取剂下小麦粉中苯甲羟肟酸的回收率都在90％以上，但考虑到水溶液提取出的极性杂质较多，所以选择甲醇作为最终的提取剂。

2.2液相色谱条件优化

由于苯甲羟肟酸为弱酸，其pka为8.89，存在分子和离子两种形态。在流动相为ph＞pka+2时，即ph＞10.89时主要以离子形式存在，易分配在流动相中，保留性不仅弱，而且对于大部分普通的c18色谱柱(ph＝2～8)而言，ph较高，易造成硅胶溶解。在ph＜pka-2时，即ph＜6.89时主要以分子形式存在，易分配在固定相中，保留性强。

2.2.1流动相的选择

本实施例首先尝试采用x-bridgec18色谱柱比较标准溶液采用甲醇-磷酸盐(ph＝3.7)、甲醇-醋酸铵(未调ph，ph≈6.8)和甲醇-水三种流动相在相同梯度洗脱条件下(有机相：水相＝20:80，v/v)的色谱峰形(图1a，1b，1c)和保留时间、峰高及峰面积(表2)。由上述图和表可知，三种流动相条件下的保留时间基本一致，这是由于水溶解空气中的二氧化碳后，导致三种流动相的ph都小于7，苯甲羟肟酸都以分子状态存在。但峰形差异较大，按照甲醇-磷酸盐(ph＝3.7)、甲醇-醋酸铵(未调ph，ph≈6.8)和甲醇-水的顺序峰形逐渐变差，导致峰高逐渐降低，严重影响化合物的灵敏度。于是又尝试将醋酸铵的ph调至3.7与磷酸盐一致，发现峰形并无改善，所以最后选择甲醇-磷酸盐做为最终的流动相。

表2三种流动相组成在相同梯度洗脱条件下(有机相：水相＝20:80，v/v)的保留时间、峰高、峰面积

2.2.2梯度条件的选择

在小麦粉中添加10mg/kg的目标化合物，按照1.3处理后，考察上述流动相梯度(甲醇：磷酸盐＝20:80，v/v)洗脱下是否存在潜在干扰物影响苯甲羟肟酸的定性及定量测定，发现小麦粉中存在较明显的干扰峰且其紫外光谱特征明显不同于目标物苯甲羟肟酸(图2)，而且目标物与干扰峰不能达到完全分离。所以尝试调节有机相的比例(5％～40％)来增加干扰物和苯甲羟肟酸的分离度，见图3a～3e，发现当甲醇的占比为5％和30％时，两化合物达到完全分离，但只有在甲醇比例为5％时，目标物和干扰物分离度最佳，故最终选择5％甲醇作为最终的洗脱条件。最后又尝试atlantist3色谱柱的分离效果，发现虽然小麦粉和面粉改良剂中都无干扰峰影响，但由于其保留能力强，导致目标化合物在24.00min出峰，明显晚于x-bridgec18(15.68min)，不仅峰形变宽，导致灵敏度降低，而且运行时间延长，检测效率降低。

2.3方法的线性范围、校正曲线及相关系数

将1.2配制的标准工作溶液进行高效液相色谱检测，以标准工作溶液峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果表明，hplc-pda方法在浓度为0.1～10μg/ml范围内，r²都大于0.999，线性良好，见图4。

2.4检出限与定量限

采用在空白小麦粉中添加目标化合物的方法，确定方法的检出限与定量限。以对应色谱峰响应值3倍信噪比的质量浓度作为方法检出限，以能够准确定量的曲线浓度最低点作为方法的定量限，见表3。

表3苯甲羟肟酸的检出限、定量限、线性范围、加标回收率和精密度

3.4方法回收率和精密度

采用在阴性小麦粉中添加定量限、2倍定量限、10倍定量限的目标化合物进行加标回收试验，验证方法准确度和精密度。每个浓度水平平行测定6次取平均值，计算回收率和精密度。结果见表3。添加水平为定量限的hplc-pda色谱图见图5a-5b。

3.5样品测定

对市售的20个小麦粉的苯甲羟肟酸测定，方法的适用性好，未发现有阳性样品检出。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。