草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒、专用饲料瓶及方法与流程

本发明涉及农业害虫抗药性检测技术领域，具体涉及一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒、该试剂盒专用的饲料盒以及快速鉴定方法。

背景技术：

草地贪夜蛾是联合国粮农组织全球预警的跨国界迁飞性重大害虫，于2019年4月入侵广东省，不到一年时间，已迁飞扩散至全省21个地级市97个行政县。广东省既是草地贪夜蛾周年繁殖区，又是境外虫源入侵必经地。广东省是我国鲜食玉米主产区，鲜食玉米全年种植，为草地贪夜蛾提供了持续丰富的食源，使之得以落地生根并大量繁殖。玉米和水稻是我国主粮，分别占我国粮食产量的40％和33％，玉米和水稻减产将严重影响我国粮食战略安全。在转基因bt玉米推广种植之前，化学防治一直是草地贪夜蛾主要分布国家和地区，例如美国和巴西等必需的防治手段。由于不同国家和地区对草地贪夜蛾的防控措施不同，对杀虫剂的依赖程度和使用频率不一，导致了各地草地贪夜蛾抗性程度的不同。在经历了多个国家化学农药和生物农药的防控后，这些入侵中国的草地贪夜蛾的具体抗药性状况目前尚不明确。有关草地贪夜蛾抗性的报道主要集中在传统的有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂，且抗性发生区域大多集中在美国佛罗里达州、波多黎各及墨西哥、巴西等地。此外，已有少量关于草地贪夜蛾对酰胺类杀虫剂如氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺抗性的报道。草地贪夜蛾为我国新入侵重大害虫，国内目前还没有防治用药登记，故农业部推荐了氯虫苯甲酰胺、氟氯氰菊酯等25种应急药剂。倘若短期内在田间大量盲目使用此类高效、低毒的杀虫剂，势必会加大药剂对靶标害虫的选择压力，带来很大的抗药性风险。基于此，迫切需要针对草地贪夜蛾开展一系列科学有效的抗药性监测和抗性机理研究。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提出一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒，该试剂盒中装配了人工饲料和高频使用的杀虫剂品种，可以快速地测试田间草地贪夜蛾的抗药性，没有季节和实验条件限制，有效提高测试效率，缩短了草地贪夜蛾抗性鉴定时间，整套技术操作简单、易学易懂、不需要专业人士进行药剂配制等前处理，室内室外都能使用，占用场地少，具有实际应用价值。

本发明还提供了所述草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒的制备方法。

本发明还提供了专用于所述草地贪夜蛾抗药性快速鉴定的专用饲料瓶。同时，还提供了应用该草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒快速鉴定田间草地贪夜蛾抗药性的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定专用饲料瓶，其包括透明瓶身，所述透明瓶身设有瓶口，还包括可拆卸封盖在所述瓶口上的瓶盖，所述瓶盖包括固定连接的盖板和盖沿，所述盖板设有多个透气微孔，所述盖板还贴有耐高温贴纸。

进一步的，所述透明瓶身呈圆柱状，直径为3～5cm，高度为5～7cm。

进一步的，所述盖板上的透气微孔为8～10个，所述透气微孔的直径为2～3mm。

一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒，其包括2龄虫诊断试剂瓶、3龄虫诊断试剂瓶、4龄虫诊断试剂瓶；

所述2龄虫诊断试剂瓶、3龄虫诊断试剂瓶、4龄虫诊断试剂瓶均采用上述的专用饲料瓶装配饲料和杀虫剂；

所述2龄虫诊断试剂瓶装配的杀虫剂包括甲氨基阿维菌素苯甲酸盐0.34mg/l、高效氯氟氰菊酯4.20mg/l、虫螨腈4.35mg/l、茚虫威21.51mg/l、氯虫苯甲酰胺1.19mg/l或虱螨脲2.98mg/l中的任意一种；

所述3龄虫诊断试剂瓶装配的杀虫剂包括甲氨基阿维菌素苯甲酸盐0.48mg/l、高效氯氟氰菊酯10.02mg/l、虫螨腈20.45mg/l、茚虫威23.67mg/l、氯虫苯甲酰胺5.33mg/l或虱螨脲4.51mg/l中的任意一种；

所述4龄虫诊断试剂瓶装配的杀虫剂包括甲氨基阿维菌素苯甲酸盐0.76mg/l、高效氯氟氰菊酯45.07mg/l、虫螨腈22.68mg/l、茚虫威48.33mg/l、氯虫苯甲酰胺12.56mg/l或者虱螨脲31.31mg/l中的任意一种。

进一步的，所述饲料中各组份按重量份计为黄豆粉100～120份、玉米粉150～160份、玉米叶粉30～40份、酵母粉30～40份、纤维素40～50份、酪蛋白100～110份、琼脂30～40份、水1000份、对羟基苯甲酸丙酯钠15～20份、山梨酸钾5～8份、维生素混合液20～30份、氯化胆碱1～5份、胆固醇1～5份。

进一步的，还包括1龄虫诊断试制瓶，所述1龄虫诊断试制瓶采用上述的专用饲料瓶装配饲料和杀虫剂，所述1龄虫诊断试制瓶装配的杀虫剂包括甲氨基阿维菌素苯甲酸盐为0.191mg/l，高效氯氟氰菊酯为2.91mg/l，虫螨腈为1.49mg/l，茚虫威为12.98mg/l，氯虫苯甲酰胺为0.85mg/l，虱螨脲为3.32mg/l中的任意一项。

进一步的，所述杀虫剂的诊断剂量是通过不同浓度的杀虫剂在所述专用饲料瓶中对不同龄虫的敏感品系草地贪夜蛾进行毒力测定，计算不同龄虫的lc99作为该龄虫杀虫剂的诊断剂量。

进一步的，所述杀虫剂的诊断剂量是通过如下步骤确定的：

配制好饲料；

配制不同浓度梯度的杀虫剂溶液；

不同浓度梯度的杀虫剂溶液分别加入饲料混合均匀，然后分装于所述专用饲料瓶中，成为诊断试剂瓶，冷藏备用；

从各地田间采集回来草地贪夜蛾卵块混合饲养多代，获得室内饲养的混合种群；

不同龄幼虫分别放入准备好的诊断试剂瓶中，然后用干净的纸巾或纱布盖上，确保纸巾或纱布完全盖住瓶口，撕开瓶盖内的耐高温贴纸，盖上瓶盖，继续饲养，进行毒力测定；

对毒力测定结果做回归曲线，并计算lc99作为各龄虫杀虫剂的诊断剂量。

进一步的，对于1龄虫和2龄虫，每个浓度的诊断试剂瓶中加入幼虫10头，至少进行4次生物学测定；对于3龄虫和4龄虫，每个浓度的诊断试剂瓶中加入幼虫1头，至少做30次生物学测定。

进一步的，本发明的试剂盒还包括草地贪夜蛾敏感品系的杀虫剂剂量-龄期-活性关系表。

一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：

将草地贪夜蛾饲料和权利要求1或2所述的专用饲料瓶分别灭菌；

饲料在室温条件下放置至温度降至50℃以下后，于超净工作台上按剂量加入杀虫剂，持续搅拌均匀后，倒入已消毒的专用饲料瓶的透明瓶身中，厚度控制为0.5-1cm；

盖上盖子，并待饲料冷却至室温后，做好标记，用灭菌后的密封袋密封好；

放置于冰箱中冷藏。

一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定方法，其包括以下步骤：

将田间草地贪夜蛾幼虫按照龄期分别挑入权利上述的试剂盒中的相对应的诊断试剂瓶中进行饲养；

对于1龄虫和2龄虫每个诊断试剂瓶处理10头，重复4次；

对于3龄虫和4龄虫每个诊断试剂瓶处理幼虫1头，重复30次；

在瓶口盖上一层灭菌后的厨房纸巾，再盖上瓶盖；

高效氯氟氰菊酯在药剂处理后24h检查幼虫死亡数，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、虫螨腈、茚虫威、氯虫苯甲酰胺和虱螨脲均在药剂处理后72h检查幼虫死亡数；

死亡率小于95％的种群为抗性种群。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明以实验室内饲养的敏感品系草地贪夜蛾与杀虫剂的关系为基础，制备出不同杀虫剂与草地贪夜蛾幼虫的响应关系，直接以田间草地贪夜蛾幼虫为材料进行检测，具有操作简单、省时、具有前瞻性等优点。可以作为早期抗性监测的方法，能快速准确测定草地贪夜蛾对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯、虫螨腈、茚虫威、虱螨脲等的抗性水平，从而指导生产实践中草地贪夜蛾的合理治理，实现科学规划杀虫的目的，同时提高测量数据的准确性，避免化学农药滥用、保护自然环境、保护国家粮食安全、控制害虫抗性发展的目的，具有广泛推广应用价值。

附图说明

图1为本发明的草地贪夜蛾抗药性快速鉴定专用饲料瓶的结构示意图；

图2为本发明的草地贪夜蛾抗药性快速鉴定专用饲料瓶的瓶盖结构图；

图3为本发明的草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒的诊断试剂瓶的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明的保护范围。

实施例1

请参照图1和图2，一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定专用饲料瓶，所述专用饲料瓶是透明塑料制成的，包括可拆卸连接的透明瓶身2和瓶盖1。所述透明瓶身2具有瓶口，所述瓶盖1用于封盖所述瓶口。所述瓶盖1包括固定连接的盖板11和盖沿12，所述盖板11设有多个透气微孔11a。所述盖板11还贴有耐高温贴纸13。

具体地，所述耐高温贴纸13可以贴在所述盖板1的内表面，或者贴在所述盖板1的外表面。在本实施例中优选贴在盖板1的外表面上，以方便撕开。

具体地，所述透明瓶身2呈圆柱状，直径为3～5cm，高度为5～7cm；所述盖板1上的透气微孔11a为8～10个，所述透气微孔11a的直径为2～3mm。将专用饲料瓶的设计上以上的小型化饲料瓶，既能满足幼虫的饲养要求又方便携带。

实施例2

一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒，其包括2龄虫诊断试剂瓶、3龄虫诊断试剂瓶、4龄虫诊断试剂瓶；

所述2龄虫诊断试剂瓶、3龄虫诊断试剂瓶、4龄虫诊断试剂瓶均采用上述的专用饲料瓶装配饲料和杀虫剂；

所述2龄虫诊断试剂瓶装配的杀虫剂包括甲氨基阿维菌素苯甲酸盐0.34mg/l、高效氯氟氰菊酯4.20mg/l、虫螨腈4.35mg/l、茚虫威21.51mg/l、氯虫苯甲酰胺1.19mg/l或虱螨脲2.98mg/l中的任意一种；

所述3龄虫诊断试剂瓶装配的杀虫剂包括甲氨基阿维菌素苯甲酸盐0.48mg/l、高效氯氟氰菊酯10.02mg/l、虫螨腈20.45mg/l、茚虫威23.67mg/l、氯虫苯甲酰胺5.33mg/l或虱螨脲4.51mg/l中的任意一种；

所述4龄虫诊断试剂瓶装配的杀虫剂包括甲氨基阿维菌素苯甲酸盐0.76mg/l、高效氯氟氰菊酯45.07mg/l、虫螨腈22.68mg/l、茚虫威48.33mg/l、氯虫苯甲酰胺12.56mg/l或者虱螨脲31.31mg/l中的任意一种。

虽然1龄虫较小，在田间存在量也较少，但不排除会需要检测1龄虫。因此，在本实施方式中，还增加了1龄虫诊断试制瓶，所述1龄虫诊断试制瓶采用上述的专用饲料瓶装配饲料和杀虫剂，所述1龄虫诊断试制瓶装配的杀虫剂包括甲氨基阿维菌素苯甲酸盐为0.191mg/l，高效氯氟氰菊酯为2.91mg/l，虫螨腈为1.49mg/l，茚虫威为12.98mg/l，氯虫苯甲酰胺为0.85mg/l，虱螨脲为3.32mg/l中的任意一项。

进一步的，所述饲料中各组份按重量份计为黄豆粉100～120份、玉米粉150～160份、玉米叶粉30～40份、酵母粉30～40份、纤维素40～50份、酪蛋白100～110份、琼脂30～40份、水1000份、对羟基苯甲酸丙酯钠15～20份、山梨酸钾5～8份、维生素混合液20～30份、氯化胆碱1～5份、胆固醇1～5份。

草地贪夜蛾幼虫的人工饲料配方是以实验室用的草地贪夜蛾饲料为基础，主要成分为黄豆粉、玉米粉、玉米叶粉、酵母粉、纤维素、酪蛋白、琼脂、对羟基苯甲酸丙酯钠、山梨酸钾、加强维生素混合液、氯化胆碱、胆固醇、蒸馏水等，该配方并根据草地贪夜蛾的需求对原材料和添加剂进行优化，能完全满足草地贪夜蛾幼虫生长所需的营养元素。

需要说明的是，本发明的草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒包含各个龄期幼虫的诊断试剂瓶，每个诊断试剂瓶只包含一种杀虫剂，但各个龄期幼虫的诊断试剂瓶分别包含多个诊断试剂瓶，以便在田间检测草地贪夜蛾的抗药性时具有多种选择，或者是做多种杀虫剂的鉴定。

进一步的，所述杀虫剂的诊断剂量是通过不同浓度的杀虫剂在所述专用饲料瓶中对不同龄虫的敏感品系草地贪夜蛾进行毒力测定，计算不同龄虫的lc99作为该龄虫杀虫剂的诊断剂量。

进一步的，所述杀虫剂的诊断剂量是通过如下步骤确定的：

(1)草地贪夜蛾抗药性快速鉴定专用饲料瓶的准备

取实施例1的专用饲料瓶，于高压灭菌锅中121℃高压灭菌20min后待用。

(2)带药饲料的准备：

步骤1：黄豆粉120g、玉米粉160g、玉米叶粉35g、酵母粉35g、纤维素45g、酪蛋白105g，搅拌均匀后置于自动蒸汽灭菌器中124℃灭菌30分钟；将40g琼脂放入1000ml水中，于微波炉中煮熔为止，将煮熔的琼脂溶液加入至上述灭菌后的饲料中并搅拌均匀。

步骤2：对羟基苯甲酸丙酯钠15g、山梨酸钾6g、加强维生素混合液30g、氯化胆碱5g、胆固醇5g放入含400ml灭菌水的烧杯中，在磁力搅拌器上搅拌溶解20分钟。

步骤3：配制不同浓度的杀虫剂剂量，每种浓度的杀虫剂配制好100ml母液。

步骤4：把步骤3的药剂加入步骤2中，搅拌均匀。

步骤5：等步骤1的温度降到50℃时加入步骤4并搅拌均匀，分装于专用饲料瓶中。

步骤6：温度降至室温时，做好标记，例如：1龄虫用的饲料用橙色标签，2龄虫用的饲料用蓝色标签，3龄虫用的饲料用黄色标签，4龄虫用饲料用红色标签，用密封袋装好置于4℃冰箱中保存备用。

(3)敏感品系草地贪夜蛾的准备

敏感品系的草地贪夜蛾是于2019年4月从云南、广东等地田间采回来的草地贪夜蛾卵块于实验室内传代饲养所得的混合种群。

除试验供虫以外，室内传代饲养的草地贪夜蛾不能离开饲养室。饲养条件为温度26℃±0.5℃、相对湿度65％±5％、光周期l∶d＝16h∶8h和光照强度8000lx。

草地贪夜蛾幼虫的饲料配方是以实验室用的夜蛾饲料为基础，主要成分为黄豆粉、玉米粉、玉米叶粉、酵母粉、纤维素、酪蛋白、琼脂、对羟基苯甲酸丙酯钠、山梨酸钾、加强维生素混合液、氯化胆碱、胆固醇、蒸馏水等，该配方并根据草地贪夜蛾的需求对原材料和添加剂进行优化，能完全满足草地贪夜蛾幼虫生长所需的营养元素。

(4)毒力测定

将1龄虫挑入步骤6中的橙色标签的带药饲料的专用饲料瓶中，2龄幼虫挑入至步骤6中蓝色标签的带药饲料的专用饲料瓶中，每个浓度处理10头，至少进行4次生物学测定。瓶口盖上一层干净的纸巾或纱布，确保纸巾或纱布完全盖住瓶口，盖上瓶盖，撕开瓶盖上的贴纸，继续饲养。

将3龄幼虫挑入至步骤6中黄色标签的带药饲料的专用饲料瓶中，每个专用饲料瓶中只挑入幼虫1头，至少进行30次生物学测定。瓶口盖上一层干净的纸巾或纱布，确保纸巾或纱布完全盖住瓶口，盖上瓶盖，撕开瓶盖上的贴纸，继续饲养。

将4龄幼虫挑入至步骤6中红色标签的带药饲料的专用饲料瓶中，每个专用饲料瓶中只挑入幼虫1头，至少进行30次生物学测定瓶口盖上一层干净的纸巾或纱布，确保纸巾或纱布完全盖住瓶口，盖上瓶盖，撕开瓶盖上的贴纸，继续饲养。

检查结果及死亡标准：高效氯氟氰菊酯在药剂处理后24h检查各浓度处理的幼虫死亡数。

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、虫螨腈、茚虫威、氯虫苯甲酰胺、虱螨脲5种药剂均在药剂处理后72h检查各浓度处理的幼虫死亡数。

死亡标准：以小毛笔轻触虫体，不动者视作为死亡个体。以对照死亡率小于10％为有效测定，并用对照死亡率进行校正。数据采用dps软件处理，6种杀虫剂对草地贪夜蛾的毒力测定结果见表1至表3。计算lc99,即得出各个药剂的诊断剂量。该诊断剂量可用于快速检测草地贪夜蛾田间种群对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、高效氯氟氰菊酯、虫螨腈、茚虫威、氯虫苯甲酰胺和虱螨脲的抗性水平。

表16种药剂对草地贪夜蛾1龄幼虫的毒力测定结果

对草地贪夜蛾2龄幼虫药剂的诊断剂量：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐为0.191mg/l，高效氯氟氰菊酯为2.91mg/l，虫螨腈为1.49mg/l，茚虫威为12.98mg/l，氯虫苯甲酰胺为0.85mg/l，虱螨脲为3.32mg/l。

表26种药剂对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力测定结果

对草地贪夜蛾2龄幼虫药剂的诊断剂量：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐为0.34mg/l，高效氯氟氰菊酯为4.20mg/l，虫螨腈为4.35mg/l，茚虫威为21.51mg/l，氯虫苯甲酰胺为1.19mg/l，虱螨脲为2.98mg/l。

表36种药剂对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力测定结果

对草地贪夜蛾3龄幼虫药剂的诊断剂量：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐为0.48mg/l，高效氯氟氰菊酯为10.02mg/l，虫螨腈为20.45mg/l，茚虫威为23.67mg/l，氯虫苯甲酰胺为5.33mg/l，虱螨脲为4.51mg/l。

表46种药剂对草地贪夜蛾4龄幼虫的毒力测定结果

对草地贪夜蛾4龄幼虫药剂的诊断剂量：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐为0.76mg/l，高效氯氟氰菊酯为45.07mg/l，虫螨腈为22.68mg/l，茚虫威为48.33mg/l，氯虫苯甲酰胺为12.56mg/l，虱螨脲为31.31mg/l。

进一步的，根据以上毒力测定结果，本发明的草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒中还提供了草地贪夜蛾敏感品系的杀虫剂剂量-龄期-活性关系表，如下表5：

表5草地贪夜蛾敏感品系的杀虫剂剂量-龄期-活性关系表

注：田间种群死亡率小于95％即为产生抗性。

实施例3

一种草地贪夜蛾抗药性快速鉴定试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：

将草地贪夜蛾饲料和实施例1所述的专用饲料瓶分别灭菌；

饲料在室温条件下放置至温度降至50℃以下后，于超净工作台上按剂量加入杀虫剂，持续搅拌均匀后，倒入已消毒的专用饲料瓶的透明瓶身中，厚度控制为0.5-1cm；

盖上盖子，并待饲料冷却至室温后，做好标记，用灭菌后的密封袋密封好；

放置于冰箱中冷藏。

实施例4

采用实施例2的试剂盒快速鉴定田间草地贪夜蛾抗药性，具体方法如下：

被测试草地贪夜蛾种群为：广州市增城区种群、广州市白云区种群、广东省惠州市种群、广东省中山市种群、广东省江门市种群、广东省珠海市种群。

将田间草地贪夜蛾种群的不同龄期幼虫分别挑入试剂盒中相对应的诊断饲料瓶中，1龄虫和2龄幼虫每个诊断饲料瓶处理10头，重复4次；3龄、4龄幼虫每个诊断饲料瓶处理幼虫1头，重复30次；在瓶口盖上一层灭菌后的厨房纸巾，再盖上瓶盖。高效氯氟氰菊酯在药剂处理后24h检查幼虫死亡数，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、虫螨腈、茚虫威、氯虫苯甲酰胺和虱螨脲均在药剂处理后72h检查幼虫死亡数。死亡率小于95％的种群为抗性种群。鉴定结果如下表6：

表66种药剂的诊断饲料瓶的抗性诊断

注：表格中数据后面标注有*的为具有抗药性。

采用本发明的试剂盒诊断草地贪夜蛾的抗药性，用虫量少，能够简便快速地检测田间种群抗药性。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应局限于该实施例和附图所公开的内容，所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。