一种多巴丝肼复方制剂中苄丝肼杂质A的分析方法与流程

本发明属于药物分析检测领域，具体涉及一种hplc检测多巴丝肼复方制剂中苄丝肼杂质a(2rs)-2-氨基-3-羟丙酰肼的分析方法。
背景技术：
：原研公司rocheholdingag制备的多巴丝肼复方片剂，商品名为madopar(美多巴)，由左旋多巴及盐酸苄丝肼组成，是治疗帕金森或帕金森综合症(脑炎后、动脉硬化性或中毒性)的药物。此药能增加多巴胺在脑部细胞的含量，改善帕金森症状。同时苄丝肼可以阻止多巴脱羧酶在左旋多巴未进入大脑内之前被转化成多巴胺，藉此增加脑内多巴胺，增强其疗效并减少其外周不良反应。多巴丝肼复方制剂作为治疗帕金森病或帕金森综合症的一线药物，临床实践显示可获得良好的疗效，与大剂量的左旋多巴效果一样，且耐受性则要好得多。长期服用，帕金森综合症的症状均有显著好转。多巴丝肼结构式如下所示：但是，在对多巴丝肼复方制剂稳定性及杂质分析研究时发现，盐酸苄丝肼对光和湿都不稳定，会产生3个主要降解杂质，即苄丝肼杂质a：(2rs)-2-氨基-3-羟丙酰肼、苄丝肼杂质b：(2rs)-2-氨基-3-羟基-n,n-二(2,3,4-三羟基苄基)丙烷酰肼、苄丝肼杂质c：(2rs)-2-氨基-3-羟基-n'-[(ez)-(2,3,4-三羟基苯基)亚甲基]丙酰肼，并有增长趋势。然而，现有的hplc检测多巴丝肼复方制剂中苄丝肼杂质a的方法，使用普通的c18等液相色谱柱，这些方法低浓度灵敏度小，响应小，辅料干扰大，导致准确度低，回收率不符合要求，且在后续样品检测过程中发现苄丝肼杂质a含量检测偏低，从而造成质量问题。因此，为了更好地控制多巴丝肼复方制剂的产品质量，严格控制苄丝肼杂质a的含量，需要开发一个合适的方法提高检测能力。技术实现要素：本发明提供了一种检测多巴丝肼复方制剂中苄丝肼杂质a含量的方法，该方法专属性高，耐用性好、干扰杂质少，为多巴丝肼复方制剂中苄丝肼杂质a质量控制及临床的用药安全提供参考。该方法包括以下步骤：(1)色谱条件如下：色谱柱：选自三官能团c18烷基键合硅胶或b型超高纯全多孔球形硅胶填充的亲水基色谱柱；柱温：30℃；流动相a：庚烷磺酸钠和磷酸二氢钾至水中溶解，并用氢氧化钠或磷酸调ph至2.0到7.0；流动相b：甲醇；检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；洗脱方式：梯度洗脱；(2)供试品溶液制备：将多巴丝肼复方制剂溶解于稀释液中以制备供试品溶液；(3)测定方法：将步骤(2)中制备得到的供试品溶液注入液相色谱仪，并按照所述步骤(1)中的色谱条件对供试品溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图。进一步的所述步骤(1)中流动相a中的庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾和水的比例为1～3g:5～7g:1l，优选2.2g:6.8g:1l。进一步的所述步骤(1)中洗脱方式是先用流动相a洗脱10～20min，然后用流动相a和流动相b梯度洗脱15～30min。进一步的所述步骤(1)中色谱条件如下：色谱柱：ultimateaqc18或watersatlantict3；柱温：30℃；流动相a：2.2g庚烷磺酸钠+6.8g磷酸二氢钾至1l水中，并用氢氧化钠或磷酸调ph至2.0到7.0；流速：1.0ml/min；洗脱方式：先用流动相a洗脱15min，然后用流动相a和流动相b梯度洗脱20min。进一步的所述步骤(1)中检测波长所用检测器选自紫外检测器(uvdetector)。进一步的所述步骤(2)中稀释液选自：有机溶剂，或水与有机溶剂混合溶剂。更进一步的所述步骤(2)中稀释液选自：甲醇或甲醇与水的混合溶剂。进一步所述步骤(2)多巴丝肼复方制剂为片剂或胶囊剂。进一步所述步骤(2)中供试品溶液制备步骤如下：将多巴丝肼复方制剂用稀释液溶解并定容，配制成1ml体积中含苄丝肼2.5mg的溶液。进一步所述步骤(3)中供试品溶液进样量为10μl。本发明与已有技术相比的积极效果在于，本发明能快速有效且精确地检测出多巴丝肼复方制剂中苄丝肼杂质a的含量，分离效果好，操作简单，回收率高，方法灵敏度高，线性范围宽。在合成和制剂过程的质量控制方面具有重要的现实意义。附图说明图1为对照实施例1多巴丝肼片样品溶液hplc检测结果图。图2为空白溶液hplc检测结果图。图3为实施例1系统适用性hplc检测结果图。图4为实施例1杂质定位图图5为实施例1杂质定位图。图6为实施例1多巴丝肼片样品溶液hplc检测结果图。图7为实施例2准确度溶液hplc检测结果图。图8为实施例2系统适用性hplc检测结果图。图9为实施例3准确度溶液hplc检测结果图。图10为实施例3系统适用性hplc检测结果图。图11为实施例4准确度溶液hplc检测结果图。图12为实施例4系统适用性hplc检测结果图。具体实施方式对照品信息：供试品信息：名称批号来源多巴丝肼片r141520001华海多巴丝肼片空白辅料2001-330115华海对比实施例1(根据ep9.0收录的盐酸苄丝肼api检测方法)色谱条件：仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器色谱柱：lichrospherr60rpselectb4.6*250mm5μm流动相a：2.2g庚烷磺酸钠一水合物和6.8g磷酸二氢钾→900ml水，加50ml甲醇，用磷酸调ph至3.5±0.05。流动相b：2.2g庚烷磺酸钠一水合物和6.8g磷酸二氢钾→500ml水，用磷酸调ph至3.5±0.05，加500ml甲醇。稀释液：甲醇检测波长：210nm流速：1.3ml/min进样体积：5μl柱温：30℃样品室温度：5℃运行时间：25min供试品溶液：称取20片供试品，磨粉取1350mg，精密称定于50ml容量瓶中，加稀释液至2/3处振摇15min溶解，并稀释至刻度，混匀，离心取上清液转移至液相进样小瓶中，hplc方法检测苄丝肼杂质a。色谱图结果见图1。准确度溶液的配制：苄丝肼杂质a储备液配制：称取苄丝肼杂质a对照品12.574mg至50ml量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀。表1-1准确度溶液的配制精密量取表1-1中溶液10μl，按上述检测条件进行检测分析，结果见表1-2。表1-2准确度验证结果从上述图1结果可以看出，左旋多巴出峰时间在4.53min，苄丝肼杂质a出峰在4.95min，响应弱，测得的供试品中苄丝肼杂质a的含量为0.09％；比使用本发明的检测方法测得的含量低。表1-2的结果表明，在准确度试验中，准确度溶液(0.1％)平均回收率为48.6％，达不到药典规定的要求。实施例1色谱条件：仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器色谱柱：ultimateaqc184.6*250mm5μm(填料：b型超高纯全多孔球形硅胶填料)流动相a：2.2g庚烷磺酸钠+6.8g磷酸二氢钾至1l水中，用5m氢氧化钠调ph＝6.0流动相b：甲醇检测波长：210nm流速：1.0ml/min进样体积：10μl柱温：30℃样品室温度：4℃运行时间：60min时间/min流动相a/％流动相b/％0-15100015-35100→300→70稀释液：70％甲醇空白溶液配制：同稀释液。线性溶液1：称取适量的苄丝肼杂质a对照品，用稀释剂稀释至苄丝肼杂质a浓度分别为：1.25、2.5、25、50、75微克/ml，振摇至完全溶解后用hplc方法检测。计算得到回归系数(r2)＝1.0000。分离度溶液(系统适应性溶液)：称取苄丝肼杂质a对照品25mg至100ml量瓶，左旋多巴杂质b对照品称取约1.6mg至50ml量瓶，分别用稀释液溶解定容作为储备液溶液。称取左旋多巴约500mg至50ml量瓶中，并移取苄丝肼杂质a储备液5ml，左旋多巴杂质b储备液5ml至同一50ml量瓶中，加稀释液定容，作为系统适用性溶液。按上述检测条件进行检测分析，空白溶液及系统适应性溶液的进样结果见图2和图3。图3中各组分的出峰顺序分别其中左旋多巴、苄丝肼杂质a、左旋多巴杂质b，出峰时间依次为6.212min，7.595min，8.431min，他们的分离度分别为3.14，2.09，各色谱参数均符合要求。苄丝肼杂质a准确度储备液配制：称取苄丝肼杂质a对照品25.86mg至100ml量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀，作为准确度中间储备液。表2-1准确度溶液的配制精密量取表1-1中溶液10μl，按上述检测条件进行检测分析，结果见表2-2。表2-2准确度验证结果表2-2显示2.5μg/ml准确度溶液1的回收率为85.5％；50μg/ml准确度溶液2的回收率为95.8％；75μg/ml准确度溶液3的回收率为96.6％，均符合80-120％规定范围。表明本发明所属的分析方法能有效分离出苄丝肼杂质a、左旋多巴杂质b和左旋多巴，分离度高，响应值高，专属性强，能有效、准确地分离出复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a，本法适合复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a的检测。供试品溶液的配制：称取10片供试品，磨粉取1350mg，精密称定于50ml容量瓶中，加稀释液至2/3处振摇10min溶解，并稀释至刻度，混匀，离心取上清液转移至液相进样小瓶中，按照上述的hplc条件进行检测。各杂质定位见图4，图5，其中各杂质的出峰时间如：左旋多巴杂质a：5.325min，左旋多巴双甲氧基：25.182min，苄丝肼杂质b：31.610min，苄丝肼杂质c：28.846min。图6为供试品检测结果色谱图。从图6中我们可以看出，左旋多巴和苄丝肼杂质a能很好的分开，并且不受辅料干扰，灵敏度高，其中供试品中不含左旋多巴杂质b，测得样品中苄丝肼杂质a含量为0.39％。，表明该法能准确地分离出并检测出复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a的含量。实施例2色谱条件：改变流动相a中的ph，用5m氢氧化钠调ph＝7.0，其他条件均不变。稀释液：70％甲醇分离度溶液(系统适应性溶液)：取实施例1的分离度溶液按上述检测条件进行检测分析，系统适应性色谱图见图8。图8中各组分的出峰顺序分别其中左旋多巴、苄丝肼杂质a、左旋多巴杂质b，出峰时间依次为5.988min，4.686min，8.195min，他们的分离度分别为2.78，3.88，各色谱参数均符合要求。准确度(0.1％)溶液：称取左旋多巴1000mg，空白辅料1698mg至100ml量瓶中，精密量取苄丝肼杂质a准确度储备液1ml至同一量瓶中，加稀释液至2/3量瓶体积，振摇10min，加稀释液定容，离心取上清液并转移至液相进样小瓶中，其中回收率为103.0％。检测结果的hplc图谱见图7。从图7可以看出，改变ph值，0.1％准确度溶液回收率也是符合要求，表明本发明所属的分析方法能有效分离出苄丝肼杂质a、左旋多巴杂质b和左旋多巴，分离度高，响应值高，专属性强，能有效、准确地分离出复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a，本法适合复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a的检测。实施例3色谱条件：改变流动相a中的ph，用磷酸调ph＝2.0，其他条件均不变。稀释液：70％甲醇分离度溶液(系统适应性溶液)：取实施例1的分离度溶液按上述检测条件进行检测分析，系统适应性色谱图见图10。图10中各组分的出峰顺序分别其中左旋多巴、苄丝肼杂质a、左旋多巴杂质b，出峰时间依次为29.710min,30.141min,30.722min，他们的分离度分别为2.35，3.38，各色谱参数均符合要求。准确度(0.1％)溶液：称取左旋多巴1000mg，空白辅料1698mg至100ml量瓶中，精密量取苄丝肼杂质a准确度储备液1ml至同一量瓶中，加稀释液至2/3量瓶体积，振摇10min，加稀释液定容，离心取上清液并转移至液相进样小瓶中，其中回收率为82.0％。检测结果的hplc图谱见图9。从图9可以看出，改变ph值，0.1％准确度溶液回收率也是符合要求，表明本发明所属的分析方法能有效分离出苄丝肼杂质a、左旋多巴杂质b和左旋多巴，分离度高，响应值高，专属性强，能有效、准确地分离出复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a，本法适合复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a的检测。实施例4色谱条件：其他色谱条件均同实施例1，只将色谱柱更改为watersatlantict3,250mm*4.6mm；5.0μm(填料：三官能团c18烷基键合硅胶)稀释液：70％甲醇分离度溶液(系统适应性溶液)：取实施例1的分离度溶液按上述检测条件进行检测分析，系统适应性色谱图见图12。图12中各组分的出峰顺序分别其中左旋多巴、苄丝肼杂质a、左旋多巴杂质b，出峰时间依次为6.493min，7.631min，9.158min，他们的分离度分别为2.48，3.61，各色谱参数均符合要求。准确度(0.1％)溶液：称取左旋多巴1000mg，空白辅料1698mg至100ml量瓶中，精密量取苄丝肼杂质a准确度储备液1ml至同一量瓶中，加稀释液至2/3量瓶体积，振摇10min，加稀释液定容，离心取上清液并转移至液相进样小瓶中，其中回收率为84.3％。检测结果的hplc图谱见图11。从图11可以看出，更换色谱柱，其他色谱条件均不改变，0.1％准确度溶液回收率也是符合要求，表明本发明所属的分析方法能有效分离出苄丝肼杂质a、左旋多巴杂质b和左旋多巴，分离度高，响应值高，专属性强，能有效、准确地分离出复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a，本法适合复方多巴丝肼片中苄丝肼杂质a的检测。上述仅对本发明的优选实施例做了详细说明，本发明不限于上述实施例，任何对本发明的变换和变型都归属本发明的保护范围。当前第1页12