一种测定烟草中总黄酮含量的方法与流程

本发明属于烟草理化指标检测技术领域，具体是涉及一种利用间断化学分析仪对烟草中总黄酮含量进行快速准确测定的方法。

背景技术：

烟草作为我国重要的经济作物，近年来，随着中国签署《烟草控制框架公约》，意味着烟草的发展空间受到了很大的限制，使得生产优质烟叶，降低有害成分，提高烟草产品的品质，成为现阶段一个重要的课题。烟草的生长发育和烟叶的品质受温度、海拔、光照、土壤、水分等多种因素的影响，目前黄酮类化合物已被证实是影响烟草品质重要的潜香型物质，其代谢受多种因素调控。因此研究黄酮类化合物代谢途径及其调节机制对提高烟叶品质具有重要意义，故烟草中总黄酮含量的准确测定显得极其重要。

已报道用于总黄酮化合物含量测定的方法主要为高效液相色谱法，但该方法使用的设备昂贵、检测成本高、检测周期长，而且需要专业人士操作，因此难以普及。

全自动间断化学分析仪是一种能自动添加显示剂和比色的微型反应分析设备，其自动化程度高，测定分析速度快，设备便宜、维护成本低，可满足大批量样品测定的需要。目前已经应用于氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐等领域指标的测定，但还未见有运用间断化学分析仪测定烟草中总黄酮含量的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种快速、简便、精确度高的测定烟草中总黄酮含量的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。

一种测定烟草中总黄酮含量的方法，具体采用以下步骤：

(1)准确称取1.0g烟末置于150ml具塞三角瓶中，加入80％乙醇溶液100ml，摇匀后盖紧塞子放在振摇器上，以150r/min振荡萃取30min，用定性滤纸过滤萃取液，收集滤液作为样品溶液备用；

(2)全自动间断化学分析仪分析：

①配制显色剂：称取亚硝酸钠10.00g，硝酸铝25.00g，用800ml去离子水溶解，然后定容至1000ml；

②配制氢氧化钠溶液：称取40.00g氢氧化钠溶于800ml去离子水中，然后定容至1000ml；

③仪器参数设置：检测波长：510nm；样品溶液及反应试剂加入量：样品溶液为120μl，显色剂为180μl，氢氧化钠溶液为160μl；反应时间：取样针依次吸入样品溶液和显色剂至比色池内，36s后再移取氢氧化钠溶液至比色池内，再反应256s后测定吸光度；样品溶液稀释：自动稀释模式；

④上机分析：将样品溶液移入间断化学分析仪样品盘，分别将显色剂和氢氧化钠溶液放入间断化学分析仪的试剂槽中，编制样品运行表，按设定的仪器参数自动添加各试液，顺序运行并测定；

(3)绘制标准工作曲线：准确称取0.200g芦丁于200ml乙醇中混合均匀，再用去离子水定容至1000ml，得到含量为200mg/l的总黄酮标准工作液；设置间断化学分析仪的自动稀释倍数至标准工作液浓度点分别为20、60、100、140、180和200mg/l，将总黄酮标准工作液加入间断化学分析仪母液盘后，仪器按设置的自动稀释倍数稀释标准曲线各浓度点并测试，得到标准工作曲线方程为：y＝0.0023x+0.0051，相关系数r²＝0.9991；

(4)结果计算：

将待测烟末样品溶液所对应的总黄酮仪器测定值代入公式(1)计算，得到待测烟末中的总黄酮含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果；

式中：p—待测烟末中的总黄酮含量(mg/g)，c—样品溶液所对应的总黄酮仪器测定值(mg/l)，v—萃取液体积(ml)，m—烟末样品质量(g)。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

本发明首次将间断化学分析仪应用于烟草中总黄酮含量的测定。该方法的回收率在96.25％～102.6％之间；2个样品在不同时间、不同批次检测的变异系数均小于5％；该方法的检出限和定量限分别为0.011mg/g和0.037mg/g。该方法操作简便、分析速度快，重复性、稳定性和准确性均较好，具有良好的应用前景。

附图说明

图1萃取液浓度的影响；

图2萃取振荡时间的影响；

图3显色剂加入量的影响；

图4氢氧化钠溶液加入量的影响；

图5标准工作曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。

实施例1

1.实验原理、材料和方法

1.1实验原理

黄酮中相邻羰基、羟基与亚硝酸钠-硝酸铝发生金属络合反应，生成的络合产物在510nm处有吸收，采用间断化学分析仪，通过监测510nm处吸光度的变化，对照标准工作曲线，便可计算得到总黄酮含量。

1.2材料与仪器

芦丁(标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；九水硝酸铝(ar，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；亚硝酸钠(ar，国药集团化学试剂有限公司)；氢氧化钠(ar，国药集团化学试剂有限公司)；5个烟末样品均来自云南省烟草质量监督检测站。

metlerae200分析天平(感量：0.0001g，瑞士metlertoledo公司)；smartchem200全自动间断化学分析仪(法国alliance公司)；ja5002天平(感量0.01g，上海天平仪器厂)；hs501往复振荡器(上海化科实验器材有限公司)；milliporeaquelix5纯水机(美国merckmillipore公司)。

1.3样品处理与分析

准确称取1.0g烟末置于150ml具塞三角瓶中，加入80％乙醇溶液100ml，摇匀后盖紧塞子放在振摇器上，以150r/min振荡萃取30min，用定性滤纸过滤萃取液，收集滤液作为样品溶液备用；

用全自动间断化学分析仪分析：

配制显色剂r1：称取亚硝酸钠10.00g，硝酸铝25.00g，用800ml去离子水溶解，然后定容至1000ml。

配制氢氧化钠溶液r2：称取40.00g氢氧化钠溶于800ml蒸馏水中，然后定容至1000ml；

仪器参数设置：检测波长：510nm；样品溶液及反应试剂加入量：样品溶液为120μl；显色剂r1为180μl；氢氧化钠溶液r2为160μl；分析过程及时间设置：取样针依次吸入样品溶液和显色剂r1至比色池内，36s后再移取氢氧化钠溶液r2至比色池内，最后反应256s后测定吸光度；样品溶液稀释：自动稀释模式；

上机分析：将样品溶液移入间断化学分析仪样品盘，同时将r1和r2放入分析仪的试剂槽中，编制样品运行表，分析仪按设定的仪器参数自动添加各试液，顺序运行并测定。

绘制标准工作曲线：准确称取0.200g芦丁于200ml乙醇中混合均匀，再用去离子水定容至1000ml，得到含量为200mg/l的总黄酮标准工作液；设置间断化学分析仪的自动稀释倍数(对应的标准工作液浓度点分别为20、60、100、140、180和200mg/l)，将总黄酮标准工作液加入间断化学分析仪母液盘后，仪器按设置的自动稀释倍数稀释标准曲线各浓度点并测试，得到标准工作曲线方程为：y＝0.0023x+0.0051，相关系数r²＝0.9991；

结果计算：将待测烟末样品溶液所对应的总黄酮仪器测定值，代入公式(1)计算，得到待测烟末样品中的总黄酮含量，并以两次平行测定的平均值作为最终的测定结果；数值按照gb/t8170进行修约，精确至0.01mg/g。两次平行测量结果的相对平均偏差应小于5％。

式中：p—待测烟末中的总黄酮含量(mg/g)，c—样品溶液所对应的总黄酮仪器测定值(mg/l)，v—萃取液体积(ml)，m—烟末样品质量(g)。

2结果与讨论

2.1前处理条件优化

2.1.1萃取液浓度的优化

黄酮一般易溶于乙醇和甲醇等极性较强的溶剂中，考虑到甲醇有毒，因此实验选择乙醇作为萃取溶剂。实验配制了50％、60％、70％、80％和90％的乙醇水溶液作萃取溶剂，取1#样品，按照1.3部分进行样品处理和分析，测得其吸光度。图1表明：随着乙醇浓度增加，吸光度值逐渐变大，说明总黄酮的萃取效率随着乙醇浓度的增加而升高，但当乙醇浓度达80％时，吸光度值不再增加，说明此条件下，样品中的总黄酮萃取完全，故萃取液乙醇浓度选择为80％。

2.1.2萃取振荡时间的影响

取1#样品，按照1.3部分进行样品处理，仅更改振荡时间，考察其对样品溶液吸光度值的影响。从图2可知：随着振荡时间的增加，总黄酮逐渐被从样品中萃取出来，当振荡时间为30min以内时，随着振荡时间的增加，吸光度值逐步升高，大于30min后响应值趋于稳定，说明样品中的甲总黄酮被萃取完全，考虑到样品检测效率，振荡时间确定为30min。

2.2仪器测定条件的优化

2.2.1显色剂r1加入量的确定

取总黄酮标准工作液(100mg/l)120μl，加160μl氢氧化钠溶液r2，改变显色剂r1加入量，测定吸光度，结果见图3。试剂r1加入量达到180μl时，吸光度基本稳定。因此，选取显色剂r1加入量为180μl。

2.2.2氢氧化钠溶液r2加入量的确定

取总黄酮标准工作液(100mg/l)120μl，加180μl显色剂r1，改变氢氧化钠溶液r2的加入量，测定吸光度，结果见图4。试剂r2加入量达到160μl时，吸光度基本稳定。因此，选取氢氧化钠溶液r2加入量为160μl。

2.2.3工作站的设置

smartchem200全自动间断化学分析仪测定条件见表1。

表1仪器设置条件

2.3标准曲线的绘制

在样品管内加入200mg/l的总黄酮标准工作液，设置间断化学分析仪的自动稀释倍数(对应的标准工作液浓度点分别为20、60、100、140、180和200mg/l)，在表1的测定条件下绘制标准工作曲线，结果如图5。结果表明，总黄酮含量的吸光度(y)对总黄酮浓度(x)绘制标准工作曲线，总黄酮浓度在0～200mg/l之间呈良好的一次线性关系。回归方程y＝0.0023x+0.0051，相关系数r²＝0.9991。

2.4方法评价

2.4.1检出限和定量限

采用最低杯标准溶液，连续进样10次，测定结果的标准偏差为0.0037mg/g，因此方法的检出限为3sd＝0.011mg/g，定量限为10sd＝0.037mg/g。

2.4.2重复性

对2个烟末样品由同一操作员按照本发明方法，在同一时间段内分别平行测定3次，结果见表2。由表2可知，本方法测定总黄酮含量的rsd值分别为3.55％和1.45％，均小于5％，重复性较好。

表2重复性

2.4.3稳定性

对2个烟末样品由同一操作员按照本发明方法，分别在不同时间段内测定3次，每次平行测定2次取平均值，结果见表3。由表3可知，本方法测定总黄酮含量的rsd值分别为1.79％和1.12％，均小于15％，稳定性较好。

表3稳定性

2.4.4实际样品分析及加标回收率

用本发明方法对5个烟末样品的加标回收率平行测定3次，结果在96.25％到102.6％之间(表4)。说明该发明方法的准确性良好，检测结果可靠。

表4样品测定及加标回收率

3.结论

本发明利用间断化学分析仪测定烟草中总黄酮的含量，操作简便、结果准确、精密度高，该方法能为黄酮类化合物代谢途径及其调节机制研究提供强有力的工具。