一种从液体硅胶中快速提取孕激素的方法及检测方法与流程

本申请属于孕激素产品质量控制领域，具体涉及一种孕激素快速提取方法及提取试剂盒和孕激素快速检测方法。

背景技术：

孕激素，最常见的为黄体酮，其主要的的靶器官为生殖器官。孕酮在雌性动物中主要作用于子宫内膜，一方面刺激并维持子宫内膜和子宫腺的增长，另一方面降低子宫内膜上孕酮、雌二醇和ot(缩宫素)三种激素的受体水平。孕酮抑制子宫雌二醇和ot受体，使子宫处于静止状态；孕酮抑制子宫上自身受体，使得孕酮对子宫的上述作用随着黄体期的持续而逐渐下降。

孕激素在畜牧业中的一个作用是用于母畜的同期发情(为什么要进行同期发情？在自然情况下，雌性动物在繁殖季节里出现的发情是随机的、零散的。所谓的同期发情(sychronizationofestrus)，就是采用激素或类激素的药物处理，使一群母畜在特定的时间内集中发情和排卵。这一技术目前已经广泛地应用于母牛、母猪的批次化生产中，是家畜繁殖中最重要的技术)，该技术自20世纪60年代诞生以来，衍生出了很多方法，主要原理是应用孕激素及其类似物，经口服、皮下注射、埋植、阴道栓等方法，停药后2～6天药物抑制卵巢的作用消失，母畜便能同期发情。在停用孕激素后也可以配合注射促性腺激素或雌激素，以促使被处理母畜发情表现明显，达到排卵的目的。

而孕激素类兽药产品中以孕激素阴道缓释剂的技术含量最高(研制难度，生产难度，检测难度)，其主要借助于硅胶这种基质，将孕激素与硅胶(液体硅胶)按照一定比例混合后，采用模制成型工艺生产出来。这一类产品通常放置于阴道或埋植使用，使用期间，孕激素或类似物可以从硅胶层中缓慢释放(按照特定的释放速率)出来，从而发挥药效(人工模拟黄体期。即抑制母畜发情)，孕激素撤出或停用后，抑制作用消失，母畜便又出现发情(卵巢上的卵泡同时也发育成熟到排卵)。

同期发情技术中的孕激素产品，特别是孕激素硅胶缓慢释放装置(缓释剂)在生产期间，涉及到产品质量控制环节(液体硅胶(高粘度，水的粘度为1cps)与孕激素按照一定的比例混合，如何检测液体硅胶中的孕激素是否混合均匀，如何快速准确地检测液体硅胶中孕激素的准确含量，是一直以来存在的问题(如果孕激素在硅胶中无法混合均匀，则采用模制成型出来的产品含量均匀度无法保证，会出现部分产品含量超过上限，部分产品含量低于下限，以及批次间产品差异较大，临床实用中，药效不稳定，无法重复等问题))。

如中国发明专利申请(申请号:cn201711083232.8)公开了一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法，该方法包括以下步骤：1)水样预处理；2)新型固相萃取吸附剂oasisprimehlb富集浓缩；3)uplc-ms/ms测定孕激素浓度；4)标准曲线的绘制及上机测定，采用新型固相萃取吸附剂oasisprimehlb作为环境水样的预处理技术，并且以超高液相-质谱连用仪为检测定量工具，同时测定了水环境中11种不同孕激素。

上述的方法可以高选择性和高灵敏度结合孕激素，但是该方法操作复杂。如果可以直接快速提取并检测液体硅胶中孕激素的含量，这样方法操作简单，回收率高，也能适合一般的实验室检测。

技术实现要素：

为了解决加有孕激素的液体硅胶中孕激素含量的快速准确定性、定量的难题，本申请提供了一种孕激素快速提取方法，该方法操作简单，回收率高，无高危操作环节，适合一般的实验室检测。

为了解决上述的技术问题，本申请采用了以下的技术方案：

一种孕激素快速提取方法，该方法取混合了孕激素的液体硅胶加入到硅油提取试剂中，硅油提取试剂的粘度为10-100cps，使其充分溶解，然后使用高速离心机离心，弃去上清液，获得孕激素沉淀物。

作为优选，所述的硅油提取试剂至少采用粘度为1-50cps的硅油和粘度为100-500cps的硅油混合构成。

作为优选，所述的硅油提取试剂采用甲基硅油、乙基硅油、苯基硅油、甲基含氢硅油、甲基苯基硅油、甲基氯苯基硅油、甲基乙氧基硅油、甲基三氟丙基硅油、甲基乙烯基硅油、甲基羟基硅油、乙基含氢硅油、羟基含氢硅油中的一种或多种混合。

作为优选，所述的硅油提取试剂采用两种不同粘度的二甲基硅油混合制得。

作为优选，所述的离心的条件：-10-35℃，10000-15000r/min，离心5-20分钟。

作为优选，所述的孕激素包括黄体酮，醋酸氟孕酮，四烯雌酮，醋酸甲羟孕酮，醋酸美仑孕酮和左炔诺孕酮中的一种或多种。

一种孕激素快速检测方法，该方法将所述的方法提取的孕激素用无水乙醇稀释溶解完全后定容体积，即可定性、定量检测液体硅胶中的孕激素。

优选，采用hplc外标法进行检测。

作为优选，所述的硅油提取试剂采用至少采用粘度为1-50cps的硅油和粘度为100-500cps的硅油混合构成。

作为优选，所述的硅油提取试剂采用甲基硅油、乙基硅油、苯基硅油、甲基含氢硅油、甲基苯基硅油、甲基氯苯基硅油、甲基乙氧基硅油、甲基三氟丙基硅油、甲基乙烯基硅油、甲基羟基硅油、乙基含氢硅油、羟基含氢硅油中的一种或多种混合。

作为优选，所述的硅油提取试剂采用两种不同粘度的二甲基硅油混合制得。

作为优选，所述的孕激素包括黄体酮，醋酸氟孕酮，四烯雌酮，醋酸甲羟孕酮，醋酸美仑孕酮和左炔诺孕酮中的一种或多种。

本申请采用孕激素不溶于硅油提取试剂，出现沉淀，而液体硅胶可以溶解于硅油提取试剂中，这样使液体硅胶中的孕激素完全分散沉淀出来，然后通过高速离心，即可使孕激素在离心管中形成沉淀物，硅油提取试剂与液体硅胶形成的澄清溶液混合物为上清液，离心结束后，弃去上清液，保留沉淀物。然后将孕激素溶于无水乙醇中，形成孕激素-乙醇溶液，最后将该溶液稀释-定容到一定体积，采用hplc外标法进行测定即得。

本申请的有益效果在于：所述、提取方法和检测方法可以用于快速提取和检测液体硅胶中孕激素，用于定性、定量液体硅胶中的孕激素，确保了孕激素产品质量稳定性。

附图说明

图1为黄体酮对照品含量色谱图。

图2为液体硅胶a组分中黄体酮含量色谱图。

图3为液体硅胶b组分中黄体酮含量色谱图。

图4为黄体酮对照品滤液a液中黄体酮含量色谱图。

图5黄体酮对照品滤液b液中黄体酮含量色谱图。

图6方法学验证——标准曲线。

具体实施方式

为了进一步了解本申请的技术特征，下面结合具体实施例对本申请进行详细地阐述。实施例只对本申请具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本申请的基础上作出的任何非实质性的修改，都应属于本申请的保护范围。

实施例1黄体酮-液体硅胶混合物中黄体酮的快速提取

取混合有10％(w/w)左右黄体酮的液体硅胶(dowcorning,q7-4840)a、b组分各1g，置50ml离心管中，加硅油提取试剂(10cps二甲基硅油：200cps二甲基硅油，v/v＝4:1)10ml，于35℃超声溶解，冷却；放置于高速离心机中(预先配平，±0.5％)，转速12000rmp下离心10分钟；弃上清液，沉淀物即黄体酮。整个提取过程耗时20～30min。

实施例2黄体酮-液体硅胶混合物中黄体酮的hplc外标法检测

将实施例1中提取出的黄体酮(沉淀物)加无水乙醇30ml，超声溶解；将溶液移至100ml量瓶中，用乙醇洗涤离心管5次，将此溶液并入量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过。

hplc检测条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-甲醇(25:75)为流动相；流速为每分钟1.0ml：柱温35℃；检测波长为254nm。

精密量取滤液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取黄体酮工作标准品约100mg，精密称定，置100ml量瓶中，加乙醇30ml，超声处理5分钟，再加乙醇稀释至刻度，摇匀，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得液体硅胶中黄体酮的含量。结果如图1～图3所示。实施例3

精密称取约0.1g黄体酮对照品，加入到10ml硅油提取试剂(10cps二甲基硅油：200cps二甲基硅油，v/v＝4:1)中，搅拌，超声处理，然后置于高速离心机中，于12000r/分钟，离心10分钟，分离上清液置于烧杯中备用，将沉淀物用30ml无水乙醇溶解，稀释至100ml，过滤，将滤液标记为a液，另取5ml上清液，用无水乙醇稀释至100ml，过滤，将滤液标记为b液。将a液与b液，分别采用实例2中的hplc检测条件进行检测。检测结果如图4～图5所示。

实施例4方法验证

1)线性(如图6所示)。

2)准确度(回收率)，利用含已知量被测物的各组分混合物进行测定，结果如图表1所示。

表1重复性(中间精密度)结果

3)重复性(中间精密度)，不同分析人员甲、乙、丙采用实例1中的提取方法和实例2中的检测方法检测的结果表2所示。

表2重复性(中间精密度)结果

对比例1

取混合有10％(w/w)左右黄体酮的液体硅胶(dowcorning,q7-4840)a、b组分各1g，置50ml离心管中，加正己烷溶液30ml，于35℃超声溶解，冷却；放置于高速离心机中(预先配平，±0.5％)，转速12000rmp下离心10分钟；弃上清液，得沉淀物。

将上述沉淀物参照实例2进行检测分析，结果显示，整个试验提取环节耗时约5小时，液体硅胶a组分与b组分中回收率低于70％，回收率较差。

比对例2

取混合有10％(w/w)左右黄体酮的液体硅胶(dowcorning,q7-4840)a、b组分各1g，分别置于50ml离心管中，加粘度为5cps的硅油溶液10ml，于35℃超声溶解，冷却；放置于高速离心机中(预先配平，±0.5％)，转速12000rmp下离心10分钟；弃上清液，得沉淀物。

将上述沉淀物参照实例2进行检测分析，结果显示，整个试验提取环节耗时约2小时，液体硅胶a组分与b组分中黄体酮的回收率分比为84.6％和86.9％，回收率低于90％，且耗时较长。

比对例3

取混合有10％(w/w)左右黄体酮的液体硅胶(dowcorning,q7-4840)a、b组分各1g，分别置于50ml离心管中，加粘度为350cps的硅油溶液10ml，于35℃超声溶解，冷却；放置于高速离心机中(预先配平，±0.5％)，转速12000rmp下离心10分钟；分离上清液(上清液较粘稠，澄清度较差)，得沉淀物。

将上述沉淀物参照实例2进行检测分析，结果显示，整个试验提取环节耗时约1小时，液体硅胶a组分与b组分中黄体酮的回收率分比为77.2％和75.3％，回收率低于80％；另外参照实例2中方法检测上清液，结果显示，上清液中含有约20％的黄体酮。在此方法中，由于粘度较大，导致高速离心无法将硅油中黄体酮完全离心，因此导致回收率较差，无法满足要求。