一种肝细胞癌PDX模型构建方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种肝细胞癌pdx模型构建方法。
背景技术：
：pdx(patient-derivedxenograft)患者来源肿瘤异种移植模型，是指将患者新鲜的肿瘤组织种植到免疫缺陷小鼠体内，从而获得生长。pdx模型的特点是在最大程度上保留了患者肿瘤的形态与结构特征、基因特征以及分子特征，可以为研究肿瘤生物学、寻找标志物与筛选药物靶点提供一个重要的平台。pdx模型能够准确反应抗肿瘤药物疗效，为临床肿瘤患者的个体化精准治疗提供重要的用药建议和指导。我国是肝癌高发大国，其中90％的肝癌是肝细胞癌，位于中国60岁以下男性恶性肿瘤的首位。肝细胞癌患者5年生存率不足20％，即便手术切除仍有50％-70％的患者出现肿瘤复发，建立pdx模型进行敏感药物的筛选可以为患者提供可靠有效的治疗策略。比如，公开号为cn105684989a的发明专利申请公开了一种肝癌pdx标准化模型库所采用的一种规模化建立中国人群人源肝癌动物模型的方法，依次包括以下步骤：a.将中国肝癌患者的新鲜肿瘤组织标本分为三个部分：第一部分为将新鲜肿瘤组织块立即液氮快速冷冻，用于dna/rna提取；第二部分为将新鲜肿瘤组织块在福尔马林固定，石蜡包埋，用于组织病理学检查；第三部分为将新鲜肿瘤组织在无菌条件下切成10-20mm3的肿瘤组织块，迅速植入免疫缺陷小鼠或放进冷冻介质并在液氮中保存；b.使用生长因子，辅助接种肿瘤组织在免疫缺陷小鼠体内的生长，当肿瘤体积达500-1000mm3左右，对移植肿瘤进行体内传代；c.肿瘤组织的病理学鉴定；d.基因分子遗传学鉴定。公开号为cn107137425a的发明专利申请公开了一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用，所述方法包括如下步骤：(1)皮下移植：将原代肿瘤组织样本移植到免疫缺陷小鼠的体内，构建原代癌症异种移植模型pdx；(2)采集循环肿瘤细胞：采集步骤(1)所述的原代癌症异种移植模型的外周血中的循环肿瘤细胞；(3)肾囊膜移植：将步骤(2)采集的循环肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊膜内，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。然而，相比其他肿瘤pdx模型，目前肝细胞癌pdx模型的建模成功率只有约40％，并且现阶段还未出现能大幅度提高成瘤率的方法。因此，我们急需找到能预测肝细胞癌pdx模型的方法，及时为生命有限的肿瘤患者提供治疗选择。技术实现要素：本发明针对现有技术中肝细胞癌pdx模型的建模成功率低的问题，提供了一种非医学诊断为目的的用于判定肝细胞癌pdx模型构建时成瘤率高低的组合物，以及一种肝细胞癌pdx模型构建方法，通过预测肝细胞癌pdx模型成瘤率高低，选择成瘤率高的样品进行建模，而成瘤率低的样品或者没有成瘤可能性的样品可以放弃建模。本发明首先提供了一种非医学诊断为目的的用于判定肝细胞癌pdx模型构建时成瘤率高低的组合物，包括肝细胞癌肿瘤组织样品中的gpc3和ki67，判定时，将gpc3有表达定为gpc3阳性、否者为gpc3阴性；将细胞核ki67表达的细胞比例大于8.5％定为ki67阳性、否者为ki67阴性，若样品中gpc3和ki67双阳性，则肝细胞癌pdx模型构建时成瘤率高，若样品中gpc3和ki67其中一个阳性，则肝细胞癌pdx模型构建时成瘤率低，若样品中gpc3和ki67双阴性，则肝细胞癌pdx模型构建时无法成瘤。gpc3是近年来被认为与hcc密切相关的特异性标志物，其高表达与hcc患者预后不良有关。有研究表明，gpc3通过上调wnt/β-catenin、yap和hedgehog信号促进肿瘤细胞的增殖。ki-67被广泛认为是一种反应增殖能力的标志物。它只在细胞周期处在有丝分裂期的细胞中表达，当hcc肿瘤组织被植入免疫缺陷小鼠体内时，具有高增殖能力的细胞有更多的存活机会。通过实验数据分析，将gpc3和ki67结合建立预测模型，gpc3和ki67双阳性的肿瘤建模成功率为79.1％，gpc3阳性/ki67阴性的肿瘤建模成功率为15.0％，gpc3阴性/ki67阳性的肿瘤建模成功率为30.8％，gpc3阳性/ki67阳性的肿瘤建模成功率为0.0％。说明可以通过检测gpc3和ki67两个指标来预测肝细胞癌pdx建模成瘤成功率。本发明又提供了所述的组合物在判定肝细胞癌pdx模型构建时成瘤率高低中的应用。本发明又提供了所述的组合物在肝细胞癌pdx模型构建中的应用。本发明还提供了一种非医学诊断为目的的肝细胞癌pdx模型构建方法，包括以下步骤：(1)获取待构建pdx模型的肝细胞癌组织标本，取部分样品接种到免疫缺陷小鼠体内进行pdx模型构建，另取部分样品进行检测，检测gpc3和ki67的表达；(2)将gpc3有表达定为gpc3阳性、否者为gpc3阴性；将细胞核ki67表达的细胞比例大于18.5％定为ki67阳性、否者为ki67阴性；(3)选取检测结果为gpc3和ki67至少一个为阳性的样品，继续进行pdx模型构建，而其余样品不再继续进行pdx模型构建。步骤(1)中检测gpc3和ki67的表达时使用免疫组织化学方法进行检测。使用免疫组织化学方法进行检测比较简便，当然，也可以使用其他可用于检测组织中蛋白表达的方法。步骤(1)中检测gpc3和ki67的表达时使用原代肿瘤组织进行检测。即从肝细胞癌组织样本中直接取样品进行检测。步骤(1)中pdx模型构建时，在获取样本后2小时内接种到免疫缺陷小鼠体内。间隔时间过长，可能会影响取样组织中细胞的活性，影响建模结果。步骤(1)中取边长2mm的小块接种到免疫缺陷小鼠体内用于pdx模型构建。步骤(3)中继续进行pdx模型构建的样品，当免疫缺陷小鼠体内的肿瘤体积生长到1000mm3时，获取肿瘤组织进行免疫缺陷小鼠体内传代。优选的，步骤(3)中选取检测结果为gpc3和ki67双阳性的样品，继续进行pdx模型构建，而其余样品不再继续进行pdx模型构建。gpc3和ki67双阳性时，pdx模型构建成瘤率最高，达到79.1％；而gpc3和ki67其中一个阳性时，pdx模型构建还是有比较低的概率能够成瘤；而gpc3和ki67双阴性时，pdx模型构建成瘤率为0.0％，可以直接放弃继续构建模型。本发明肝细胞癌pdx模型构建方法用于构建pdx模型，而建立的pdx模型除了可以应用于临床肝癌患者筛选具有治疗反应的药物外，还可以用于临床前研究，比如研究肿瘤克隆进化分析、药物敏感或耐受的生物标志物筛选、基于治疗的肿瘤分子分型研究。总之，除了可用于与疾病治疗相关的方面，还可以用于多种非疾病治疗为目的的应用。本发明用于判定肝细胞癌pdx模型构建时成瘤率高低的组合物，包括肝细胞癌肿瘤组织样品中的gpc3和ki67，通过检测这两种蛋白，可以判断pdx建模成瘤率。本发明预测肝细胞癌pdx模型成瘤的方法，通过对肝细胞癌患者肿瘤组织gpc3和ki67的免疫组织化学结果判读，早期预测pdx模型成瘤与否。早期预测pdx模型不可成瘤，可尽早排除构建pdx模型。附图说明图1为gpc3、ki67阴性和阳性示例图，其中pdx#1为gpc3阳性/ki67阳性，pdx#2为gpc3阴性/ki67阴性。ki67依据细胞核ki67阳性比例临界值18.5％分为ki67阳性和ki67阴性。图2为gpc3/ki67联合模型预测hccpdx模型成瘤的roc结果图。具体实施方式伦理审批：浙江大学医学院附属第一医院科研伦理审查委员会伦理审查批准件【2018科研快审第768号】。浙江大学医学院附属第一医院实验动物伦理委员会审查批准件【2018实动快审第542号】。实施例1肝癌pdx建模及成瘤与否预测分析方法：患者在手术前签署知情同意书；a.肿瘤组织的获取：手术室无菌条件下获取肝细胞癌患者新鲜的肿瘤组织(编号为f0)，置于dmem/f12培养基，2小时内冰上运送至动物房；b.在超净台内将肿瘤组织分为三部分：第1部分是将肿瘤组织块在无菌环境下切成直径约2mm的小块，快速种植到免疫缺陷小鼠体内；第2部分是将肿瘤组织块固定在福尔马林液中，石蜡包埋，用于后期的分子病理学检测；第3部分是将肿瘤组织块立即用液氮快速冷冻，用于dna/rna提取；c.pdx模型的构建：将b中的肿瘤组织小块通过套管针接种到重度免疫缺陷小鼠(nsg)的外背侧皮下。一周两次观察移植瘤生长情况并测量体积大小，当肿瘤体积达到约1000mm3，获取移植瘤(编号为f1)按步骤b进行体内传代与标本保存；若自接瘤起6个月肿瘤未长出，则认为该例pdx模型建模失败；d.组织的病理学与免疫组织化学检查：获得f0肿瘤组织后马上开展肿瘤组织病理学检查，包括苏木素和伊红染色，常规病理学检查；肿瘤组织的免疫组织化学检查；对f0肿瘤组织进行gpc3和ki67的免疫组织化学染色；e.gpc3和ki67判读；依据gpc3有无表达分为gpc3阳性和gpc3阴性；依据细胞核ki67阳性比例临界值18.5％分为ki67阳性和ki67阴性；f.肝细胞癌pdx模型成瘤预测：gpc3阳性ki67阳性的pdx模型最易成瘤，gpc3阳性ki67阴性和gpc3阴性ki67阳性的pdx模型有小部分成瘤，gpc3阴性ki67阴性的pdx模型不能成瘤。本发明通过对肿瘤组织gpc3和ki67的分析提前预测肝细胞癌pdx模型成瘤与否，预估患者利用pdx模型进行药敏测试的可行性，旨在为不能建立pdx模型的患者保留宝贵的时间和资源，避免浪费时间在等待pdx模型能否成瘤。回顾性分析76例构建pdx模型的肝细胞癌患者临床参数、病理及分子参数。76例模型其中有30例建模成功，46例建模失败。临床参数包括年龄、性别、术前血清甲胎蛋白水平、乙肝感染、肝硬化、术前治疗情况、是否为原发灶；病理参数包括肿瘤大小、肿瘤分化程度、有无卫星灶、有无血管侵犯、组织学类型；特征性分子参数包括afp、gpc3、ki67、ck19、cd133、epcam。通过卡方检验筛选与建模成功有统计学意义的参数，p值小于0.05认为有统计学意义，结果见表1和表2。表1.肝细胞癌pdx模型患者的临床参数。表2.肝细胞癌pdx模型原始肿瘤的病理与分子参数。与建模成功存在统计学意义的参数包括年龄、术前血清甲胎蛋白水平、肿瘤分化程度、有无血管侵犯、组织学类型、gpc3、ki67、ck19、cd133。进一步，将上述参数纳入logistic回归模型建立预测模型，结果表明gpc3和ki67这两个参数对该预测模型贡献最大，结果见表3。表3.多因素logistic回归模型。参数风险率95％置信区间pgpc36.591.71-25.420.006ki-6716.764.12-68.07<0.001关于ki67阳性比例临界值的确定：通过spss软件绘制76例hcc的ki67细胞核阳性占比预测pdx模型成瘤的受试者工作特征曲线(roc)，通过每例的敏感性和特异性值获得每例的约登指数，计算公式为约登指数＝敏感性-(1-特异性)。将最大约登指数对应的ki67细胞核阳性占比设置为临界值。通过该方法，计算得到划分ki67阴/阳性的临界值为18.5％，大于18.5％的定义为ki67阳性，小于等于18.5％的定义为ki67阴性。因此将gpc3和ki67结合建立预测模型，gpc3阳性/ki67阳性的肿瘤建模成功率为79.1％(23/32)，gpc3阳性/ki67阴性的肿瘤建模成功率为15.0％(3/20)，gpc3阴性/ki67阳性的肿瘤建模成功率为30.8％(4/13)，gpc3阳性/ki67阳性的肿瘤建模成功率为0.0％(0/11)。特征性示例见图1。通过受试者工作曲线下面积(auroc)证明该模型预测pdx模型成功的auroc值达0.828，高于单个参数的auroc值，见图2。当前第1页12