N-(苯基磺酰基)苯甲酰胺化合物的HPLC分析方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及n-(苯基磺酰基)苯甲酰胺化合物的hplc分析方法。

背景技术：

细胞凋亡是程序性细胞死亡的过程，是组织稳态的必需生物学过程。在哺乳动物中，它已被证明可以调节早期胚胎发育。在生命的晚期，细胞死亡是一种默认机制，通过该机制除去潜在危险细胞，例如携带癌症缺陷的细胞。已知若干种凋亡途径。最重要的凋亡途径之一涉及bcl-2蛋白家族，其是细胞凋亡的线粒体（也称为“内在”）途径的关键调节剂。参见danial和korsmeyer，cell776：205-219(2004)。结构同源结构域bh1、bh2、bh3和bh4是bcl-2家族蛋白的特征。bcl-2蛋白质家族可以进一步分为三个亚族，这取决于每种蛋白质含有多少同源结构域及其生物活性，即它是否具有促凋亡或抗细胞凋亡功能。

bcl-2蛋白的第一亚组含有具有全部四个同源结构域的蛋白质，即bh1、bh2、bh3和bh4。它们的一般作用是抗细胞凋亡，即保护细胞免于开始细胞死亡过程。诸如bcl-2、bcl-w、bcl-xl、mcl-1和bfl-1/al的蛋白质是该第一亚组的成员。属于bcl-2蛋白的第二亚组的蛋白质含有三个同源结构域bh1、bh2和bh3，并具有促凋亡作用。第二个亚组的两个主要代表性蛋白质是bax和bak。bcl-2蛋白的第三个亚组由仅含有bh3结构域的蛋白质组成，该亚组的成员通常被称为“仅bh3蛋白质”。它们对细胞的生物学作用是促细胞凋亡的。bim、bid、bad、bik、noxa、hrk、bmf和puma是第三个蛋白质亚家族的例子。

失调的凋亡途径涉及许多重要疾病的病理学，例如神经变性病症(上调的细胞凋亡)，例如阿尔茨海默氏病；和增殖性疾病(下调的细胞凋亡)，例如癌症、自身免疫疾病和促血栓形成病症。

下调的细胞凋亡(更具体地，bcl-2蛋白质家族)可能参与癌性恶性肿瘤的发作。研究表明，例如，抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl在许多癌细胞类型中过表达。参见zhang，naturereviewsdrugdiscovery1：101(2002)；kirkin等，biochimicaetbiophysicaacta1644：229-249(2004)；和amundson等，cancerresearch60：6101-6110(2000)。这种失调的作用是改变细胞的存活，否则细胞会在正常条件下发生细胞凋亡。与不受调节的增殖相关的这些缺陷的重复被认为是癌症进化的起点。这些发现使得用于靶向癌症的药物发现成为可能的新策略。

wo2018/027097a1公开了用于治疗对bc1-2蛋白抑制有反应的疾病、障碍或病症（例如癌症）的n-(苯基磺酰基)苯甲酰胺及相关化合物，并具体公开了代表性化合物：n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺（下称式1化合物），其结构式如下：

式i化合物

该化合物在苯胺处含有一个手性中心，含有一对有效对映体。药物一般是通过与靶点之间的识别和匹配发挥药理活性，在许多情况下，手性化合物的一对对映体在生物体内的药理活性、代谢过程、代谢速率及毒性等存在显著的差异。另外在吸收、分布和排泄等方面也存在差异，还有对映体之间也有可能相互转化。从已知药效方面考虑，可能存在四种不同的情况：

1）只有一种对映体具有所要求的药理活性，而另一种对映体没有药理作用，例如：β-受体阻断剂普萘洛尔（propranolol）的两个对映异构体的体外活性相差98倍，非甾体抗炎药萘普生（naproxen）的（s）-构型对映体的活性比其对映体的活性强35倍。又如天然的尼古丁（nicotine）的毒性要比其非天然的对映体的毒性大得多。

2）一对对映体中的两个化合物都有同等的或近乎同等的药理活性；

3）两种对映体具有不同的药理活性；

4）各对映体药理活性相同但不相等。

为了保证式i化合物的研发和生产质量，需要对原料药及其制剂的质量进行控制。因此，研究获得一种式i化合物的异构体检查和含量测定的检测方法，对控制药品生产质量具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中缺少式i化合物的分离检测技术，而提供n-(苯基磺酰基)苯甲酰胺化合物的hplc分析方法，该方法能够分离异构体，并能够准确测定异构体的纯度。

本发明提供了一种物质x的hplc分析方法；所述的物质x为如式i-a和/或i-b所示化合物；

；

所述的hplc分析方法包括以下步骤：手性色谱柱中，用流动相对物质x进行洗脱，即可；所述的手性色谱柱为多糖衍生物耐溶剂型手性色谱柱；所述的手性色谱柱的柱温为25-35℃；所述的洗脱为等度洗脱；所述的洗脱的流速为0.5-3ml/min；所述hplc分析方法的检测波长为200-300nm；

所述的流动相包括烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂和醚类溶剂，

按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为600-800份，所述的醇类溶剂为50-350份，所述的卤代烃类溶剂为30-100份，所述的醚类溶剂为50-200份。

在本发明某些实施方案中，所述的烷烃类溶剂可为本领域常规的烷烃类溶剂，又可为c5-c10烷烃类溶剂，例如正己烷。

在本发明某些实施方案中，所述的醇类溶剂可为本领域常规的醇类溶剂，又可为c1-c3醇类溶剂，例如乙醇和/或异丙醇，优选异丙醇。

在本发明某些实施方案中，所述的卤代烃类溶剂可为本领域常规的卤代烃类溶剂，例如二氯甲烷。

在本发明某些实施方案中，所述的醚类溶剂可为本领域常规的醚类溶剂，例如四氢呋喃。

在本发明某些实施方案中，按体积份数计，所述的烷烃类溶剂可为650-750份，例如700份。

在本发明某些实施方案中，按体积份数计，所述的醇类溶剂可为60-300份，例如70份、100份、130份或300份，优选60-110份，例如60-80份或90-110份。

在本发明某些实施方案中，按体积份数计，所述的卤代烃类溶剂可为40-90份，例如50份或80份，优选40-60份或70-90份。

在本发明某些实施方案中，按体积份数计，所述的醚类溶剂可为70-160份，例如80份、120份或150份，优选140-160份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相还可进一步包括羧酸类溶剂。所述的羧酸类溶剂可为醋酸。按体积份数计，所述的羧酸类溶剂可为0.5-2.5份，又可为0.5-1.5份，例如1份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相还可进一步包括有机胺。所述的有机胺可为二乙胺和/或三乙胺，优选二乙胺。按体积份数计，所述的有机胺可为0.1-4份，又可为0.1-2.5份，例如0.2份、0.5份、1份和2份，优选0.1-1.5份，又可为0.1-0.3份。当所述的有机胺为二乙胺和三乙胺时，所述的二乙胺和三乙胺的体积比可为1:0.5-1:1.5，例如1:1。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂和醚类溶剂组成。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂和醚类溶剂组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为60-300份，所述的卤代烃类溶剂为40-90份，所述的醚类溶剂为70-160份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂和醚类溶剂组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为60-110份，所述的卤代烃类溶剂为40-90份，所述的醚类溶剂为140-160份；所述的烷烃类溶剂为正己烷，所述的醇类溶剂为乙醇和/或异丙醇，所述的卤代烃类溶剂为二氯甲烷，所述的醚类溶剂为四氢呋喃。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、乙醇100份、二氯甲烷50份、四氢呋喃150份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、异丙醇70份、二氯甲烷80份、四氢呋喃150份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂和羧酸类溶剂组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为600-800份，所述的醇类溶剂为50-350份，所述的卤代烃类溶剂为30-100份，所述的醚类溶剂为50-200份，所述的羧酸类溶剂为0.5-2.5份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂和羧酸类溶剂组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为60-300份，所述的卤代烃类溶剂为40-90份，所述的醚类溶剂为70-160份，所述的羧酸类溶剂为0.5-1.5份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂和羧酸类溶剂组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为60-80份，所述的卤代烃类溶剂为70-90份，所述的醚类溶剂为140-160份，所述的羧酸类溶剂为0.5-1.5份；所述的烷烃类溶剂为正己烷，所述的醇类溶剂为乙醇和/或异丙醇，所述的卤代烃类溶剂为二氯甲烷，所述的醚类溶剂为四氢呋喃，所述的羧酸类溶剂为醋酸。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷00份、异丙醇70份、二氯甲烷80份、四氢呋喃150份、醋酸1份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂和有机胺组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为600-800份，所述的醇类溶剂为50-350份，所述的卤代烃类溶剂为30-100份，所述的醚类溶剂为50-200份，所述的有机胺为0.1-4份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂和有机胺组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为60-300份，所述的卤代烃类溶剂为40-90份，所述的醚类溶剂为70-160份，所述的有机胺为0.1-2.5份；所述的烷烃类溶剂为正己烷，所述的醇类溶剂为乙醇和/或异丙醇，所述的卤代烃类溶剂为二氯甲烷，所述的醚类溶剂为四氢呋喃，所述的有机胺为二乙胺和/或三乙胺。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂和有机胺组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为90-110份，所述的卤代烃类溶剂为40-60份，所述的醚类溶剂为140-160份，所述的有机胺为0.1-1.5份；所述的烷烃类溶剂为正己烷，所述的醇类溶剂为异丙醇，所述的卤代烃类溶剂为二氯甲烷，所述的醚类溶剂为四氢呋喃；所述的有机胺为二乙胺。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、乙醇130份、二氯甲烷50份、四氢呋喃120份、二乙胺1份、三乙胺1份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、异丙醇100份、二氯甲烷50份、四氢呋喃150份、二乙胺1份、三乙胺1份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、乙醇150份、异丙醇150份、二氯甲烷50份、四氢呋喃80份、二乙胺1份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、异丙醇100份、二氯甲烷50份、四氢呋喃150份、二乙胺1份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、乙醇130份、二氯甲烷50份、四氢呋喃120份、二乙胺2份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂、羧酸类溶剂和有机胺组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为600-800份，所述的醇类溶剂为50-350份，所述的卤代烃类溶剂为30-100份，所述的醚类溶剂为50-200份，所述的羧酸类溶剂为0.5-2.5份，所述的有机胺为0.1-4份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂、羧酸类溶剂和有机胺组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为60-300份，所述的卤代烃类溶剂为40-90份，所述的醚类溶剂为70-160份，所述的羧酸类溶剂为0.5-1.5份，所述的有机胺为0.1-2.5份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂、羧酸类溶剂和有机胺组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为60-80份，所述的卤代烃类溶剂为70-90份，所述的醚类溶剂为140-160份，所述的羧酸类溶剂为0.5-1.5份，所述的有机胺为0.1-1.5份；所述的烷烃类溶剂为正己烷，所述的醇类溶剂为乙醇和/或异丙醇，所述的卤代烃类溶剂为二氯甲烷，所述的醚类溶剂为四氢呋喃；所述的羧酸类溶剂为醋酸，所述的有机胺为二乙胺和/或三乙胺。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由烷烃类溶剂、醇类溶剂、卤代烃类溶剂、醚类溶剂、羧酸类溶剂和有机胺组成；按体积份数计，所述的烷烃类溶剂为650-750份，所述的醇类溶剂为60-80份，所述的卤代烃类溶剂为70-90份，所述的醚类溶剂为140-160份，所述的羧酸类溶剂为0.5-1.5份，所述的有机胺为0.1-0.3份；所述的烷烃类溶剂为正己烷，所述的醇类溶剂为异丙醇，所述的卤代烃类溶剂为二氯甲烷，所述的醚类溶剂为四氢呋喃；所述的羧酸类溶剂为醋酸，所述的有机胺为二乙胺。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、异丙醇70份、二氯甲烷80份、四氢呋喃150份、醋酸1份、二乙胺0.2份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、异丙醇70份、二氯甲烷80份、四氢呋喃150份醋酸1份、二乙胺0.5份。

在本发明某些实施方案中，所述的流动相由下述组分组成；按体积份数计，正己烷700份、异丙醇70份、二氯甲烷80份、四氢呋喃150份、醋酸1份、二乙胺1份。

在本发明某些实施方案中，所述的物质x可以以溶液的形式添加到所述的手性色谱柱上。所述的物质x的溶液的制备方法可为方法一或方法二：

方法一：将物质x溶于溶剂，即可；

方法二：提取含物质x的制剂，即可。

所述的提取可通过本领域常规的手段进行提取。

所述的溶液中的溶剂可与所述的流动相相同，或为卤代烃类溶剂和所述的流动相的混合溶剂，所述的卤代烃类溶剂和所述的流动相的体积比可为0.5:1-2:1，例如1:1。所述的卤代烃类溶剂可为二氯甲烷。

在本发明某些实施方案中，所述的手性色谱柱可为多糖衍生物耐溶剂型手性色谱柱（其通过化学键合型结合的方式将多糖衍生物固定在硅胶上），又可为硅胶表面键合有纤维素-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）的糖衍生物耐溶剂型手性色谱柱，例如daicelchiralpakic手性色谱柱，又例如daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

在本发明某些实施方案中，所述的手性色谱柱的柱温可为本领域常规的柱温，又可为25-35℃，例如33℃。

在本发明某些实施方案中，所述的物质x的溶液的进样体积可为本领域常规的进样体积，又可为1-30μl，又可为10-20μl。

在本发明某些实施方案中，所述的洗脱可为等度洗脱。

在本发明某些实施方案中，所述的洗脱的流速可为本领域常规的流速，又可为0.5-3ml/min，又可为1-2ml/min。

在本发明某些实施方案中，所述hplc分析方法的检测波长可为本领域常规的检测波长，又可为200-300nm，又可为260-290nm，例如265nm、282nm或287nm。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明所提供的式i化合物的hplc分析方法具有使用可靠，稳定性较好，数据重现性强的优点，可以很好地将异构体分离，并能够准确测定异构体的纯度。

附图说明

图1是实施例1中（r）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图2是实施例1中（s）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图3是实施例1中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图4是实施例1中供试品溶液i的hplc谱图。

图5是实施例2中（r）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图6是实施例2中（s）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图7是实施例2中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图8是实施例3中（r）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图9是实施例3中（s）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图10是实施例3中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图11是实施例3中供试品溶液的hplc谱图。

图12是实施例4中（r）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图13是实施例4中（s）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图14是实施例4中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图15是实施例5中（r）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图16是实施例5中（s）-式i化合物定位溶液的hplc谱图。

图17是实施例5中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图18是实施例6中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图19是实施例7中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图20是实施例8中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图21是实施例9中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图22是实施例10中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图23是实施例11中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图24是对比例1中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图25是对比例2中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图26是对比例3中式i化合物分离度溶液的hplc谱图。

图27是实施例1供试品溶液ii的hplc谱图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，(r)-式i化合物参照专利申请cn109311871a制得。(s)-式i化合物、式i化合物（r和s构型的混合物）参照(r)-式i化合物的制备方法进行制备，换用原料即可。本发明通过本领域常规的手段制得式i化合物的片剂。

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)，购买厂家：江苏明捷科学仪器有限公司；生产厂家：大赛璐（daicel）。

实施例1：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：正己烷/异丙醇/二氯甲烷/四氢呋喃/醋酸/二乙胺=700/70/80/150/1/0.2。

检测波长：282nm。

流速：2.0ml/min。

柱温33℃。

进样体积：20μl。

稀释剂：二氯甲烷与流动相体积配比1:1。

实验步骤

溶液配制：取式i化合物约20mg，精密称定置于10ml量瓶中，加入5ml二氯甲烷，待样品完全溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液i；

取式i化合物的片剂1片研磨成细粉，转移至10ml容量瓶中，加入5ml二氯甲烷，超声5min，用流动相稀释至刻度，经有机滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液ii；

称量（s）-式i化合物对照品约20mg，置于100ml量瓶中，加入50ml二氯甲烷，待完全溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，再从此溶液中精密量取1ml置于100ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为（s）-式i化合物定位溶液；

称量（r）-式i化合物对照品约20mg，置于100ml量瓶中，加50ml二氯甲烷溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，再从此溶液中精密量取1ml置100ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为（r）-式i化合物定位溶液；

分别称量（s）-式i化合物对照品约20mg、(r)-式i化合物对照品约1mg置于同一10ml量瓶中，加5ml二氯甲烷溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。

精密量取（s）-式i化合物定位溶液、（r）-式i化合物定位溶液、分离度溶液、供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表1）。

表1系统适用性测试结果

根据表1及图1-4、图27可以看出，（r）-式i化合物与（s）-式i化合物可以得到有效分离，分离度为1.9，峰形良好，峰纯度良好，符合标准。

本发明所提供的分析方法，根据中国药典2015版，完成方法学验证，验证系统适用性、专属性、灵敏度、线性和范围、精密度、准确度、重现性以及溶液稳定性实验。经过这些验证，本发明提供的分析方法使用可靠，稳定性较好。

实施例2：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：二乙胺/三乙胺/四氢呋喃/乙醇/二氯甲烷/正己烷=1/1/120/130/50/700。

检测波长：287nm。

流速：1.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：20μl。

稀释剂：组成同流动相。

实验步骤

溶液配制：取式i化合物约20mg，精密称定置于50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

取（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于50ml量瓶中，用稀释剂溶解后稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml溶液置20ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml此溶液置20ml量瓶，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为（s）-式i化合物定位溶液；

取（r）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于50ml量瓶中，用稀释剂溶解后稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml溶液置20ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml此溶液置20ml量瓶，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为（r）-式i化合物定位溶液；

取（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定，置50ml量瓶中，量取(r)-式i化合物定位溶液原液1ml，稀释剂溶解后，稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。精密量取（s）式i化合物定位溶液、（r）-式i化合物定位溶液、分离度溶液各20μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表2）。

表2系统适用性测试结果

根据表2及图5-7可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物可以分离，分离度为1.0，峰纯度良好。

实施例3：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：四氢呋喃/乙醇/二氯甲烷/正己烷=150/100/50/700。

检测波长：282nm。

流速：1.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：10μl。

稀释剂：二氯甲烷与流动相体积比为1:1。

实验步骤

溶液配制：取式i化合物约30mg，精密称定置于20ml量瓶中，用10ml二氯甲烷溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

取（s）-式i化合物对照品约30mg，精密称定置于20ml量瓶中，用10ml二氯甲烷溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取溶液1ml至50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取此溶液1ml置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为（s）-式i化合物定位溶液；

取（r）-式i化合物对照品约30mg，精密称定置于20ml量瓶中，用10mldcm溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取溶液1ml至50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取此溶液1ml置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为（r）-式i化合物定位溶液；

取（s）-式i化合物约30mg，精密称定置于20ml量瓶中，量取（r）-式i化合物定位溶液原液2ml，加10ml二氯甲烷溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。精密量取（s）-式i化合物定位溶液、（r）-式i化合物定位溶液、分离度溶液、供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表3）

表3系统适用性测试结果

根据表3及图8-11可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物可以得到有效分离，分离度为1.7，峰纯度良好，符合标准。

实施例4：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：正己烷/异丙醇/二氯甲烷/四氢呋喃=700/70/80/150。

检测波长：282nm。

流速：2.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：10μl。

稀释剂：二氯甲烷与流动相体积比为1：1。

实验步骤

溶液配制：取式i化合物约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，加入10ml二氯甲烷，待样品完全溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

取（s）-式i化合物约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，加入10ml二氯甲烷，待样品完全溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取溶液1ml至50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取此溶液1ml置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为（s）-式i化合物定位溶液；

取（r）-式i化合物约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，加入10ml二氯甲烷，待样品完全溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取溶液2ml至10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为（r）-式i化合物定位溶液；

取（s）-式i化合物约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，量取（r）-式i化合物定位溶液原液0.5ml，加10ml二氯甲烷溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。精密量取（s）-式i化合物定位溶液、（r）-式i化合物定位溶液、分离度溶液各10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表4）

表4系统适用性测试结果

根据表4及图12-14可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物可以分离，分离度为1.8，峰形良好，峰纯度良好，符合标准。

实施例5：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：正己烷/异丙醇/二氯甲烷/四氢呋喃/醋酸=700/70/80/150/1。

检测波长：282nm。

流速：2.0ml/min。

柱温33℃。

进样体积：20μl。

稀释剂：二氯甲烷与流动相体积比为1:1。

实验步骤

溶液配制：取式i化合物约30mg，精密称定置于20ml量瓶中，用10ml二氯甲烷溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

取（s）-式i化合物对照品约30mg，精密称定置于20ml量瓶中，用10ml二氯甲烷溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取溶液1ml至50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取此溶液1ml置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为（s）-式i化合物定位溶液；

取（r）-式i化合物对照品约30mg，精密称定置于20ml量瓶中，用10ml二氯甲烷溶解后，用流动相稀释，摇匀，精密量取溶液1ml至50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取此溶液1ml置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为（r）-式i化合物定位溶液；

取（s）-式i化合物约30mg，精密称定置于20ml量瓶中，量取（r）-式i化合物定位溶液原液2ml，加10ml二氯甲烷溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。精密量取（s）-式i化合物定位溶液、（r）-式i化合物定位溶液、分离度溶液各10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表5）。

表5系统适用性测试结果

根据表5及图15-17可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物可以得到有效分离，分离度为2.1，峰形良好，峰纯度良好，符合标准。

实施例6：式i手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：正己烷/异丙醇/二氯甲烷/四氢呋喃/醋酸/二乙胺=700/70/80/150/1/1.0。

检测波长：282nm。

流速：2.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：20μl。

稀释剂：二氯甲烷与流动相体积配比1：1。

实验步骤

溶液配制：取式i化合物约20mg，精密称定置于10ml量瓶中，加入5mldcm，待样品完全溶解后，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

分别称量（s）-式i化合物对照品约20mg、（r)-式i化合物对照品约1mg置同一10ml量瓶中，加5mldcm溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。精密量取分离度溶液20μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表6）。

表6系统适用性测试结果

根据表6及图18可以看出，(r)-式i化合物与（s）-式i化合物可以得到有效分离，分离度为1.6，峰形良好，峰纯度良好，符合标准。

实施例7：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：正己烷/异丙醇/二氯甲烷/四氢呋喃/醋酸/二乙胺=700/70/80/150/1/0.5。

检测波长：282nm。

流速：2.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：20μl。

稀释剂：二氯甲烷与流动相体积配比1：1。

实验步骤

溶液配制：取式i化合物约20mg，精密称定置于10ml量瓶中，加入5ml二氯甲烷，待样品完全溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

分别称量（s）-式i化合物对照品约20mg、(r)-式i化合物对照品约1mg置同一10ml量瓶中，加5ml二氯甲烷溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。精密量取分离度溶液20μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表7）。

表7系统适用性测试结果

根据表7及图19可以看出，(r)-式i化合物与（s）-式i化合物可以得到有效分离，分离度为1.8，峰形良好，峰纯度良好，符合标准。

实施例8：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：四氢呋喃/异丙醇/二氯甲烷/正己烷/二乙胺/三乙胺=150/100/50/700/1/1。

检测波长：265nm。

流速：1.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：10μl。

稀释剂：组成同流动性。

实验步骤

溶液配制：分别取（r）-式i化合物对照品约2mg和（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，摇匀，作为分离度溶液。

精密量取分离度溶液10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表8）

表8系统适用性测试结果

根据表8及图20可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物可以分离，分离度为1.1。

实施例9：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：四氢呋喃/乙醇/异丙醇/二氯甲烷/正己烷/二乙胺=80/150/150/50/700/1。

检测波长：265nm。

流速：1.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：10μl。

稀释剂：组成同流动性。

实验步骤

溶液配制：分别取（r）-式i化合物对照品和（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，用稀释剂溶解后稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。

精密量取分离度溶液10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表9）

表9系统适用性测试结果

根据表9及图21可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物可以分离，分离度为1.3。

实施例10：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：四氢呋喃/异丙醇/二氯甲烷/正己烷/二乙胺=150/100/50/700/1。

检测波长：265nm。

流速：1.0ml/min。

柱温33℃。

进样体积：10μl。

稀释剂：组成同流动性。

实验步骤

溶液配制：分别取（r）-式i化合物对照品和（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，摇匀，作为分离度溶液。

精密量取分离度溶液10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表10）

表10系统适用性测试结果

根据表10及图22可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物可以很好的分离，分离度为2.0。

实施例11：式i手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：四氢呋喃/乙醇/二氯甲烷/正己烷/二乙胺=120/130/50/700/2。

检测波长：265nm。

流速：1.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：10μl。

稀释剂：组成同流动性。

实验步骤

溶液配制：分别取（r）-式i化合物对照品和（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，用稀释剂溶解后稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。

精密量取分离度溶液10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表11）

表11系统适用性测试结果

根据表11及图23可以看出，(r)-式i化合物与（s）-式i化合物可以分离，分离度为1.5。

对比例1：式i化合物手性纯度的测定

流动相体积配比：乙醇/正己烷/二乙胺=300/700/1。

检测波长：265nm。

流速：1.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：10μl。

稀释剂：组成同流动相。

实验步骤

溶液配制：分别取（r）-式i化合物对照品和（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，用稀释剂溶解后稀释至刻度，摇匀，作为分离度溶液。

精密量取分离度溶液10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算。

根据图24可以看出，（r）-式i化合物和（s）-式i化合物该条件下120min皆未出峰，该条件不合适。

对比例2：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：正己烷/乙醇/二氯甲烷/二乙胺=600/200/200/1。

检测波长：265nm。

流速：1.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：20μl。

稀释剂：组成同流动相。

实验步骤

溶液配制：分别取（r）-式i化合物对照品和（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于50ml量瓶中，摇匀，作为分离度溶液。

精密量取分离度溶液20μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表12）

表12系统适用性测试结果

n/a表示已检测，由于分离度差而无法计算获得。

根据表12及图25可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物分离较差。

对比例3：式i化合物手性纯度的测定

高效液相色谱条件：

色谱柱：daicelchiralpakic(250mm×4.6mm,5.0µm)。

流动相体积配比：四氢呋喃/乙醇/正己烷/二乙胺=80/250/650/1。

检测波长：265nm。

流速：1.0ml/min。

柱温：33℃。

进样体积：10μl。

稀释剂：组成同流动相。

实验步骤

溶液配制：分别取（r）-式i化合物对照品和（s）-式i化合物对照品约20mg，精密称定置于20ml量瓶中，摇匀，作为分离度溶液。

精密量取分离度溶液10μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，按照面积归一化法计算（参见表13）

表13系统适用性测试结果

n/a表示已检测，由于分离度差而无法计算获得。

根据表13及图26可以看出，(r)-式i化合物与(s)-式i化合物分离度较差。