一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法与流程

本发明涉及一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法，属于食品质量安全检测领域。

背景技术：

水牛奶营养丰富，其干物质、乳脂肪、乳蛋白、矿物质、维生素等主要营养成分均高于牛奶，且生物活性肽、共轭亚油酸、神经苷节脂、低聚戊糖等含量丰富，是人类优良食物的来源。因此水牛奶也逐渐受到消费者的青睐。然而水牛奶的产量较低且受到季节性变化的影响，导致水牛奶原料成本较高。因此受到经济利益驱使，价格较低、产量较高的牛奶粉掺入水牛奶粉的掺假现象出现。这种掺假行为不仅损害消费者的合法权益，掺入的牛奶更会对牛奶过敏消费者的健康造成威胁。

现阶段定性鉴别水牛奶和牛奶的方法主要有基于dna检测的pcr法和基于高效液相色谱的指纹图谱法。

申请号为201810540219.9的中国发明专利公开了一种检测畜类源性成分的三重荧光pcr引物组、试剂盒及检测方法，其主要是通过提取样品中dna,然后利用专利中给出的引物、探针组合物或试剂盒对dna进行pcr扩增,收集荧光信号,可以实现对绵羊、山羊、羚羊和家牛、水牛、牦牛的6种畜类的准确检测。此方法操作简单，具有较好的特异性，标准误差小，检测时间短等优点。但pcr方法也存在明显的缺陷，由于pcr法基于指数扩增的检测机理，其检测误差较大，同时奶中的dna主要来自白细胞与脱落的乳腺细胞，这与动物的品种，饲养，健康条件以及生理期有关，所以奶中的dna含量不稳定，不好建立标准化的检测方法。

申请号为201910482656.4的中国发明专利公开了一种鉴定水牛乳中掺假的检测方法，此方法通过去除水牛乳中的脂肪，然后将样品通过高效液相色谱进行检测得到指纹图谱，可以区分水牛乳中是否掺有奶牛乳。此方法具有良好的重现性和专属性，能够得到样品间具有代表性的指纹图谱可以快速分析是否掺假。但对于基于高效液相色谱的指纹图谱技术来说，实验室条件、仪器设备的不同对检测的标准化和规范化带来一定的阻碍。

液相色谱-质谱联用技术法已经成为物种鉴定的主要方法之一。此种鉴定方法灵敏度高，特异性好。该方法通过比对选择特异性多肽作为生物标记物，对不同物种来源的食物进行溯源调查。许多文献报道了利用该方法进行肉类，乳制品和阿胶等进行了定性鉴定，但未见关于水牛奶的蛋白层次定性鉴定方面的研究。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合。使用该特征肽组合可以准确检测水牛奶中牛奶的掺假，具有较高的特异性、灵敏度。

一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及，包括水牛奶特征肽和牛奶特征肽，其中水牛奶的特征肽氨基酸序列为ldsesaplr和tpednleiilr，牛奶的特征肽氨基酸序列为qvlsntvpak。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

（1）对采集得到的水牛奶和牛奶进行冷冻干燥，所得到的冻干奶粉进行复溶；

（2）对复溶所得到的纯乳品进行测定蛋白浓度测定；

（3）取一定量的蛋白进行蛋白变性处理，使用胰蛋白酶酶解；

（4）酶解所得到的肽段用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测。

优选的，所述的复溶按照奶粉与蒸馏水的比例为1:20（w/v）涡旋混匀，在40℃水浴中震荡30min。

优选的，所述取一定量蛋白约200µg。

优选的，使用dtt进行变性，加入10µl120mldtt（溶于8m尿素和0.1mtris-hcl,ph8.5缓冲液中）涡旋混匀后37℃反应1h。

优选的，使用10µl600mmiaa（溶于8m尿素和0.1mtris-hcl,ph8.5缓冲液中）避光室温反应15min。

优选的，高效液相色谱的条件为：色谱柱：xbridgepeptidebehc18column,300å,3.5µm,4.6mm×150mm;流动相a为0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流动相b为0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速0.4ml/min；柱温40℃，进样体积10µl。

优选的，质谱条件为：esi正离子扫描参数：气帘气（cur）压力35psi，碰撞气（cad）：medium，离子化电压4500v，离子源温度500℃，雾化气（gs1）65psi，辅助气（gs2）50psi；正离子扫描mrm模式：mrm检测窗口120s，扫描时间3s。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：

（1）本发明通过高分辨质谱筛选得到水牛奶和牛奶的特异性肽段，可以实现对水牛奶中牛奶掺假的快速检测。该方法具有高灵敏度，高特异性的优点；

（2）本发明选择蛋白中的特异性肽段作为检测物质，适用于变性蛋白的检测，因此可以满足同时检测样品中的变性与非变性蛋白，保证了方法的准确性。

附图说明

图1为水牛奶肽段提取离子流色谱图。

图2为牛奶肽段提取离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1特征肽段的筛选和确定。

将取来的奶样冷冻干燥后，分别取200mg水牛奶粉和牛奶粉进行复溶，加入4ml水后涡旋混匀，在40℃水浴中震荡30min。

将每个样品取100µl进行25倍稀释，使用定量荧光方法测定蛋白质含量。根据qubit蛋白测定试剂盒的说明，所有测定试剂必须在室温下操作。每个样品制备200µlqubit工作溶液，该溶液以qubit试剂与qubit缓冲液的比例为1：200制备。将10µl三种标准液与190µlqubit工作溶液混合。此外，将5µl样品溶液添加到195µlqubit工作溶液中。在室温下孵育15分钟后，在qubit3.0荧光计系统中进行测试。

根据所测得样品蛋白浓度，每个样品取200µg蛋白至1.5ml棕色管中，用ms水定容至200µl，加入10µl120mldtt（溶于8m尿素和0.1mtris-hcl,ph8.5缓冲液中）涡旋混匀后37℃反应1h。反应结束后加入10µl600mmiaa（溶于8m尿素和0.1mtris-hcl,ph8.5缓冲液中）避光室温反应15min。结束后将所有溶液移取到含膜（10kda）离心管中，12000×g离心10min，加入100µlms水后再次离心。此步骤重复三次，洗掉膜上盐分。将收集管中的离心废液倒掉，并水洗三次。

加入100µlabc（50mm）溶液，加入4µl胰蛋白酶溶液，37℃水浴条件下过夜膜上酶切。酶切后12000×g离心15min，加100µlabc（25mm）溶液，再次离心。此步骤重复三次。弃掉膜，收集管放入真空干燥机进行旋干。干燥后加入100µlms水再次进行干燥。此步骤重复三次。用100µla相（98%质谱水+2%乙腈+0.1%甲酸）进行复溶，涡旋混匀，12000×g离心15min，取上层液体80µl置于液相小瓶中进行上样。

将qtof得到的结果文件，以及根据各物种名称在uniprot数据库检索水牛关键词：bubalusbubalis和奶牛关键词：bostaurus，下载蛋白数据库导入proteinpilot5.0软件进行搜库后得到所有肽段列表，选取响应高、得分>20、氨基酸个数6~20、可信度>95%、无漏切的肽段作为预选特征肽段。将所有肽段进行物种间的对比，去除相同序列的肽段。将筛选剩下的肽段使用skyline软件进行理论肽段信息构建，并与二级质谱图进行比对，选响应值较高的离子峰，得到候选特异性肽段信息。其中保留时间默认为20min。

将得到的候选特异性肽段信息使用qtrap5500的mrm模式进行验证，根据得到的离子色谱图确定物种特异性肽段，最终确定了水牛奶的特征肽为ldsesaplr和tpednleiilr，牛奶的特征肽为qvlsntvpak，其质谱参数见表1。

表1：特征肽段的mrm检测参数

实施例2检测试验。

检测试验样品来自市场的两种水牛奶粉和三种牛奶粉。前处理所有步骤直至进入质谱分析前都与实施例1中相同。为了验证实验结果的可靠性和灵敏度，在所采集的可靠冻干水牛奶粉中加入0.1%、0.2%、0.3%、0.5%和1%的牛奶粉。一共十个样品进行前处理。前处理注意不要使奶粉相互接触，以免发生污染。样品处理结束后将表1检测参数输入到qtrap5500的mrm模式窗口中，进行质谱检测。质谱分析结束后提取特异性肽段的离子流色谱图，提取出则表示有这类物种的存在。检测结果显示，市售样品的水牛奶粉中均能提取到水牛特异性肽段，未提取到牛特异性肽段，牛奶粉中均能提取到牛特异性肽段。这表明特异性肽段具有良好的稳定性和特异性。模拟掺假的样品中均能检测到牛奶粉的存在，可以证明此方法的检测线至少为0.1%，具有高灵敏度。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

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<212>prt

<213>水牛(bubalusarnee)

<400>1

hisglnglyleuproglnglyvalleuasngluasnleuleuarg

151015

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<213>水牛(bubalusarnee)

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<212>prt

<213>奶牛(bostaurus)

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glnvalleuserasnthrvalproalalys

1510