一种高效液相色谱法测定吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的方法与流程

本发明涉及药物分析
技术领域：
，特别涉及一种高效液相色谱法测定吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的方法。
背景技术：
：异丙托溴铵，分子式：c20h30brno3，分子量412.4，cas号：22254-24-6，医药上以其一水合物使用。异丙托溴铵主要用于缓解慢性阻塞性肺病引起的支气管痉挛、喘息症状；慢性阻塞性气管炎伴或不伴有肺气肿；轻到中度支气管哮喘。目前吸入用复方异丙托溴铵溶液在美国药典中收载；英国药典、中国药典均未收载。而在usp有关物质检测条件：流动相a为2.7g/ml的磷酸二氢钾用磷酸调节至ph值3.9，流动相b为乙腈的条件下，使得硫酸沙丁胺醇杂质f、杂质r和异丙托溴铵杂质c分离度较差，硫酸沙丁胺醇杂质i和异丙托溴铵杂质d分离度为1.20，均不满足已知杂质完全分离且定量测定的要求。现有技术中有针对异丙托溴铵气雾剂中杂质g的检测方法，其虽然也采用了液相色谱法进行检测，但是由于其针对的是异丙托溴铵气雾剂，该气雾剂中添加了柠檬酸、乙醇、水等诸多辅料，并采用特定的钢罐和铝合金包材，这些添加的辅料以及包材会对杂质的产生造成影响，而针对吸入用复方异丙托溴铵溶液而言，与上述的异丙托溴铵气雾剂无论从剂型上还是从成分组成上均有显著的不同，因此现有技术难以直接应用于复方异丙托溴铵溶液中相关物质的检测，能否提供一种针对复方异丙托溴铵溶液有关物质测定方法，成为本领域亟待解决的技术问题之一。技术实现要素：针对现有技术中存在的诸多不足之处，本发明提供了一种高效液相色谱法测定吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的方法，所采用的方法为高效液相色谱法，其中各杂质的专属性、线性及范围、回收率、精密度、耐用性等试验均良好；通过本发明方法使各已知杂质均达到完全分离。本发明方法设计合理，仪器设备为已普及的高效液相色谱仪；且流动相配置简单、检测成本低，实现有关物质中各杂质的分离和定量测定。本发明的主要创新点在于：本申请所针对的是以硫酸沙丁胺醇和异丙托溴铵两种物质为主要成分的吸入用复方异丙托溴铵溶液，该剂型的支气管扩张效应优于其任意单一成份的作用，与现有技术中的异丙托溴铵气雾剂有显著不同。而且吸入用复方异丙托溴铵溶液为供雾化器用的液体制剂，与气雾剂剂型差异较大，本申请中在进行高效液相色谱检测时，混合体系为异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇两种成份产生的所有杂质进行分离，而现有技术的丙托溴铵气雾剂中杂质g的检测方法中仅为异丙托溴铵相关的杂质的分离，两者具有显著的不同；针对上述不同，发明人针对本发明的混合体系为异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇两种主成份可能产生的杂质进行检测，混合体系中硫酸沙丁胺醇杂质f、杂质r和异丙托溴铵杂质c分离度较差，硫酸沙丁胺醇杂质i和异丙托溴铵杂质d分离度为1.20，均不满足分离度的要求。发明人经过大量实验后，结合各杂质的性质发现异丙托溴铵杂质c和杂质d在酸性流动相中保留时间会延后，所以发明人在本发明中调节了流动相a的ph值使上述杂质得到更好的分离；为了方便描述，发明人将本申请所涉及的各种杂质以英文字母的形式进行了简化，简化后杂质与其指代的具体物质如下表所示：在上述指导思想的支持下，本发明所采用的具体技术方案如下：一种高效液相色谱法测定吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的方法，通过以下步骤实现：(1)色谱柱的准备：所用色谱柱的填充剂为用辛烷基硅烷；(2)高效液相色谱仪的设置：检测器的检测波长为210nm，柱温为30℃，流动相流速为1.0ml/min；(3)流动相水相的配置：称取磷酸二氢钾2.7g，置1000ml水中溶解，用磷酸调节ph为3.7；(4)流动相的准备：流动相a为上述磷酸盐溶液，流动相b为乙腈；(5)梯度洗脱：时间min流动相a％流动相b％095539554084166060407560407795585955(6)样品溶液的配置：供试品溶液浓度：硫酸沙丁胺醇1.2mg/ml，异丙托溴铵0.2mg/ml；稀释剂为0.01mol/l的盐酸溶液；混合溶液：精密量取各杂质贮备液(硫酸沙丁胺醇杂质c，f，n，q，r，i的浓度为0.2mg/ml，杂质d的浓度为0.1mg/ml，杂质t的浓度为0.15mg/ml，异丙托溴铵杂质b，c，d的浓度为0.1mg/ml，杂质f的浓度为0.04mg/ml)各1ml，置于100ml量瓶中，加供试品溶液稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；其中所述各杂质贮备液均采用各杂质标准品配置获得；供试品溶液：2.5ml；(7)精密量取上述混合溶液、供试品溶液各50μl，注入色谱仪测定，并记录色谱图；检测结果显示：异丙托溴铵的保留时间为34.101min，各杂质硫酸沙丁胺醇杂质t、杂质c、杂质d、杂质n、杂质f、杂质r、杂质q、杂质i、异丙托溴铵杂质b、杂质c、杂质d、杂质f的保留时间分别为：7.169min、20.240min、23.949min、24.954min、28.092min、29.079min、32.936min、54.057min、37.277min、31.602min、56.178min、53.293min，相对保留时间分别为：0.21、0.59、0.70、0.73、0.82、0.85、0.96、1.58、1.09、0.93、1.65、1.56；上述结果说明本发明中涉及的各杂质均与主成分峰完全分离，各个杂质峰之间也能达到较好的分离效果。本发明通过合理的方法设计，与现有的技术相比，本方法专属性强、灵敏度和准确度高，各杂质在相应的浓度范围内线性关系良好，本方法重复性及耐用性均良好，可以很好地控制本品的已知杂质及未知杂质，保证产品的安全性。附图说明图1为本发明实施例1所述方法hplc色谱图；图2为本发明对比例中所述方法hplc色谱图；由图可见，本申请所述方法获得的谱图中，硫酸沙丁胺醇杂质f、杂质r和异丙托溴铵杂质c分离度明显提高，硫酸沙丁胺醇杂质i和异丙托溴铵杂质d分离度也明显提高，均优于对比例。具体实施方式下面对本发明的几个实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，除特殊说明外，所采用的均为现有技术；实施例1一种吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的方法，具体步骤如下：1、仪器与试剂仪器：waterse2695/arc试剂：乙腈(色谱级)、磷酸二氢钾、磷酸、纯化水；2、测定方法的建立(1)波长选择：异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇及其杂质，紫外光吸收具有自身的特性。选取专属性项下的吸收图谱，异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇及其各杂质在210nm波长下均有较强的紫外吸收，因此选用210nm作为本品的检测波长。(2)干扰试验配制异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇与各杂质的混合溶液，并分别进行杂质定位，以此判断空白溶剂及各杂质是否干扰检测。试验方法：(1)色谱柱的准备：所用色谱柱的填充剂为用辛烷基硅烷；(2)高效液相色谱仪的设置：检测器的检测波长为210nm，柱温为30℃，流动相流速为1.0ml/min；(3)流动相水相的配置：称取磷酸二氢钾2.7g，置1000ml水中溶解，用磷酸调节ph为3.7；(4)流动相的准备：流动相a为上述磷酸盐溶液，流动相b为乙腈；(5)梯度洗脱：时间min流动相a％流动相b％095539554084166060407560407795585955(6)样品溶液的配置：供试品溶液浓度：硫酸沙丁胺醇1.2mg/ml，异丙托溴铵0.2mg/ml；稀释剂为0.01mol/l的盐酸溶液；混合溶液：精密量取各杂质贮备液(硫酸沙丁胺醇杂质c，f，n，q，r，i的浓度为0.2mg/ml，杂质d的浓度为0.1mg/ml，杂质t的浓度为0.15mg/ml，异丙托溴铵杂质b，c，d的浓度为0.1mg/ml，杂质f的浓度为0.04mg/ml)各1ml，置100ml量瓶中，加供试品溶液稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；其中所述各杂质贮备液均采用各杂质标准品配置获得；供试品溶液：2.5ml；(7)精密量取上述混合溶液、供试品溶液各50μl，注入色谱仪测定，并记录色谱图；检测结果见图1；结果显示：从混合溶液色谱图中可以看出，各已知杂质均能有效检出且空白溶剂及各杂质不干扰本品有关物质检查；说明本方法用于本品有关物质检查专属性良好。对比例1利用usp方法进行实施例1中对应物质的检测：流动相a：取2.7g磷酸二氢钾加1000ml水溶解，用磷酸调节ph值为3.9；流动相b：乙腈；色谱柱：waterssymmetryc8，250×4.6mm，5μm；柱温：30℃流速：1.0ml/min进样量：50μl波长：210nm；梯度程序：时间(min)流动相a％流动相b％095539554084166060407560407795585955(1)稀释剂：水(2)混合溶液：用水稀释制成含有0.2mg/ml的异丙托溴铵、1.2mg/ml的硫酸沙丁胺醇，以及分别含有1μg/ml的异丙托溴铵杂质c、杂质d、硫酸沙丁胺醇杂质d，0.4μg/ml的异丙托溴铵杂质f、杂质b，1.5μg/ml的硫酸沙丁胺醇杂质t，2μg/ml的硫酸沙丁胺醇杂质f、n、q、r、c、i。上述杂质均采用已知的各杂质标准品；精密量取上述各溶液50μl，分别注入带有二极阵列检测器的液相色谱仪，记录色谱图，见图2。在此色谱条件下，硫酸沙丁胺醇杂质f、杂质r和异丙托溴铵杂质c分离度较差，无法分开，硫酸沙丁胺醇杂质i和异丙托溴铵杂质d分离度为1.20，无法实现已知杂质的定量检测。结论：通过比对可知，与usp方法相比，在本发明的色谱条件下，硫酸沙丁胺醇杂质f、杂质r和异丙托溴铵杂质c均能完全分离，硫酸沙丁胺醇杂质i和异丙托溴铵杂质d完全分离，其他各杂质均与主成分无安全分离，各个杂质之间也能达到基本分离。实施例2强制破坏性试验破坏性(酸、碱、氧化、高温、光照)试验下的分离，取本品药液分别进行各条件的破坏试验：置于酸(2mol/l盐酸溶液2ml，60℃水浴加热3h)；碱(0.1mol/l氢氧化钠溶液1ml，振荡一下，室温放置2min)；氧化(加30％双氧水2ml，室温放置8h)；高温(90℃水浴加热24h)；光照(照度不低于4500lx、紫外光不低于200w·hr/m2的条件下放置数天)，试验结果表明在酸、氧化状态下药液不稳定，产生硫酸沙丁胺醇杂质n、杂质f、杂质q及异丙托溴铵杂质c，在碱、高温、光照条件下轻微降解,稍有硫酸沙丁胺醇杂质t和杂质d产生。结果表明在本色谱条件下供试品强制破坏所产生的各降解杂质均能有效检出；分离度良好，物料基本平衡且主峰峰纯度符合要求；说明本方法用于本品有关物质检查专属性良好。实施例3进样精密度精密量取对照品(用稀释剂0.01mol/l配成含有0.9μg/ml异丙托溴铵、5μg/ml硫酸沙丁胺醇的溶液)溶液50μl，重复进样5针，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。计算5针主成分峰面积的rsd；结果表明，异丙托溴铵和沙丁胺醇的峰面积的rsd均小于5.0％，说明系统适用性满足要求。实施例4检测限和定量限将硫酸沙丁胺醇及各杂质溶液，逐步稀释，制成检测限、定量限溶液，精密量取各检测限、定量限溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，信噪比约为3：1时，即为检测限浓度，信噪比约为10：1时，即为定量限浓度。硫酸沙丁胺醇、异丙托溴铵及硫酸沙丁胺醇杂质d、杂质f、杂质n、杂质q、杂质t、异丙托溴铵杂质c、杂质d、杂质f的定量限分别为0.84ng、2.23ng、0.53ng、1.01ng、1.04ng、0.49ng、0.24ng、1.06ng、0.46ng、0.60ng。上述试验数据表明主成分及各杂质的检测限、定量限均满足本品有关物质检查的灵敏度要求。实施例5线性及范围分别配置硫酸沙丁胺醇和异丙托溴铵以及各杂质的溶液，分别取50μl进样，记录峰面积。计算浓度与峰面积之间的线性关系，得回归曲线与回归方程。结果显示：异丙托溴铵在范围0.04731-246.4μg/ml(定量限～125％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。硫酸沙丁胺醇在0.02037-1273.4μg/ml(定量限～125％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。异丙托溴铵杂质c在0.02166-1.587μg/ml(定量限～150％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。异丙托溴铵杂质d在0.009207-1.535μg/ml(定量限～150％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。异丙托溴铵杂质f在0.01206-0.6030μg/ml(定量限～150％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。硫酸沙丁胺醇杂质t在0.004787-2.244μg/ml(定量限～150％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。硫酸沙丁胺醇杂质d在0.01067-1.334μg/ml(定量限～150％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。硫酸沙丁胺醇杂质f在0.02019-3.028μg/ml(定量限～150％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。硫酸沙丁胺醇杂质n在0.02088-3.132μg/ml(定量限～150％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。硫酸沙丁胺醇杂质q在0.009786-2.936μg/ml(定量限～150％)浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。相关系数均大于0.99。除此之外，硫酸沙丁胺醇杂质c和杂质i均属于工艺杂质,仅进行定位确认保留时间即可，无需进行线性范围等验证。实施例6回收率回收率样品溶液：精密称取硫酸沙丁胺醇原料24mg，置20ml量瓶中，分别精密量取异丙托溴铵原料贮备液2ml(异丙托溴铵贮备液：精密称取异丙托溴铵对照品18mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀)，回收率贮备液(含异丙托溴铵杂质c、杂质d、硫酸沙丁胺醇杂质d、杂质f、杂质n、杂质q浓度为10μg/ml、异丙托溴铵杂质杂质f浓度为8g/ml、硫酸沙丁胺醇杂质t浓度为15μg/ml)各1ml、2ml，分别置于上述20ml量瓶，用空白辅料(不含有硫酸沙丁胺醇和异丙托溴铵主成分的溶液)稀释至刻度，摇匀，同法制备各3份，作为回收率样品溶液①-⑥；精密称取硫酸沙丁胺醇原料30mg，置25ml量瓶中，精密量取异丙托溴铵原料贮备液2.5ml，回收率贮备液(同上述贮备液)3ml，置上述25ml量瓶，用空白辅料稀释至刻度，摇匀，同法制备3份，作为回收率样品溶液⑦-⑨。对照品溶液：精密量取上述回收率贮备液2ml置20ml量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取上述各溶液各50ul注入液相色谱仪，结果见表1。表1杂质名称回收率均值(％)回收率rsd(％)异丙托溴铵杂质c100.41.2异丙托溴铵杂质d99.960.56异丙托溴铵杂质f102.20.37硫酸沙丁胺醇杂质d95.462.8硫酸沙丁胺醇杂质f99.770.55硫酸沙丁胺醇杂质n102.70.83硫酸沙丁胺醇杂质q99.960.36硫酸沙丁胺醇杂质t98.011.2结果表明：杂质回收率均在90％-108％之间，rsd％均小于10％，说明本色谱条件用于本品有关物质检查准确度良好。实施例7耐用性在方法学验证中，我们分别使用安捷伦液相更换相同品牌不同根色谱柱，各杂质之间及与主峰之间完全分离，说明本色谱条件用于本品有关物质检测耐用性良好。实施例8溶液稳定性将供试品溶液、对照品溶液和杂质混合溶液，分别在室温放置48h，供试品溶液中两主峰的峰面积的rsd均小于2％，供试品溶液中杂质峰面积和的rsd均小于10％，且无新的杂质峰出现；对照品溶液中异丙托溴铵和沙丁胺醇峰面积rsd均小于10％，杂质混合溶液中各杂质峰面积的rsd均小于10％，说明本品供试品溶液、对照品溶液和杂质混合溶液室温放置48h稳定性良好。综合上述实施例的结果可见，本方法专属性强、灵敏度和准确度高，重复性及耐用性良好，可以很好地控制本品有关物质，保证产品的安全性。当前第1页12