一种用于定性检测新型冠状病毒IgG/IgM抗体的试纸及制备方法与流程

一种用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸及制备方法
技术领域
1.本发明涉及免疫诊断技术领域，特别涉及一种用于定性检测新型冠状病毒 igg/igm抗体的试纸及制备方法。


背景技术：

2.国家卫健委在2020年3月4日发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗 方案(试行第七版)》，确诊病例在原有核酸检测和测序基础上增加“血 清学检测”作为依据，将血清新型冠状病毒特异性igm和igg抗体作 为诊断标准之一。在此背景下，相关的检测试剂也不断被研发出来。 公开号cn111273003a的中国专利，公开了一种新型冠状病毒检测免 疫层析试纸条，是将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水板顺次相 互搭接地粘结在底板上形成，能够快速检测病人的特异性抗体igm或 igg检测；但该试纸仍存在较高的假阴性率，同时检测时容易污染整 张试纸，增加检测人员感染风险。而公开号cn111337669a的中国专 利，公开了一种快速检测新型冠状病毒检测试纸及检测方法，利用双 酶联免疫吸附来特异性捕捉结合冠状病毒蛋白抗原，再通过化学显色 进行判断；但该试纸操作繁琐、准确性差，同时需要配合酶标仪完成 检测，无法快速得到结果，同时容易受其他病毒或生物大分子干扰。
[0003][0004][0005]
面对日益严峻的疫情，仍有很多疑似病例因检测能力不够而不能确诊，如何大规模快速筛查出疑似病例，提高检测准确性、安全性，为临床医生提供快速的诊断依据，是目前亟需解决的问题。


技术实现要素：

[0006]
有鉴于此，本发明旨在提出一种用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸及制备方法，以实现大规模、准确快速的筛查，提高检测准确性、安全性。
[0007]
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0008]
一种用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸，包括底板以及依次搭接在所述底板上的样品垫、金标垫、显色基体、吸水板，所述金标垫包括相连的第一金标垫、第二金标垫，所述第一金标垫经含胶体金标记的鸡igy复合物的第二处理液浸渍处理；所述第二金标垫经含胶体金标记的新型冠状病毒s 蛋白和n蛋白按3～6:1形成的第三处理液浸渍处理。该设置可避免胶体金标记的复合物等关键试剂之间的相互干扰以及避免不同试剂由于分子量大小、物理性质等参数不同导致喷涂不均匀，提高检测的准确性。优选的，所述新型冠状病毒s蛋白的表达系统是hek293(人胚胎肾细胞)，所述新型冠状病毒n蛋白的表达系统是原核表达系统(大肠杆菌)。
[0009]
进一步的，所述第一金标垫位于靠近所述样品垫的一侧，所述样品垫和所述第一金标垫之间还设有滤血膜。该设置可避免病毒颗粒进入金标垫及显色基体，降低试纸传播
病毒的风险，提高检测的安全性。作为本发明的另一个示例，所述第一金标垫位于靠近显色基体的一侧。所述滤血膜、吸水板均为现有技术，在此不进行赘述。
[0010]
更进一步的，所述显色基体上间隔设有第一检测线、第二检测线、质控线，所述第一检测线上喷涂有浓度0.1～0.5mg/ml鼠抗人igm单抗，所述第二检测线喷涂有浓度为1.0～2.0mg/ml的鼠抗人igg单抗，所述质控线上喷涂有浓度为1.0～2.0mg/ml羊抗鸡igy多克隆抗体。其中，所述质控线、第二检测线、第一检测线的相对位置可调。作为本发明的一个示例，所述质控线设在靠近所述吸水板的一端，所述第一检测线设在所述第二检测线和质控线之间。优选的，所述第二检测线设在第一检测线和质控线之间，有利于igm的快速和高灵敏度的检测，阳性检出率更高。所述相邻的第一检测线、第二检测、质控线之间的间距分别为3～5mm。
[0011]
进一步的，所述底板为为不吸水材料，如pvc或其它硬质材料；所述显色基体为硝酸纤维素膜。该设置结构简单、材料易得、成本低、便于生产。
[0012]
相对于现有技术，本发明所述的用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸具有以下优势：
[0013]
(1)本发明将新型冠状病毒s蛋白和n蛋白混合使用，使试纸的灵敏度和特异性都得到了提高；同时二者的使用比例进行了优化，在保证阳性检出率的前提下，使试纸的假阳性检出率大大降低；
[0014]
(2)本发明所述的用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸对n 蛋白的标记工艺进行了优化，使标记的n蛋白和胶体金结合更稳定，试纸的检测结果也更稳定；
[0015]
(3)本发明将金标垫进一步分为第一金标垫、第二金标垫，避免胶体金标记的鸡igy复合物、胶体金标记的新型冠状病毒s蛋白和n蛋白的复合物等关键试剂的相互干扰或喷涂不均匀，提高检测的准确性；同时，常见疾病的生物感染源对其检测结果无干扰。
[0016]
本发明还提供了一种用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸的制备方法，包括：
[0017]
s1、样品垫的制备：用硼酸：硼砂：s-9：酪蛋白按比例4～8:10～20:40～ 60:40～60配置第一处理液，将第一膜材料放入所述处理液中浸渍处理，烘干得到样品垫；优选的，所述第一处理液中硼酸：硼砂：s-9：酪蛋白的比例为5～ 7：13～17：45～55：45～55。优选的，所述第一膜材料为玻璃纤维膜。其中 s-9是一种常用的表面活性剂，为现有技术。
[0018]
s2、金标垫的制备：将胶体金标记的鸡igy制备的第二处理液喷涂在第二膜材料上，干燥后得第一金标垫；将胶体金标记的新型冠状病毒s蛋白和n蛋白制得的第三处理液喷涂在玻纤上，干燥后得到第二金标垫；作为本发明的一个示例，所述第二膜材料可以是玻璃纤维膜或聚脂膜。
[0019]
s3、显色基体的制备：分别将鼠抗人igm单抗、鼠抗人igg单抗、羊抗鸡 igy间隔的包被在第三膜材料上形成第一检测线、第二检测线、质控线，所述相邻的第一检测线、第二检测线、质控线之间间隔1～6mm；优选的，所述第一检测线、第二检测线之间间隔3mm，所述第二检测线、质控线之间间隔5mm。优选的，所述第三膜材料为硝酸纤维素膜，如市售的赛多利斯cn140的nc膜。
[0020]
s4、组装将滤血膜、吸水板以及制得的样品垫、金标垫、显色基体按序粘贴在底板上的固定位置，分切即得。所述试纸的宽度可以为3mm、3.5mm或 4.0mm，
[0021]
进一步的，步骤s1中，所述处理液的组分为0.06％硼酸、0.15％硼砂、0.5％酪蛋白、0.5％s-9，余量为水。
[0022]
更进一步的，步骤s2中，所述第三处理液的制备方法包括：
[0023]
s21、胶体金制备：取0.01-0.03ml氯金酸加入到100ml纯化水中，加热至沸腾，再加入1.5-4ml1％柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金颜色变成酒红色后，冷却；优选的，所述氯金酸加入量为0.02ml，如取1ml 2％氯金酸加入到100ml 纯化水中；
[0024]
s22、s蛋白金标液制备：取1ml步骤s21制备的胶体金，加入10-40μl0.1m 碳酸钾后混匀，调ph至8.2-9.5；再依次加入0.5-1μg的新型冠状病毒s蛋白、 50-100μl10％的牛血清白蛋白，分别混匀；
[0025]
s23、n蛋白金标液制备：取1ml步骤s21制备的胶体金加入10-40μl0.1m 碳酸钾混匀，调整ph至8.2-9.5，再依次加入0.5-1μg的新型冠状病毒n蛋白、 50-100μl10％的牛血清白蛋白，分别混匀；所述ph可以是8.2、8.6、9.1或9.5。
[0026]
s24、金标液的纯化：分别将步骤s22制备的s蛋白金标液和步骤s23制备的n蛋白金标液离心，弃除上清，再加入金标复溶液复溶，即得。优选的，所述金标复溶液由0.06％硼酸、0.15％硼砂、0.5％酪蛋白、0.5％s-9、0.1％牛血清白蛋白、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、20％蔗糖和5％海藻糖，余量为纯化水组成。
[0027]
再进一步的，所述步骤s23中，将所述新型冠状病毒n蛋白一次性加入，之后以100-300rpm搅拌15-30min。例如100rpm下搅拌30min或者150rpm下搅拌20min或300rpm下搅拌15min。
[0028]
进一步的，步骤s1的烘干条件为：30～60℃下烘干10～24h；例如，在30℃下烘干24h或在40℃下干燥18h、50℃干燥12h或在60℃下干燥10h；步骤s2 的烘干条件为：30～55℃下烘干10～24h；步骤s2的烘干条件为：30～50℃下烘干4～12h。
[0029]
更进一步的，所述第一膜材料和/或第二膜材料和/或第三膜材料为硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜和聚酯膜中的任一种。
[0030]
所述用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸的制备方法与所述试纸具有相同的有益效果，在此不再进行赘述。
附图说明
[0031]
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0032]
图1为本发明实施例所述的用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸的结构示意图；
[0033]
图2为本发明实施例所述的用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸的另一视角图。
[0034]
附图标记说明：
[0035]
1-样品垫，2-滤血膜，3-金标垫，31-第一金标垫；32-第二金标垫；4-显色基体，5-igm检测线，6-igg检测线，7-质控线，8-吸水板，9-底板。
具体实施方式
[0036]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0037]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件；实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与本领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
[0038]
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0039]
实施例1：
[0040]
本实施例1提供了一种用于定性检测新型冠状病毒igg/igm抗体的试纸，包括底板9以及依次搭接在所述底板9上的样品垫1、滤血膜2、金标垫3、显色基体4，所述吸水板8搭接在所述显色基体4的另一端，所述金标垫3包括搭接相连的第一金标垫31、第二金标垫32，所述第一金标垫31远离第二金标垫32的一端靠近所述滤血膜2设置；所述显色基体4上依次间隔设有第一检测线5、第二检测线6、质控线7，其中：
[0041]
样品垫1为玻璃纤维膜，在第一处理液中浸渍5-10min，浸渍处理量为 660g/m2(即每平方米玻璃纤维膜用660g第一处理液浸渍)，放入鼓风干燥箱中55℃下烘干18h，烘干后将玻璃纤维膜裁切成尺寸14mm*300mm备用，其中第一处理液由如下的组分组成：
[0042][0043]
加入各组分90％及纯化水，用6mnaoh调整第一处理液的ph至7.5
±
0.05，再用纯化水补足至100％。
[0044]
滤血膜2：将滤血膜2裁切成尺寸5mm*300mm备用。
[0045]
第一金标垫31：取1ml制备好的胶体金溶液加入15μl0.1m碳酸钾混匀，调整ph至9.0，加入1μg的鸡igy充分混匀，再加入50μl10％的牛血清白蛋白混匀；离心后弃除上清，再加入含有20％蔗糖和5％海藻糖的金标复溶液复溶，得到第二处理液。将玻璃纤维膜浸渍在第二处理液中5-10min，浸渍处理量为 600g/m2(即每平方米玻璃纤维膜用600g第二处理液浸渍)，放入鼓风干燥箱中37℃下烘干18h，后将玻璃纤维膜裁切成尺寸5mm*300mm备用，其中金标复溶液由如下的组分组成：
[0046][0047]
第二金标垫32：取1ml胶体金加入30μl0.1m碳酸钾混匀，调整ph至 9.2，加入1μg的新型冠状病毒s蛋白充分混匀，再加入100μl10％的牛血清白蛋白混匀；取1ml胶体金加入25μl0.1m碳酸钾混匀，调整ph至9.0，加入 1μg的新型冠状病毒n蛋白充分混匀，再加入100μl10％的牛血清白蛋白混匀；新型冠状病毒n蛋白标记时，所用容器是玻璃器皿；新型冠状病毒n蛋白需一次性加入到胶体金溶液中；搅拌转速为300转/分钟；搅拌时间为25分钟，新型冠状病毒s蛋白标记时无特殊要求。分别将s蛋白金标液和n蛋白金标液离心后弃除上清，加入含有20％蔗糖和5％海藻糖的金标复溶液复溶；将复溶后的s蛋白金标液和n蛋白金标液按5:1的比例混合均匀，得到第二金标垫处理液。将玻璃纤维膜浸渍在第二金标垫处理液中，浸渍处理量为620g/m2(即每平方米玻璃纤维膜用620g第二金标垫处理液浸渍)，放入鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为37℃，烘干时间为20小时，烘干后将玻璃纤维膜裁切成尺寸 5.5mm*300mm备用。
[0048]
显色基体4：选用硝酸纤维素膜，即市售的赛多利斯cn140的nc膜，将浓度为1.0mg/ml的羊抗鸡igy多克隆抗体，浓度为1.5mg/ml的鼠抗人igg单抗，浓度为0.3mg/ml的鼠抗人igm单抗分别喷涂在nc膜上，放入鼓风干燥箱中37℃下烘干12h，后将玻璃纤维膜裁切成尺寸20mm*300mm备用。
[0049]
吸水板8：将吸水板8裁切成尺寸17mm*300mm备用。
[0050]
底板9：选用60mm*300mm的pvc板。
[0051]
将制得的样品垫1、滤血膜2、第一金标垫31、第二金标垫32、显色基体 4和吸水板8依次粘贴在底板9上的固定位置，裁切成60mm*4mm，即得试纸。
[0052]
实施例2：
[0053]
本实施例，除复溶后的s蛋白金标液和n蛋白金标液按1:1的比例混合外，其它步骤均同实施例1。
[0054]
实施例3：
[0055]
本实施例，除复溶后的s蛋白金标液和n蛋白金标液按2:1的比例混合外，其它步骤均同实施例1。
[0056]
实施例4：
[0057]
本实施例，除复溶后的s蛋白金标液和n蛋白金标液按3:1的比例混合外，其它步骤均同实施例1。
[0058]
实施例5：
[0059]
本实施例，除复溶后的s蛋白金标液和n蛋白金标液按4:1的比例混合外，其它步骤均同实施例1。
[0060]
实施例6：
[0061]
本实施例，除复溶后的s蛋白金标液和n蛋白金标液按6:1的比例混合外，其它步骤均同实施例1。
[0062]
实施例7：
[0063]
本实施例，除复溶后的s蛋白金标液和n蛋白金标液按7:1的比例混合外，其它步骤均同实施例1。
[0064]
实施例8：
[0065]
本实施例，除复溶后的s蛋白金标液和n蛋白金标液按8:1的比例混合外，其它步骤均同实施例1。
[0066]
实施例9：
[0067]
本实施例，除鼠抗人igm单抗的使用浓度为0.2mg/ml，鼠抗人igg单抗的使用浓度为1.0mg/ml，将羊抗鸡igy多克隆抗体的使用浓度为1.2mg/ml外，其它步骤均同实施例1。
[0068]
实施例10：
[0069]
本实施例，除鼠抗人igm单抗的使用浓度为0.4mg/ml，鼠抗人igg单抗的使用浓度为1.8mg/ml，将羊抗鸡igy多克隆抗体的使用浓度为1.5mg/ml外，其它步骤均同实施例1。
[0070]
实施例11：
[0071]
本实施例，除鼠抗人igm单抗的使用浓度为0.5mg/ml，鼠抗人igg单抗的使用浓度为2.0mg/ml，将羊抗鸡igy多克隆抗体的使用浓度为2.0mg/ml外，其它步骤均同实施例1。
[0072]
比较例1：
[0073]
本实施例，除第二金标垫32中仅使用新型冠状病毒s蛋白外，其它步骤均同实施例1。
[0074]
比较例2：
[0075]
本实施例，除第二金标垫32中仅使用新型冠状病毒n蛋白外，其它步骤均同实施例1。
[0076]
比较例3：
[0077]
本实施例，除新型冠状病毒n蛋白的标记工艺变为与新型冠状病毒s蛋白一致外，其它步骤均同实施例1。
[0078]
比较例4：
[0079]
本实施例，采用公开号cn111273003a中实施例2的方法制备试制样品。
[0080]
比较例5：
[0081]
本实施例，采用公开号cn111337669a中实施例1的方法制备试制样品。
[0082]
对上述实施例1～11以及比较例1～5中制备的试纸进行测试：
[0083]
样本的检测
[0084]
血液样本：取10μl全血、血浆或血清，加入到样品垫1上，然后滴加80μl 样本稀释液，即10-50mm pbs+0.05-0.25％吐温-20，以带动样本层至膜材料上反应，等待15分钟，观察检测结果。其中的样品稀释液
[0085]
灵敏度测试
[0086]
选取新型冠状病毒igm和igg中阳质控灭活样本，分别按1:5、1:25、1:125、 1:625进行稀释，采用实施例1～11以及比较例1～3中的试纸进行测试，测试结果见表1。
[0087]
表1灵敏度检测结果
[0088][0089]
从表1的检测结果可以看出，本发明的实施例1～11所制备的试纸，在阳性样本稀释度为1:625，检测结果为阳性，而比较例1、2及4，在阳性样本的稀倍数小于25倍时，检测结果为阳性；而比较例3、5中，在阳性样本稀释倍数小于125倍时，检测结果为阳性。上述结果表明，将新型冠状病毒s蛋白和 n蛋白混合使用，所制备的试纸灵敏度更高，同时新型冠状病毒n蛋白的不同标记工艺对灵敏度也有影响。
[0090]
阴阳性符合率测试
[0091]
选取30份新型冠状病毒igg/igm阳性血清样本(其中igg强阳8份，中阳15份，弱阳7份；其中igm强阳7份，中阳15份，弱阳8份)和30份新型冠状病毒igg/igm阴性血清样本，采用实施例1～11以及比较例1～4中的试纸进行测试，测试结果见表2和表3。
[0092]
表2 igg/igm阳性血清检测结果
[0093]
[0094]
[0095]
[0096][0097]
表3 igg/igm阴性血清检测结果
[0098]
[0099]
[0100][0101][0102]
从表2和表3的检测结果可以看出，实施例1、实施例4、实施例5、实施例6、实施例9、实施例10和实施例11所制备的试纸igg/igm的阳性和阴性符合率都为100％(30/30)。实施
例2所制备的试纸igg的阳性符合率为90％ (27/30)，igg的阴性符合率为100％(30/30)，igm的阳性符合率为100％(30/30)，igm的阴性符合率为76.7％(23/30)。实施例3所制备的试纸igg 的阳性符合率为93.3％(28/30)，igg的阴性符合率为100％(30/30)，igm 的阳性符合率为100％(30/30)，igm的阴性符合率为93.3％(28/30)。实施例7所制备的试纸igg的阳性符合率为100％(30/30)，igg的阴性符合率为 93.3％(28/30)，igm的阳性符合率为86.7％(26/30)，igm的阴性符合率为 100％(30/30)。实施例8所制备的试纸igg的阳性符合率为100％(30/30)， igg的阴性符合率为90％(27/30)，igm的阳性符合率为80％(24/30)，igm 的阴性符合率为100％(30/30)。比较例1所制备的试纸igg的阳性符合率为 76.7％(23/30)，igg的阴性符合率为100％(30/30)，igm的阳性符合率为 66.7％(20/30)，igm的阴性符合率为100％(30/30)；比较例2所制备的试纸igg的阳性符合率为73.3％(22/30)，igg的阴性符合率为100％(30/30)， igm的阳性符合率为83.3％(25/30)，igm的阴性符合率为100％(30/30)。比较例3所制备的试纸igg的阳性符合率为100％(30/30)，igg的阴性符合率为100％(30/30)，igm的阳性符合率为90％(27/30)，igm的阴性符合率为100％(30/30)。上述结果表明：本发明将新型冠状病毒s蛋白和n蛋白按 3:1～6:1混合使用，所制备的试纸阴阳性符合率最好，优于现有技术；同时新型冠状病毒n蛋白的不同标记工艺对igm的阳性检出有影响。
[0103]
交叉反应和干扰测试
[0104]
将一些其他常见传染病的阳性标本、内源性和外源性的干扰物质加入新型冠状病毒阳性标本和阴性标本中，采用实施例1及比较例4制备的试纸进行测试，测试结果见表4、表5和表6。
[0105]
表4交叉反应的检测结果
[0106][0107]
表5内源性干扰物质的检测结果
[0108][0109]
表6外源性干扰物质的检测结果
[0110][0111][0112]
从表4、表5和表6的检测结果可以看出，比较例4制备的试纸对部分病毒颗粒以及内源性干扰物质存在交叉反应，影响检测准确性；而本发明的实施例1所制备的试纸对甲型流感病毒、b型流感病毒、hcv、hbv、流感嗜血杆菌229e(α-冠状病毒)、nl63(α-冠状病毒)、冠状病毒(oc43)、hku1 (β-冠状病毒)、呼吸道合胞病毒、艾滋病毒无交叉反应，对一些常见的内源性和外源性物质，在规定的浓度范围内也无影响。
[0113]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。