【技术领域】
本发明涉及一种分子内光电化学传感器的制备方法及应用，属于光电化学与免疫传感领域。
背景技术：
光电生物传感器是一种将特定的生物认知转化为可视化电流的信号转化装置，总结已有的报道能够发现，绝大多数的光电传感体系无论是n型导电还是p型导电都是通过外加电子供体或受体的方式产生光电流，通常选用n型光敏材料时会选择抗坏血酸作为电子供体，而选用p型光敏材料时会选择过氧化氢或者溶解氧作为电子受体，虽然这种方式构建的传感体系在癌胚抗原、降钙素原等疾病标志物的检测中产生了令人满意的效果，但由于人体血清中存在一定量的活性氧或抗坏血酸，在实际样品检测中血清样品的复杂性对数据的干扰明显是不可忽略的，考虑到这一点，积极寻找电子供体或受体的替代品并应用于生物传感领域显得尤为关键。
酪氨酸，又名2-氨基-3-对羟苯基丙酸，它是一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸，同时也是人体的条件必需氨基酸和生酮生糖氨基酸，它的侧链是一个苯酚基团，氧原子的价电子是以sp2杂化轨道参与成键的，酚羟基中氧原子上一对未共用电子对所属在的p轨道，与苯环的六个碳原子的p轨道是平行的，它们是共轭的，因此，由于氧原子上的部分负电荷离域而分散到整个共轭体系中，所以氧原子上的电子云密度降低，减弱了o-h键，有利于氢原子离解成为质子和具有强还原性的酚氧负离子。
利用小分子肽配基实现抗体定向固定近年来在生物传感中受到了广泛关注，一方面它的生物相容性好，生物活性高等，更重要的是相较于蛋白a、蛋白g等传统抗体捕获剂其结构更加简单明确，例如目前最受青睐的hwrgwv六肽可以特异性地与抗体fc片段ser383-asn389环中的氨基酸相互作用，并且可以根据自己的需要的性质比如尺寸大小、表面电荷、靶向等来自行设计多功能多肽序列。
技术实现要素：
本发明提供了一种分子内光电化学传感器的制备方法及应用，实现了cyfra21-1的高灵敏检测。
本发明目的之一是提供一种分子内光电化学传感器的制备方法。
本发明目的之二是将所制备的分子内光电化学传感器应用于cyfra21-1的高灵敏、特异性检测。
本发明采用的技术方案如下：
1.一种分子内光电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将尺寸为1×2cm的ito导电玻璃在丙酮中超声清洗1h，依次用超纯水和无水乙醇清洗干净，用氮气吹干；
（2）取6µl、2~6mg/ml的bi2wo6/agins2光电复合材料水溶液滴加到ito导电玻璃的导电面，置于红外灯下烤干；
（3）将ito电极浸入0.1m巯基乙酸和0.1m氯化钠溶液的混合液中，在bi2wo6/agins2光电复合材料表面引入羧基；
（4）用4μl、浓度为0.01m1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基后，在ito电极表面滴涂6μl、浓度为50μg/ml的ab1溶液，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（5）滴加5μl、质量分数为0.01%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（6）滴加6μl、10fg/ml~100ng/ml的一系列不同浓度的cyfra21-1溶液，4°c下晾干，随后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（7）滴加6~10μlyyyhwrgwv-ab2溶液，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗，制得一种分子内光电化学传感器。
2.所述bi2wo6/agins2光电复合材料，按以下步骤制备：
（1）取2.0~5.0g硝酸铋溶于100ml、浓度为0.1~0.5m稀硝酸中得溶液a；取0.5~1.0g钨酸钠溶液溶于30~50ml水中，得溶液b；将a和b两溶液混合均匀后，用浓度为0.2m的氢氧化钠溶液调节ph至8.5，常温下搅拌24h后，转入高压反应釜中，在140~200oc下反应5~8h，反应结束后，自然冷却，产物用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，在30~50oc下真空干燥10~14h，制得bi2wo6纳米球；
（2）取0.01~0.05g硝酸银、0.1~0.5g乙酰丙酮铟、0.3~0.5ml油酸、8~10ml十八烯，四者混合得到溶液c，将0.02~0.03g硫粉溶解于1~3ml油胺中，得到溶液d，在氮气保护下将溶液c加热至130oc，快速将溶液d注射进溶液c中，反应2min后停止加热，冷却至室温，所得产物加入5~10ml巯基丙酸和2ml无水甲醇，离心后收集沉淀，在40~60°c下真空干燥12h，制得agins2量子点；
（3）将bi2wo6和agins2按照100:3的摩尔比混合，分散在5ml氯仿中，在氩气保护下220~270°c煅烧2~5h，得到bi2wo6/agins2光电复合材料。
3.所述yyyhwrgwv-ab2溶液，按以下步骤制备：
在5~10ml、浓度为1~5mg/ml的yyyhwrgwv九肽溶液中加入10μl、浓度为0.01m1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基后，倒入1ml、浓度为10μg/ml的ab2溶液中，震荡20min,得到yyyhwrgwv-ab2溶液。
4.所述cyfra21-1的检测，按以下步骤制备：
（1）使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的传感器为工作电极构成三电极系统，在10.0ml、ph=9.8的碳酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法进行检测，运行时间120s，光源波长为520nm；
（3）电极放置好之后，每隔20s开灯持续照射20s，检测光电流强度；
（4）采用不同浓度的cyfra21-1标准溶液进行测定，记录不同浓度的cyfra21-1标准溶液所对应的光电流值变化；
（5）利用工作曲线法，得到待测样品中cyfra21-1的浓度。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明首次利用新型电子供体酪氨酸耦合抗体捕获肽成功制备了一种双功能二抗标记物，该标记物既能够实现抗体的定向固定，又能够通过酪氨酸残基上的酚羟基作为电子供体消耗整个光电提供的空穴实现电子空穴对的分离，因而提升光电响应满足痕量分析的需求；
（2）本发明提出的bi2wo6/agins2光电复合材料生物相容性好，光电响应高，可见光利用率高，原料成本低，制备工艺简单，反应耗能低；
（3）本发明首次基于该传感模型构建了一种夹心型免疫传感器用于cyfra21-1的灵敏检测，其线性范围10fg/ml~100ng/ml，检出限为7.72fg/ml。为cyfra21-1的快速检测提供了一种新的分析方法。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1一种分子内光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将尺寸为1×2cm的ito导电玻璃在丙酮中超声清洗1h，依次用超纯水和无水乙醇清洗干净，用氮气吹干；
（2）取6µl、2mg/ml的bi2wo6/agins2光电复合材料水溶液滴加到ito导电玻璃的导电面，置于红外灯下烤干；
（3）将ito电极浸入0.1m巯基乙酸和0.1m氯化钠溶液的混合液中，在bi2wo6/agins2表面引入羧基；
（4）用4μl、浓度为0.01m1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基后，在ito电极表面滴涂6μl、浓度为50μg/ml的ab1溶液，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（5）滴加5μl、质量分数为0.01%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（6）滴加6μl、10fg/ml~100ng/ml的一系列不同浓度的cyfra21-1溶液，4°c下晾干，随后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（7）滴加6μlyyyhwrgwv-ab2溶液，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗，制得一种分子内光电化学传感器。
实施例2一种分子内光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将尺寸为1×2cm的ito导电玻璃在丙酮中超声清洗1h，依次用超纯水和无水乙醇清洗干净，用氮气吹干；
（2）取6µl、4mg/ml的bi2wo6/agins2光电复合材料水溶液滴加到ito导电玻璃的导电面，置于红外灯下烤干；
（3）将ito电极浸入0.1m巯基乙酸和0.1m氯化钠溶液的混合液中，在bi2wo6/agins2表面引入羧基；
（4）用4μl、浓度为0.01m1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基后，在ito电极表面滴涂6μl、浓度为50μg/ml的ab1溶液，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（5）滴加5μl、质量分数为0.01%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（6）滴加6μl、10fg/ml~100ng/ml的一系列不同浓度的cyfra21-1溶液，4°c下晾干，随后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（7）滴加8μlyyyhwrgwv-ab2溶液，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗，制得一种分子内光电化学传感器。
实施例3一种分子内光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将尺寸为1×2cm的ito导电玻璃在丙酮中超声清洗1h，依次用超纯水和无水乙醇清洗干净，用氮气吹干；
（2）取6µl、6mg/ml的bi2wo6/agins2光电复合材料水溶液滴加到ito导电玻璃的导电面，置于红外灯下烤干；
（3）将ito电极浸入0.1m巯基乙酸和0.1m氯化钠溶液的混合液中，在bi2wo6/agins2表面引入羧基；
（4）用4μl、浓度为0.01m1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基后，在ito电极表面滴涂6μl、浓度为50μg/ml的ab1溶液，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（5）滴加5μl、质量分数为0.01%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（6）滴加6μl、10fg/ml~100ng/ml的一系列不同浓度的cyfra21-1溶液，4°c下晾干，随后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗；
（7）滴加10μlyyyhwrgwv-ab2溶液，4°c晾干后用ph=7.4的pbs缓冲溶液冲洗，制得一种分子内光电化学传感器。
实施例4bi2wo6/agins2光电复合材料的制备
（1）取2.0g硝酸铋溶于100ml、浓度为0.1m稀硝酸中得溶液a；取0.5g钨酸钠溶液溶于30ml水中，得溶液b；将a和b两溶液混合均匀后，用浓度为0.2m的氢氧化钠溶液调节ph至8.5，常温下搅拌24h后，转入高压反应釜中，在140oc下反应5h，反应结束后，自然冷却，产物用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，在30oc下真空干燥10h，制得bi2wo6纳米球；
（2）取0.01g硝酸银、0.1g乙酰丙酮铟、0.3ml油酸、8ml十八烯，四者混合得到溶液c，将0.02g硫粉溶解于1ml油胺中，得到溶液d，在氮气保护下将溶液c加热至130oc，快速将溶液d注射进溶液c中，反应2min后停止加热，冷却至室温，所得产物加入5ml巯基丙酸和2ml无水甲醇，离心后收集沉淀，在40°c下真空干燥12h，制得agins2量子点；
（3）将bi2wo6和agins2按照100:3的摩尔比混合，分散在5ml氯仿中，在氩气保护下220°c煅烧2h，得到bi2wo6/agins2光电复合材料。
实施例5bi2wo6/agins2光电复合材料的制备：
（1）取3.0g硝酸铋溶于100ml、浓度为0.3m稀硝酸中得溶液a；取0.7g钨酸钠溶液溶于40ml水中，得溶液b；将a和b两溶液混合均匀后，用浓度为0.2m的氢氧化钠溶液调节ph至8.5，常温下搅拌24h后，转入高压反应釜中，在160oc下反应6h，反应结束后，自然冷却，产物用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，在40oc下真空干燥12h，制得bi2wo6纳米球；
（2）取0.03g硝酸银、0.3g乙酰丙酮铟、0.4ml油酸、9ml十八烯，四者混合得到溶液c，将0.025g硫粉溶解于2ml油胺中，得到溶液d，在氮气保护下将溶液c加热至130oc，快速将溶液d注射进溶液c中，反应2min后停止加热，冷却至室温，所得产物加入8ml巯基丙酸和2ml无水甲醇，离心后收集沉淀，在50°c下真空干燥12h，制得agins2量子点；
（3）将bi2wo6和agins2按照100:3的摩尔比混合，分散在5ml氯仿中，在氩气保护下250°c煅烧3h，得到bi2wo6/agins2光电复合材料。
实施例6bi2wo6/agins2光电复合材料的制备：
（1）取5.0g硝酸铋溶于100ml、浓度为0.5m稀硝酸中得溶液a；取1.0g钨酸钠溶液溶于50ml水中，得溶液b；将a和b两溶液混合均匀后，用浓度为0.2m的氢氧化钠溶液调节ph至8.5，常温下搅拌24h后，转入高压反应釜中，在200oc下反应8h，反应结束后，自然冷却，产物用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，在50oc下真空干燥14h，制得bi2wo6纳米球；
（2）取0.05g硝酸银、0.5g乙酰丙酮铟、0.5ml油酸、10ml十八烯，四者混合得到溶液c，将0.03g硫粉溶解于3ml油胺中，得到溶液d，在氮气保护下将溶液c加热至130oc，快速将溶液d注射进溶液c中，反应2min后停止加热，冷却至室温，所得产物加入10ml巯基丙酸和2ml无水甲醇，离心后收集沉淀，在60°c下真空干燥12h，制得agins2量子点；
（3）将bi2wo6和agins2按照100:3的摩尔比混合，分散在5ml氯仿中，在氩气保护下270°c煅烧5h，得到bi2wo6/agins2光电复合材料。
实施例7yyyhwrgwv-ab2溶液的制备：
在5ml、浓度为1mg/ml的yyyhwrgwv九肽溶液中加入10μl、浓度为0.01m1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基后，倒入1ml、浓度为10μg/ml的ab2溶液中，震荡20min,得到yyyhwrgwv-ab2溶液。
实施例8yyyhwrgwv-ab2溶液的制备：
在7ml、浓度为3mg/ml的yyyhwrgwv九肽溶液中加入10μl、浓度为0.01m1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基后，倒入1ml、浓度为10μg/ml的ab2溶液中，震荡20min,得到yyyhwrgwv-ab2溶液。
实施例9yyyhwrgwv-ab2溶液的制备：
在10ml、浓度为5mg/ml的yyyhwrgwv九肽溶液中加入10μl、浓度为0.01m1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基后，倒入1ml、浓度为10μg/ml的ab2溶液中，震荡20min,得到yyyhwrgwv-ab2溶液。
实施例10cyfra21-1的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的传感器为工作电极构成三电极系统，在10.0ml、ph=9.8的碳酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法进行检测，运行时间120s，光源波长为520nm；
（3）电极放置好之后，每隔20s开灯持续照射20s，检测光电流强度；
（4）采用不同浓度的cyfra21-1标准溶液进行测定，记录不同浓度的cyfra21-1标准溶液所对应的光电流值变化；
（5）利用工作曲线法，得到待测样品中cyfra21-1的浓度；
（6）测定样品中cyfra21-1的线性范围为10fg/ml~100ng/ml，检测限低至7.72fg/ml。