一种测定具有紫外吸收和荧光性质的农药残留量的方法与流程

本发明涉及农药残留测定技术领域，尤其涉及一种测定具有紫外吸收和荧光性质的农药残留量的方法。

背景技术：

目前，国内外对农产品中具有紫外吸收的农药一般采用液相色谱法，即采用液相色谱的紫外检测器（简称uv检测器）或二极管阵列检测器（简称：dad检测器））来检测，例如对多菌灵、吡虫啉、甲基硫菌灵等具有紫外吸收的农药残留采用液相色谱+紫外检测器的方法来检测。而对于农产品中具有荧光性质的农药一般采用液相色谱的荧光检测器(简称fld检测器)来检测。例如对涕灭威、克百威、甲萘威等具有荧光性质的农药残留采用液相色谱（含柱后衍生系统）+荧光检测器的方法来检测。然而如果要同时测定多菌灵和甲萘威等两大类农药残留量，现目前只有两种方式能实现：一是采用更精密的仪器，例如液相色谱串联质谱仪，但是该设备价格昂贵，且后续维护成本相当高，目前一般规模的实验室不具备这样的条件；二是必须同时采用两个标准方法、两种前处理，两次上机测定才能实现，操作复杂，费时费力。因此，研发一种测定具有紫外吸收和荧光性质的农药残留量的方法，成为本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明是为了解决上述不足，提供了一种同时测定农产品中具有紫外吸收和荧光性质的农药残留量的方法，实现简单快捷的测定农药残留量，节约成本。

本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现：一种测定具有紫外吸收和荧光性质的农药残留量的方法，包括以下步骤：

s1：制备待检测农药的上机液；

s2：将液相色谱仪的dad和fld检测器管路进行串联；

s3：将所述上机液置于改进后的液相色谱仪中进行检测。

进一步地，步骤s1中，制备待检测农药的净化液具体包括以下步骤：

s11：制备待检测农药的提取液，称取待检测的蔬菜或水果样品于高型烧杯或具塞锥形瓶中，加入乙腈，高速匀浆或恒温振荡后，转移至装有氯化钠的具塞量筒中，手摇振荡并静置，获得待检测农药的提取液；

s12：移取所述提取液于玻璃试管中，置于70℃水浴中用氮气吹至近干后，加入甲醇和二氯甲烷进行溶解，旋涡混匀获得溶解液，留置备用；

s13：将复合氨基柱安装到固相萃取装置中，用甲醇和二氯甲烷预淋洗固相萃取小柱，随后弃去淋洗液，当液面接近固相萃取小柱的填料时，关闭固相萃取装置的阀门，将玻璃试管放置于固相萃取装置中，用于接收样品净化液；

s14：将步骤s12中所述的溶解液转移到固相萃取小柱中，然后用甲醇和二氯甲烷分两次洗脱固相萃取小柱后获得所述待检测农药的样品净化液；

s15：将收集的所述样品净化液于50℃水浴中用氮气吹至近干，加入甲醇和水进行溶解，旋涡混匀，过0.22μm的滤膜，装入液相进样小瓶中（即：上机液）供液相色谱仪分析。

进一步地，步骤s2中，将液相色谱仪的dad和fld检测器管路进行连接，dad和fld用peek管peek接头以串联的方式连接，且样品从色谱柱分离后先接入dad检测器再流经fld检测器。

进一步地，所述peek管的内径为0.175mm。

本发明与现有技术相比的优点是：通过对现有设备进行改进，选用0.175mm内径的peek管，peek接头以串联的方式连接，且样品流路先流经dad检测器再流经fld检测器，实现了同时测定农产品中具有紫外吸收和荧光性质的农药残留量，显著降低了检测成本，操作简单方便，节约时间，非常适用于蔬菜和水果中具有紫外吸收和荧光性质的农药残留快速分析。

附图说明

图1是改进后液相色谱仪分析结果示意图。

图2是dad单独工作时的电路和流动相流程图。

图3是fld单独工作时的电路和流动相流程图。

图4是改进后dad和fld同时工作时的电路和流动相流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详述。

本发明中，需要测定的农产品样品中涉及到的蔬菜和水果分别采样于田间地头。样品收集后，经四分法缩分制备成匀浆状样品储存于-20℃冰柜冷冻保存。

对于待测定的检测样品而言，首先需要对样品进行制备处理。首先，称取蔬菜或水果样品（10.00±0.05）g于100ml高型烧杯或100ml具塞锥形瓶中，加入20.00ml乙腈，高速匀浆2min或恒温振荡30min，转移至装有3-4g氯化钠的25ml具塞量筒中，手摇振荡1min，静置30min。

准确移取10.00ml提取液于15ml玻璃试管中，于70℃水浴中用氮气吹至近干，加入2.0ml甲醇和二氯甲烷（体积比为5:95）溶解，旋涡混匀，备用。

将复合氨基柱安装到固相萃取装置中，用5ml甲醇和二氯甲烷（体积比为5:95）预淋洗固相萃取小柱，淋洗液弃去，当液面接近固相萃取小柱的填料时，关闭固相萃取装置的阀门，将15ml玻璃试管放置于固相萃取装置中，用于接收样品净化液。将上一步氮吹后的溶解液转移到固相萃取小柱中，然后用10ml甲醇和二氯甲烷（体积比为5:95）分两次洗脱固相萃取小柱。将收集的净化液于50℃水浴中用氮气吹至近干，加入2.50ml甲醇和水（体积比为1:1）溶解，旋涡混匀，过0.22μm的滤膜，装入液相进样小瓶中供液相色谱仪分析。

为了对上述待检测农药的上机液的制备方法进行验证，本发明采用6种标准样品进行了验证。其中具有紫外吸收的农药选取吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵为代表，具有荧光性质的农药选取涕灭威、克百威、甲萘威为代表，所有标准品购于农业部环境保护科研监测所。单标储备液的配制：各标准品分别用甲醇溶解于容量瓶中，配制成一定浓度的单标储备液；混合标准储备液：分别准确移取一定量的单标储备液于适量的容量瓶中，用甲醇定容。采用上述待检测农药的净化液的制备方法获得上机液供液相色谱仪分析后，dad上各农药的保留时间吡虫啉：10.970min，多菌灵：13.609min，甲基硫菌灵：15.800min；fld上各农药的保留时间涕灭威：15.190min，克百威：16.914min，甲萘威：17.443min。（如图1所示）。

另外，由于本发明中需要同时测定两种农药的残留量，所以需要针对样品前处理方法进行优化。对于提取方式的选择，本发明对比了两种不同提取方式：高速匀浆和恒温振荡。其中，高速匀浆提取2min和恒温振荡提取30min时，六种农药的回收率都控制在76.1%-98.6%之间，因此我们确定高速匀浆2min或恒温振荡30min作为该方法的提取方式。

高速匀浆提取时间与回收率关系

恒温空气浴振荡提取与回收率关系

本发明中比较了常用的有机提取溶剂对该方法提取效果的影响，用丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等四种有机溶剂的提取效果，发现，丙酮和乙腈的提取效果较好，回收率控制在78.9%-98.6%之间，乙酸乙酯次之，二氯甲烷效果最差，考虑到有机溶剂的挥发和毒性，因此确定乙腈为提取溶剂。

样品静置时间对有机相和水相两相分层效果有明显的影响，实验中记录了静置10min、20min、30min、40min、50min、60min时样品的添加回收率，实验表明，样品在静置10min后分层效果明显，30min后样品的添加回收率明显提升，因此确定静置时间为30min。

考虑到农产品的基质情况，主要是色素，蛋白质含量低，spe的选择以除色素为主，因此选用了复合氨基柱。spe小柱的填料的量对农药的检测影响也是比较大的，比较了市面上常见的（300mgcarbon+500mg氨基）/6ml和（500mgcarbon+500mg氨基）/20ml不同填料量对回收的影响，从性价比和有机溶剂的使用上来看，（300mgcarbon+500mg氨基）/6ml完全能满足要求，因此确定spe小柱为（300mgcarbon+500mg氨基）/6ml复合氨基柱。

同时比较不同的洗脱溶剂和体积对回收率的影响，确定洗脱溶剂为甲醇+二氯甲烷（体积比为5：95），洗脱体积10ml时能将目标物洗脱下来，因此确定洗脱方式为甲醇+二氯甲烷（体积比为5：95），分两次，每次5ml洗脱spe小柱。

将制备待检测农药的上机液供液相色谱仪进行分析。液相色谱仪中dad和fld检测器管路连接方式有串联和并联两种方法。采用并联的方式，两个检测器不干扰，相互不受影响，但采用这种方式在色谱柱后就必须添加昂贵的比例阀，精确控制流量分配到dad和fld上的比例，实际操作起来不方便，也不经济。实验中考虑到dad检测器是一个非破坏性检测器，流经dad检测器的样品结构和性质没有收到化学损坏，再将流出液引入到fld中进行荧光分析，这样既保证了dad检测的需要，又保证了fld检测的需要，也无需增加比例阀，因此确定了dad和fld之间采用串联的方式连接。同时，在实验中比较了不同规格的不锈钢管线和peek管线，从分析效果来看，管线内径太细，容易造成流动相在液相中堵的情况，管线内径过粗则会造成峰型拓宽不利于检测，因此确定0.175mm内径的管线为最佳内径管线。操作的简便性方面，peek管线和peek接头只需要手拧，无需借助任何工具，也不容易出现漏液情况,很好地解决了液相色谱“漏”的问题。因此，实验确定dad和fld用peek管peek接头以串联的方式连接，且样品从色谱柱分离后先接入dad检测器再流经fld检测器。

如图2、图3及图4所示，分别是dad单独工作时的电路和流动相流程图、fld单独工作时的电路和流动相流程图、dad和fld同时工作时的电路和流动相流程图。

为了验证整个方法的有效性，本发明在在最佳条件下，对6种农药标准品进行分析检测，5-400μg/l呈良好的线性关系,制得工作曲线回归方程、相关系数、线性范围、检出限。如下图表所示。

分别称取蔬菜和水果样品进行添加回收实验，添加水平涵盖高中低三个添加水平，添加量分别为0.025mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg，两大类6种农药残留的回收率在76.1%-98.6%之间，重复3次，测得rsd为5.7%-9.2%，说明添加回收和精密度符合残留分析要求。

实际样品分析，在基地随机抽取样品后，按照该方法对样品进行分析，同时与标准方法进行比对验证，实验数据符合比对要求，表明该方法适用于蔬菜和水果中具有紫外吸收和荧光性质的农药残留分析。样品分析结果如下图表所示。

本发明首先对检测样品进行净化获得净化液备用，随后对液相色谱仪进行适当改造，选用0.175mm内径的peek管，peek接头以串联的方式连接，且样品流路先流经dad检测器再流经fld检测器，随后对净化液进行测定，实现了同时测定农产品中具有紫外吸收和荧光性质的农药残留的方法。同时，针对该检测方法进行了验证，结果表明：该方法应用于蔬菜和水果中具有紫外吸收和荧光性质的农药残留检测是可行的，高中低三个水平添加实验的回收率和精密度均满足相关要求，且该方法能够同时测定两大类农药残留，具有省时快速的优点，非常适用于蔬菜和水果中具有紫外吸收和荧光性质的农药残留快速分析。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。