GDF1作为评估PD-1单抗治疗效果的生物标志物的制作方法

本发明属于肿瘤治疗领域，具体涉及一种评估pd-1单抗治疗效果的生物标志物。

背景技术：

免疫治疗是近年来发展最快的肿瘤治疗手段之一，其中某些特定的肿瘤受益于以程序性细胞死亡蛋白11(programmedcelldeathprotein1，pd-1)和/程序性细胞死亡蛋白配体-11(programmedcelldeathligand1,pd-l1)和细胞毒性t淋巴细胞抗原4(cytotoxictlymphocyteassociateprotein4,ctla-4)作为治疗靶点的免疫检查点抑制剂疗法，死亡率得以下降，为肿瘤病人带来了新希望。原发性肝癌（hepatocellularcarcinoma,hcc）是世界上高发的恶性肿瘤之一，早期诊断困难，预后差早期诊断困难，极易复发、转移，多数病人一经发现往往已经是病程晚期，失去手术治疗的机会。索拉非尼、瑞格菲尼和仑伐替尼在内的多激酶抑制剂是晚期、无法手术切除的肝癌临床治疗的首选，但是仅能极其有限地延长患者生存时间。近年来，程序性细胞死亡蛋白1（programmedcelldeathprotein1,pd1）单克隆抗体等免疫检查点抑制剂在肝癌治疗中显示出较好的效果，但仅有一小部分病人对此免疫疗法产生有反应，受众范围小。所以，目前尚无确切的判断指标指导临床用药。因此，迫切需要更多的生物标志物开发更加灵敏、高效的预测手段，并采取新的策略最大限度地提高治疗效果，以期免疫治疗更准确更大限度地惠及潜在的hcc患者。

gdf1（growthdifferentiationfactor1）是tgf-β超家族成员之一，位于染色体19p13.11，全长27593个碱基对。lee等最先从8.5天的小鼠胚胎cdna文库中分离得到gdf1基因，并检测到长度分别为1.4kb和3.0kb的两种转录物。长1.4kb的转录物在小鼠发育的早期阶段表达，于胚胎10.5天后消失，长3.0kb的转录物则是从一个双顺反子mrna翻译，这个双顺反子转录物包含了预计能编码372个氨基酸的gdf1编码区，自胚胎9.5天出现后贯穿整个胚胎发育全程，后期逐渐减少，在成体组织中很难检测到gdf1存在，仅在神经系统中特异性表达。对啮齿动物和囊胚动物的研究表明，gdf1能协同另一个重要的tgf-β超家族成员nodal参与早期胚胎发育中的左右不对称性的建，以及后期胚胎发育中的神经发育和心脏、大血管的发育。有研究发现gdf1基因多态性与先天性心脏病易感性显著相关，此外在大动脉转位和法洛氏四联症等模型中也检测到gdf1突，有研究表明gdf1导致某些特定类型的先天性心脏病发生，可能是通过减少tgf-β信号发挥作用的。gdf1信号异常也能通过nodal信号一齐作用导致心脏发育畸形。但是gdf1在肿瘤恶性发展及肿瘤细胞可塑性中的功能及机制还不明确。

随着靶向治疗和免疫治疗方法的逐渐成熟，研究者也发现了一些用于特定癌种的预测pd-1疗效的指标，如pd-l1表达水平、微卫星不稳(microsatelliteinstability,msi)、肿瘤突变负荷(tumormutationalburden,tmb)、t细胞浸润、hla(humanleukocyteantigen,人类白细胞抗原)多态性等。

对于免疫治疗的响应预测，这些常用的监测监测指标不尽如人意。如pd-l1表达水平，从临床应用来说，如果患者一线考虑免疫治疗，目前需要检测pd-l1。大量的研究证明pd-l1水平可以预测免疫治疗效果，但同时存在着一些研究证明无论pd-l1阴性或阳性，患者都可能从pd-1抗体治疗中获益，这表明pd-l1并不能很好预测免疫治疗的效果。此外，肿瘤具有高度异质性，肿瘤组织中包含不同遗传特性的肿瘤细胞亚群、间质细胞及浸润的免疫细胞，同一种肿瘤在不同的个体身上可表现出不一样的治疗效果及预后，同一个体不同部位的肿瘤细胞也存在不同的特性和差异。这就造成，以pd-l1免疫组化作为生物标志物存在一些缺陷——当采用细针穿刺活检等获得的小活检样本可能漏检某些肿瘤；患者个体的pd-l1表达水平可随时间的推移或解剖部位的不同而发生改变；既往治疗可能改变pd-l1的表达；某些抗体检测pd-l1表位可能不稳定；用于检测pd-l1的抗体具有不同的亲和力和特异性；pd-l1可表达于肿瘤微环境内的多种细胞类型。上述因素交织在一起，在一定的程度上影响了pd-l1预测免疫检查点抑制剂的疗效。此外活检作为一种有创检查，肿瘤细胞亦有可能沿着穿剌孔道种植转移。又比如肿瘤突变负荷(tmb)，是每百万碱基中被检测出的，体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。高tmb肿瘤，产生更多新抗原或新表位，从而更有效地激活t细胞引起免疫响应。但是它同样存在pd-l1作为免疫检查点抑制剂预测分子所面对的肿瘤异质性的问题。另一方面，这些检测手段对于绝大部分医院来说技术门槛比较高，需要借助于更加专业的检测平台，而各个机构对于tmb的定义、算法都有所争议，一项多机构进行的tmb一致性研究显示不同实验室之间变异较大，提示了tmb指标标准化的挑战。近期研究显示，tmb与疗效的相关性并不明确，tmb作为免疫治疗的疗效预测指标仍有所不足。

因此，迫切需要开发更加灵敏、高效的预测手段，最好是基于血液和组织的生物标志物，能够安全且有效评估患者的肿瘤免疫状态以实现肿瘤免疫治疗的精准诊断、精准分组、精准治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种能评估免疫治疗效果的生物标志物。为了实现本发明的目的，采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了生长分化因子1（growthdifferentiationfactor1,gdf1）在制备预测免疫治疗肿瘤效果的试剂中的应用。

进一步地，所述免疫治疗为pd-1单抗治疗。

进一步地，所述肿瘤为原发性肝癌。

第二方面，本发明提供了一种预测免疫治疗肿瘤效果的产品，所述产品包括检测生长分化因子1表达水平的试剂。

进一步地，所述产品为检测生长分化因子1的elsa试剂盒。

进一步地，所述elsa试剂盒包括检测生长分化因子1的抗体。

第三方面，本发明提供了一种预测免疫治疗肿瘤效果的生物标志物，所述标志物为生长分化因子1。

进一步地，生长分化因子1在正常器官中表达沉默，在肿瘤中过表达。

进一步地，所述免疫治疗为pd-1单抗治疗。

进一步地，所述肿瘤为原发性肝癌。

本发明的有益效果为：本发明为hcc的诊断和治疗提供一个理想的靶点。本发明研究发现，gdf1在大多数正常组织中保持低表达或无表达，在肿瘤中gdf1表达激活，且表达水平于与临床不良预后显著相关。本发明通过实验证明pd1抗体治疗gdf1高表达的肝癌患者效果更好，因此，gdf1可以作为hcc免疫治疗的一个预测指标，从而对肝癌患者进行pd1抗体治疗的效果提前预估。本发明还提供了使用elisa法检测血清中gdf1表达水平的方法，可通过elisa试剂盒直接判断肿瘤的恶性程度，以及预估患者对pd1单抗治疗的敏感性。elisa检测试剂盒能够定量检测患者血清中的gdf1蛋白量，操作简单方便，不存在指标的定义、算法争议，医院检验科也能成熟、独立开展。

附图说明

图1为gdf1在高分级、低分化hcc中高表达的示意图，其中a-b：hku-队列(a)和tcga队列(b)中gdf1在hcc及对应的癌旁非癌肝组织的表达水平；c：westernblotting检测gdf1在hcc和癌旁非癌肝组织中表达水平；d：免疫组织化学染色检测gdf1在hcc和癌旁非癌肝组织中表达水平；e：hcc组织芯片进行免疫组织化学染色检测gdf1在hcc中表达水平，在包含196例肝癌组织的hcc组织芯片进行免疫组织化学染色，结果显示gdf1在64.8%(127/196)的肿瘤组织中高表达(中等表达和强表达)；f-g：根据组织芯片临床数据分析gdf1的表达水平与hcc患者总生存率（f）和无病生存率（g）的相关性；h：为gtex公共数据分析gdf1在正常组织器官的表达水平示意图。bar:50μm，*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示p<0.001;****表示p<0.0001。

图2为gdf1过表达促进hcc细胞体内外转移能力的示意图，其中a-b:transwell实验检测gdf1过表达对plc-8024及huh7细胞迁移及侵袭能力的影响；c：裸鼠脾内注射肝转移实验检测过表达gdf1对hcc细胞的体内转移能力的影响；d、e：gdf1蛋白对肿瘤细胞迁移和侵袭的免疫组化染色结果；f：为小鼠的肝脏表面转移结节数和镜下肺转移结节数；g：为对小鼠肝脏和肺进行he染色结果，bar=200µm。*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示p<0.001;****表示p<0.0001。

图3为gdf1激活hcc广泛表达癌-睾丸抗原的示意图，其中a:多个癌-睾丸抗原家族成员在差异表达基因中富集；b-c:qrt-pcr实验检测过表达gdf1对肝癌8024细胞（b）和huh7细胞（c）癌-睾丸抗原家族成员表达的影响；d：qrt-pcr实验检测与8024-gdf1共培养15d对8024细胞癌-睾丸抗原家族成员表达的影响；e：qrt-pcr实验检测外源性添加人重组蛋白rgdf1(50ng/ml)处理15d对8024细胞癌-睾丸抗原家族成员表达的影响；f：westernblotting实验检测gdf1过表达细胞中代表性癌-睾丸抗原家族成员gage12e的表达；h：免疫组织化学染色检测皮下异种移植瘤和脾内注射肝转移瘤中代表性癌-睾丸抗原家族成员gage12e的表达；g：geo（gse78220）公共数据分析被gdf1激活的ctas在转移性黑色素瘤pd1抗体不同疗效组中的表达。bar=50µm，*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示p<0.001。

图4为gdf1可促进cd8+t细胞在肝癌的局部浸润，增强pd1抗体治疗的敏感性示意图，其中a:tcga数据分析显示gdf1在免疫应答激活型hcc中的表达显著高于耗竭组和无应答组；b：构建稳定转染小鼠全长gdf1的且携带荧光素酶标记的小鼠肝癌细胞系hepa1-6细胞株，将其注入到免疫活性强的c57bl/6小鼠脾脏中，并用活体成像跟踪肿瘤在动物体内的生长和转移,当荧光信号强于105p/sec/cm2/sr时，将小鼠随机分成2组给药治疗(共四组)：腹腔注射(i.p.)100ug/只anti-pd1或igg2aisotypecontrol，每3天一次。给药期间，活体成像系统持续监测小鼠体内肿瘤转移情况，每2天一次结果显示hepa1-6gdf1组的pd1抗体抑制率明显高于对照组；c：kaplan–meier分析hepa1-6ctr和hepa1-6gdf1脾内注射肝转移模型小鼠给予pd1抗体或igg治疗后的总生存率，gdf1促进转移的特性导致c57bl/6小鼠预后极差，但pd1抗体治疗可显著逆转这一恶性进展，并显著延长携带gdf1过表达肿瘤的c57bl/6小鼠的总生存率；d：分别对各组小鼠肝脏转移瘤进行细胞毒性t细胞的标志物cd8和gzmb蛋白的免疫组化染色，结果显示经pd1抗体治疗后，由gdf1转染的小鼠肿瘤中浸润的cd8+/gzmb+t淋巴细胞明显增多；e-f：连续的组织芯片切片进行免疫组织化学染色检测gdf1和浸润性cd8+t细胞在hcc中表达相关性，高浸润性cd8+t淋巴细胞的存在显著延长了gdf1高表达hcc患者的总体生存率（e）和无病生存率（f）；g：肝癌组织中gdf1和cd8表达的代表性免疫组化染色；h-i：gdf1与cd8表达水平相关性分析显示在hcc患者中，gdf1与cd8表达显著正相关；j:tcga公共数据分析cd8和gdf1表达水平与hcc患者总体生存期的相关性，结果显示在没有/缺乏cd8+t淋巴细胞浸润的情况下，gdf1高预示着hcc患者的不良预后，而高浸润性cd8+t淋巴细胞的存在则显著延长了gdf1高表达hcc患者的总体生存率和无病生存率。bar=50µm，*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示p<0.001;****表示p<0.0001。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1发现gdf1在正常器官中gdf1表达沉默，在hcc患者肿瘤中gdf1高表达

发明人发现gdf1（growthdifferentiationfactor1,生长分化因子1）在大多数正常器官中gdf1表达沉默，肝癌中gdf1的激活可能为hcc（hepatocellularcarcinoma,原发性肝癌）治疗提供理想的靶点（图1）。gdf1的过表达强烈地促进了肿瘤在体内外的扩散（图2），通过进一步的高通量转录组测序技术，我们发现gdf1可显著激活一系列癌-睾丸抗原（cancertestisantigen,cta）的表达（图3a-f），geo数据分析表明ctas再激活与pd1抗体疗效有关（图3g），因此推测gdf1高表达可能与pd1抗体疗效有关。为了检测gdf1在hcc免疫应答中的意义，根据一项最新的研究报道的分类方法（doi:10.1053/j.gastro.2017.06.007），我们将tcga-lihc项目的hcc患者分为3个亚型（免疫应答激活型，免疫应答耗竭型，无免疫应答型），分析发现gdf1和反映肿瘤浸润的细胞毒性t细胞表面标记物cd8的表达在免疫应答激活组中明显高于免疫耗竭组和其他非免疫组（图4a），进一步动物实验和hcc患者临床资料分析均表明gdf1与浸润性cd8+细胞毒性t细胞显著相关，gdf1高表达的肿瘤具有与浸润性cd8+细胞毒性t细胞显著相关对pd-1单抗治疗更好的疗效（图4b-g），因此提示gdf1可能是有效的免疫应答的指标，gdf1高表达的hcc患者更适宜pd-1单抗治疗。

实施例2采用酶联免疫吸附试验(elisa)法检测gdf1

gdf1是一种分泌蛋白，酶联免疫吸附试验(elisa)法可用于检测血清、组织中gdf1的表达，预测hcc患者的pd1单抗治疗效果

目前我们已有的证据是：1.gdf1过表达可以显著上调肿瘤睾丸抗原（cta）的表达，而cta的表达在很多肿瘤中已被发现与pd1单抗治疗敏感性密切相关；2.相对于对照组，gdf1过表达的荷瘤小鼠对pd1单抗治疗更敏感；3.在gdf1高表达肿瘤病人群体中，杀伤性免疫细胞浸润可显著区分病人的生存预后；而在gdf1低表达肿瘤病人群体中，杀伤性免疫细胞浸润则无法显著区分病人的生存预后。这间接提示gdf1在肿瘤病人能否获得有效免疫应答中起关键作用；4.由于目前尚无公开的pd1单抗治疗hcc的大规模临床数据，因此无法直接获取gdf1表达水平与pd1单抗治疗效果的相关数据。但我们在其他有公开发表数据的经pd1单抗治疗的肿瘤病人（黑色素瘤等）中发现，gdf1在完全应答组中的表达水平显著高于部分应答组及无应答组（图3g）。此外，我们还根据已报到文献的分类方法将hcc病人分成免疫激活组和免疫耗竭组，发现gdf1的表达在免疫激活组显著升高（图4a）。5.由于我们目前缺乏足够的临床标本及数据来界定血液中gdf1高/低表达的划分阈值，所有的gdf1在hcc中高/低表达的划分均参照免疫组织化学标准评分（图4e-j）

酶联免疫吸附试验(以下简称elisa)：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的elisa法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。目前市面上已有较为成熟的检测人gdf1的试剂盒，该类试剂盒基于夹心酶联免疫吸附试验技术。检测样本可以是血清、血浆、组织匀浆、细胞培养物上清或其他生物样本。往预先包被人gdf1捕获抗体的包被微孔中，依次加入检测样品、标准品、亲和素标记过的hrp，经过温育并彻底洗涤。用底物tmb（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）显色，tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人gdf1蛋白呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（od值），计算样品浓度。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。