一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法与流程

本发明属于细胞染色技术领域，尤其涉及一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法。

背景技术：

梨是我国重要落叶果树之一，栽培历史悠久、分布广泛、资源丰富。石细胞是木质素在梨果实薄壁细胞的细胞壁上沉积引起细胞壁发生次生加厚而形成的，梨石细胞的含量是梨果实品质的一个决定性因素。因此，研究梨石细胞的形态、分布及组织定位意义重大。

前期研究表明，梨石细胞形成过程是一个细胞程序性死亡的过程，细胞发生凋亡的时期与活性氧的积累密切相关，而活性氧在木质素聚合和沉积过程中起关键作用。植物nadph氧化酶，又称呼吸爆发氧化酶(rboh)，它催化o2和nadph产生o2^-、nadp⁺和h⁺，随后o2^-可作为超氧化物歧化酶(sod)的底物催化生成h2o2和o2。h2o2和o2分别作为过氧化物酶(pod)和漆酶(lac)的第二底物参与木质素单体聚合。最后，pod和lac活化木质素单体自由基，使其聚合形成木质素。由此推测，活性氧在梨果实中可能仅在石细胞中大量积累,通过对活性氧进行染色，从而对石细胞进行定位。

目前常规的wiesner法都只是对木质素进行染色，这使石细胞以及果皮、果肉、果核、果柄等部位的木质素都会被染色，造成背景干扰。这种染色方法，不但容易褪色、成本高，而且使用的试剂如：浓盐酸、浓氨水、高锰酸钾等都属于危化品，一旦吸入对呼吸道等部位损害严重，不小心接触到会灼伤皮肤，腐蚀皮肤，而且强酸强碱也会加速梨果肉褐化。因此，需要一种准确、简便、快速、安全、特异性强的方法定位梨果实石细胞。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法，包括以下步骤：

1)将梨果实在维生素c溶液中切片，得到梨果实片；

2)将所述步骤1)得到的梨果实片淹没在染色反应溶液中2～5h，得到浸泡梨果实片；

所述染色反应溶液的组分包括二氨基联苯胺或硝基四氮唑；

3)将所述步骤2)得到的浸泡梨果实片脱色剂脱色后，经固定液封片。

优选的，所述步骤2)染色反应溶液中二氨基联苯胺的浓度为0.4～0.6g/l。

优选的，所述步骤2)染色反应溶液中硝基四氮唑的浓度为0.4～0.6g/l。

优选的，所述步骤2)浸泡在避光条件下进行。

优选的，所述步骤1)维生素c溶液中维生素c的浓度为0.04～0.06g/l。

优选的，所述步骤1)梨果实片的厚度为2～4cm。

优选的，所述步骤3)脱色剂包括甘油溶液和乙醇溶液，所述甘油溶液和乙醇溶液的体积比为1:1，所述甘油溶液的体积百分含量为30％，所述乙醇溶液的体积百分含量为70％。

优选的，所述步骤3)固定液包括faa固定液。

优选的，所述步骤2)浸泡的温度为21～26℃。

优选的，所述步骤3)脱色的温度为21～26℃。

本发明提供了一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法，包括以下步骤：1)将梨果实在维生素c溶液中切片，得到梨果实片；2)将所述步骤1)得到的梨果实片淹没在染色反应溶液中2～5h，得到浸泡梨果实片；所述染色反应溶液的组分包括二氨基联苯胺或硝基四氮唑；3)将所述步骤2)得到的浸泡梨果实片经脱色剂脱色后，经固定液封片。

本发明的有益效果：

1.本发明可以有效地观察到石细胞的形态结构、分布和定位。

2.本发明区分度高，能准确、方便、有效的区分梨果肉薄壁细胞和石细胞。

3.本发明安全系数高，不涉及危化品，没有刺激性气味，对人体不会造成危害。

4.本发明在维生素c溶液中对梨果实进行切片，可以有效地减轻褐化现象，防止显色颜色干扰。能够高效观察石细胞发育过程形态结构特征并可区分石细胞含量及大小不同梨品种。

5.本发明为梨果实石细胞特异性组织化学定位提供了一种分析结果准确、分析速度高效、染色结果稳定、操作简便、重现性好、反应灵敏、特异性强的方法，而且成本低，二氨基联苯胺和硝基四氮唑每次用量只需4～6毫克。

附图说明

图1为实施例1的染色结果；

图2为实施例2的染色结果；

图3-1为实施例3梨果实未染色的观察结果；

图3-2为实施例3的染色结果，从左至右依次为二氨基联苯胺处理的砀山酥梨、良梨早酥；

图3-3为实施例3的染色结果，从左至右依次为硝基四氮唑处理的砀山酥梨、良梨早酥。

具体实施方式

本发明提供了一种梨果实石细胞特异性组织化学定位的方法，包括以下步骤：1)将梨果实在维生素c溶液中切片，得到梨果实片；2)将所述步骤1)得到的梨果实片淹没在染色反应溶液中2～5h，得到浸泡梨果实片；所述染色反应溶液的组分包括二氨基联苯胺或硝基四氮唑；3)将所述步骤2)得到的浸泡梨果实片脱色剂脱色后，经固定液封片。

在本发明中，所述维生素c溶液中维生素c的浓度优选为0.04～0.06g/l，更优选为0.05g/l。在本发明中，所述维生素c可以有效地减轻梨果实在切片过程中的褐化现象。

在本发明中，所述梨果实片的厚度优选为2～4cm。

在本发明中，所述染色反应溶液中二氨基联苯胺的浓度优选为0.4～0.6g/l，更优选为0.5g/l。在本发明中，所述染色反应溶液中硝基四氮唑的浓度优选为0.4～0.6g/l，更优选为0.5g/l。在本发明中，用二氨基联苯胺或硝基四氮唑浸泡梨果实切片，可以高效特异性地对石细胞进行染色。

在本发明中，所述浸泡的时间为2～5h。在本发明中，所述浸泡的温度优选为21～26℃。在本发明中，由于浸泡溶液的组分见光易分解，因此浸泡优选在避光的条件下进行。

在本发明中，所述脱色剂包括甘油溶液和乙醇溶液，所述甘油溶液和乙醇溶液的体积比优选为1:1，所述甘油溶液的体积百分含量优选为30％，所述乙醇溶液的体积百分含量优选为70％。在本发明中，所述脱色的温度优选为21～26℃。

在本发明中，所述固定液包括faa固定液，本发明对所述faa固定液的组分和含量没有特殊限定，采用本领域常规使用的即可。

本发明对封片后的切片采用常规观察方法观察切片即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

二氨基联苯胺-石细胞特异性组织化学定位法

将梨果实放在0.05g/l的维生素c溶液中进行切片(切片的厚度为3cm)，然后将梨果实切片淹没在浓度为0.5g/l的二氨基联苯胺溶液中，转移至光照培养箱内浸泡暗培养4h(试剂见光易分解)，温度调至24℃，脱色剂进行脱色漂洗，用faa固定液封片再普通光学显微镜显微观察，染色结果如图1所示。其中脱色剂为甘油溶液和乙醇溶液，甘油溶液和乙醇溶液的体积比为1:1，甘油溶液的体积百分含量为30％，乙醇溶液的体积百分含量为70％。

从图1中可以看出，石细胞全部染成红褐色与周围的果肉和薄壁组织等形成鲜明的对比。

实施例2

硝基四氮唑-石细胞特异性组织化学定位法

将梨果实放在0.05g/l的维生素c溶液中进行切片(切片的厚度为3cm)，然后将梨果实切片淹没在浓度为0.5g/l的硝基四氮唑溶液中，转移至光照培养箱内浸泡内暗培养4h(试剂见光易分解)，温度调至24℃，脱色剂进行脱色漂洗，用faa固定液封片观察，染色结果如图2所示。其中脱色剂为甘油溶液和乙醇溶液，甘油溶液和乙醇溶液的体积比为1:1，甘油溶液的体积百分含量为30％，乙醇溶液的体积百分含量为70％。

从图2中可以看出，石细胞被染成蓝灰色，周围的果肉和薄壁组织等全染成蓝紫色，对比非常明显。

实施例3

对砀山酥梨和良梨早酥两种梨石细胞特异性组织化学定位对比

将砀山酥梨果实和良梨早酥果实分别放在0.05g/l的维生素c溶液中进行切片(3cm)，然后将梨果实切片分别淹没在浓度为0.5g/l的二氨基联苯胺溶液和硝基四氮唑溶液中，转移至光照培养箱内浸泡暗培养4h(试剂见光易分解)，温度调至24℃，脱色剂进行脱色漂洗，用faa固定液封片观察，染色结果如图3-2和图3-3所示。其中脱色剂为甘油溶液和乙醇溶液，甘油溶液和乙醇溶液的体积比为1:1，甘油溶液的体积百分含量为30％，乙醇溶液的体积百分含量为70％。

从图3-2和图3-3中可以得出，砀山酥梨石细胞含量明显高于良梨早酥。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。