文昌鱼感染细菌的蛋白标记物及其应用的制作方法

本发明涉及文昌鱼响应细菌感染的功能蛋白质组的生物标记物及其应用，属于生物标记物技术领域。

背景技术：

蛋白质组(proteome)的概念最先由marcwilkins提出，指由一个基因组(genome)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(protein)。蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制。

文昌鱼是文昌鱼属(branchiostoma)动物的总称，又称蛞蝓鱼。脊索动物，文昌鱼纲，文昌鱼目，文昌鱼科。长约50mm。形似小鱼，无头，两端尖细。体侧扁，半透明，脊索贯穿全身。前端有眼点。口藏于口笠内，口笠边缘有38～50条缘膜触手。具背、臀和尾鳍。腹部有1对腹褶。雌雄异体，生殖腺左右成对排列。栖息于疏松沙质海底，常钻在沙内，仅露出前端，滤食硅藻及小型浮游生物。春末夏初繁殖，幼鱼经短暂浮游期后即钻入沙中成长。分布于中国河北东部、青岛、烟台、厦门、合浦沿海。文昌鱼是无脊椎动物进化至脊椎动物的过渡类型，也是研究脊索动物演化和系统发育的优良科学实验材料，具重要科学价值。

文昌鱼作为古代脊索动物谱系的幸存者，是比较基因组、蛋白质组研究的模式生物。然而，调节文昌鱼响应细菌感染免疫应答相关的蛋白质组在很大程度上尚不清楚。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了文昌鱼响应细菌感染的功能蛋白质组的生物标记物，及其在检测文昌鱼感染细菌中的应用。本发明采用2-de结合maldi-tof/tof质谱分析技术分离鉴定经金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌感染和免疫后文昌鱼体液的差异表达蛋白，通过模式识别方法揭示其变化规律，旨在揭示文昌鱼应答细菌感染的蛋白质组机制。

本发明是通过以下技术方案实现的：

文昌鱼感染细菌的蛋白标记物，包括cavpt、scp、cavp和ck。

所述细菌为革兰氏阳性细菌或/和革兰氏阴性细菌。

所述革兰氏阳性细菌选自金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性细菌选自副溶血弧菌。

所述文昌鱼感染细菌的蛋白标记物在检测文昌鱼感染细菌中的应用(非诊断目的)。

所述文昌鱼感染细菌的蛋白标记物在制备用于检测文昌鱼感染细菌的检测试剂盒中的应用。

一种非诊断目的文昌鱼感染细菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测文昌鱼的体液，提取其中的蛋白；

(2)用蛋白质组学方法检测cavpt、scp、cavp和ck四种蛋白的含量，并与正常未感染细菌的文昌鱼的体液中这四种蛋白的含量相对比，所得对比结果可以用于辅助判断文昌鱼是否感染细菌，判断标准为：若：cavpt上调表达，cavp和scp下调表达，ck下调表达，则表明该待检测文昌鱼感染细菌。

本发明通过实验研究发现，cavpt、scp、cavp和ck四种蛋白质在文昌鱼先天免疫反应中起着极其重要的功能，可以用于蛋白质组功能的研究、文昌鱼感染细菌的检测等。本发明对文昌鱼响应细菌感染免疫应答相关的蛋白质组的研究具有重要的参考价值。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：攻毒和免疫后的文昌鱼体液2-de图谱，其中，a：注射生理盐水对照；b：金黄色葡萄球菌感染；c：副溶血弧菌感染；d：金黄色葡萄球菌免疫；e：副溶血弧菌免疫。

图2：差异点局部放大图。

图3：差异点丰度百分比柱状图，其中，a：小于0.7；b：0.7-1.4；c：1.4-5.5；d：大于6。

图4：生物标志物的pca模式识别，其中，a：文昌鱼感染和免疫革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、阴性细菌副溶血弧菌活菌、灭活菌后体液蛋白样品蛋白表达水平上的等级聚类分析；b：对照组和4个试验组pls-da分析的结果；c：显著差异表达的蛋白点的pca分析结果；d：显著差异表达的蛋白点的opls-das-plot分析结果。

图5：免疫基因的克隆、表达及重组蛋白抗血清的制备，其中，a：文昌鱼总rna；b：基因cavpt和scp的pcr扩增图；c：重组载体cavpt-c2x和scp-c2x的双酶切图谱；d：重组载体cavpt-c2x的表达和蛋白纯化；e：重组载体scp-c2x的表达和蛋白纯化；f：cavp、cavpt及scp抗血清的检测。

图6：差异蛋白的westernblotting验证，其中，a：westernblotting分析验证cavpt、ck、cavp和scp响应细菌感染或免疫的蛋白表达水平变化；b：2-de图谱中cavpt、ck、cavp和scp总丰度值柱状图。

图7：westernblotting研究肠cavpt和ck响应文昌鱼免疫后攻毒的蛋白表达水平，其中，a：溶血性链球菌免疫后同质溶血性链球菌攻毒；b：溶血性链球菌免疫后异质副溶血弧菌攻毒；c：副溶血弧菌免疫后同质副溶血弧菌攻毒；d：副溶血弧菌免疫后异质溶血性链球菌攻毒。imm，免疫；cha，攻毒。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实验1文昌鱼应答细菌感染的蛋白质组学研究

本研究采用2-de结合maldi-tof/tof质谱分析技术分离鉴定经金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌感染和免疫后文昌鱼体液的差异表达蛋白，通过模式识别方法揭示其变化规律，旨在揭示文昌鱼应答细菌感染的蛋白质组机制。

1.1细菌感染和免疫对文昌鱼生存的影响

为研究文昌鱼对不同细菌感染的应答机制，本文选取金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)和副溶血弧菌(革兰氏阴性细菌)等两种病原细菌注射文昌鱼，且每种病原细菌进行活菌注射和灭活菌注射。其中，活菌用量为2×10⁵cfu/条，灭活菌采用2×10⁷cfu/条的剂量进行注射，对照组为注射同等体积的无菌生理盐水。

细菌感染和免疫后，观察各试验组文昌鱼生存情况。结果发现，随着时间的延长，注射活菌的文昌鱼出现受伤现象，注射48h后全部受伤并濒临死亡；而注射灭活菌的文昌鱼与对照组并无明显外观差异，且均未出现受伤现象。注射后48h的生存情况见表1，其中，注射活菌感染的两个组文昌鱼死亡率为100％，而对照组和注射灭活菌免疫的两个组文昌鱼死亡率为0。

文昌鱼体液取样时间为注射细菌后约48h，活菌感染的两组文昌鱼为受伤的垂死状态，灭活菌感染的两组文昌鱼和生理盐水对照组文昌鱼并无受伤现象。

表1同细菌感染对文昌鱼生存的影响

1.2文昌鱼对细菌感染和免疫的体液应答的功能蛋白质组学研究

1.2.1体液差异蛋白质的分离鉴定

各取300μg文昌鱼体液蛋白进行2-de分离，每组设3个生物学重复。

细菌感染文昌鱼后的体液蛋白2-de图谱见图1，考马斯亮蓝g-250染色共得到约150个蛋白点，采用melanietrialversion软件定量分析共检测出可重复显著变化1.5倍以上的差异点41个。图2显示差异蛋白的局部放大图。差异蛋白按丰度值百分比将其分为4组：丰度值百分比分别为小于0.7(图3a)、0.7-1.4(图3b)、1.4-5.5(图3c)，大于6(图3d)。对差异点进行maldi-tof-tof质谱鉴定共得到19种蛋白质：包括creatinekinase(ck)(1-13号)、brafldraft_217557(14号)、brafldraft_290854(15号)、brafldraft_56698(16,17号)、brafldraft_114976(18号)、actin(19号)、brafldraft_60745(20号)、adenosylhomocysteinase(21号)、brafldraft_107090(22号)、brafldraft_124511(23号)、brafldraft_97033(24号)、glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase(25号)、cavpt(26-35号)、cysteineproteinase(36号)、triosephosphate(37号)、fattyacidbindingprotein(38号)、brafldraft_124917(39号)、scp(40号)、cavp(41号)。

其中，1-13号十三个蛋白点均为肌酸激酶(ck)，而26-35号十个蛋白点为钙离子通道蛋白受体cavpt。这两个蛋白在2-de凝胶上出现多个蛋白点可能是蛋白修饰的结果，包括磷酸化和去磷酸化、乙酰化、甲基化等。aksenov等(aksenovetal.2000)和valdur等(valduretal.2005)分别报道了阿尔茨海默氏症病人的脑组织和小鼠心脏线粒体ck能被氧化磷酸化；takagi等(takagietal.1990)研究发现文昌鱼的cavpt蛋白包含1个潜在的asn连接的糖基化位点、4个潜在的蛋白激酶c磷酸化位点和2个酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位点，表明该蛋白易发生糖基化、磷酸化等修饰作用。

1.2.2差异蛋白质组的模式识别分析

虽然先天免疫反应的研究已经取得很大的进展，但是目前我们对其的了解仍然不全面。在本发明中，我们将文昌鱼的先天免疫反应归结为一组功能蛋白质。不同的细菌种类(革兰氏阳性细菌、阴性细菌)、同种细菌对宿主不同的感染状态(攻毒或免疫，活菌或灭活菌)使得文昌鱼先天免疫反应的功能蛋白质组进行不同的模式识别。因此，运用差异蛋白质组学与模式识别相结合的方法进行功能蛋白质生物靶标的确认，这些作为生物靶标的功能蛋白质在文昌鱼受到革兰氏阳性细菌、阴性细菌的活菌、灭活菌感染时被先天免疫反应系统所调节。

当宿主和病原细菌相互作用的时候，出现两种结果：宿主的免疫力将病菌杀死，或者病原细菌大量繁殖将宿主感染。而当文昌鱼被活菌感染的时候，就不可避免发生死亡，但是还有一种可能，宿主接种灭活细菌则可能获得免疫力。不同的细菌种类(革兰氏阳性细菌、阴性细菌)、同种细菌对宿主不同的感染状态(活菌或灭活菌)导致宿主功能蛋白质具有不同的模式识别。接下来采用pca(princicalcomponentanalysis)模式识别的方法进行研究，它是一种非监督模式的分析方法(wang等,2012b)，包括热图，pca，pls-da(偏最小二乘法投影关联分析)和opls-da(正交偏最小二乘投影判别分析)，集成研究分析文昌鱼响应不同状态的两种病原菌感染的功能蛋白质。我们首先将41个差异表达的蛋白点进行了等级聚类(hierarchicalclustering,hcl)。任一种模式下蛋白表达水平均发生改变，使用pearson相关性作为距离度量进行聚类。聚类图表明蛋白点和试验组是如何分开的，或者说是如何聚类的。顶部是蛋白点，右侧是试验组样品。同种蛋白质的不同蛋白点由于响应不同种细菌或不同类型细菌的侵袭而有可能聚不到一起。由r软件聚类的热图(图4a)可以看出，受两种活菌感染的两组体液蛋白样品聚类在一起，两种灭活菌免疫的两组体液蛋白样品聚类在一起，每个试验组的三个生物学重复聚类在一起，这一结果说明文昌鱼对于细菌的状态的模式识别更为强烈。opls统计模型是一款基于监督模式的生物学分析软件，用来凸显41个差异点中重要的生物标志物(bio-marker)。采用opls-da分析模型将包括对照组在内的5个组明确分开在了4个象限内(图4b)，一个数据点代表一个组，显示各组间有着显著差异。进一步对差异蛋白进行pca分析，结果显示cavpt、scp、cavp及ck四种蛋白的权重依次递减(图4c)。为了鉴别可以进行模式识别的重要蛋白质，s-plot里用p(1)0.05和p(corr)(1)0.5双重界定。s-plot用p(1)和p(corr)(1)绝对值的高或低来代表其在5个组别模式识别中的相关性，绝对值越大，则越相关。我们从s-plot得到cavpt(26号、32号、34号点)、scp(40号点)、cavp(41号点)及ck(4号、5号点)(图4d)。结果说明cavpt、scp、cavp及ck四种蛋白质在文昌鱼先天免疫反应中起着极其重要的功能，可以作为文昌鱼响应细菌感染的功能蛋白质组的生物标志物。

1.3关键差异蛋白的westernblotting验证

1.3.1抗血清的制备

为了验证所获得生物标志物的蛋白表达，我们采用westernblotting检测cavpt、scp、cavp及ck在文昌鱼感染细菌体液蛋白样品中的蛋白表达水平的变化。ck抗体是实验室保存的，cavp已经被克隆，只需重新纯化、免疫即可。因此，需构建cavpt及scp的重组质粒。表2是引物信息。

因此提取文昌鱼总rna(图5a)，将cavpt及scp克隆(图5b)，连接至穿梭载体c2x从而构建重组质粒(图5c)，转化进大肠杆菌工程菌株tb1进行融合表达，载体的融合蛋白为40kda(cavpt的融合表达蛋白约为66kda,scp的融合表达蛋白约为61kda)，并通过amylose亲和层析柱进行重组蛋白的纯化(图5d，e)，纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。将文昌鱼体液page后转nc膜，每个泳道裁成条，得到的抗血清加入该膜条，采用westenrblotting检验抗血清的效价及特异性，结果显示，抗体显色位置准确无误，特异性较好，仅scp在35kda处有杂带，但是距离目的带21kda处较远(图5f)，结果说明制备的cavp、cavpt及scp抗体可以用于免疫相关蛋白的验证。

表2文昌鱼基因克隆信息

1.3.2体液关键差异蛋白含量变化的检测

前期试验发现cavpt、scp、cavp及ck四种蛋白可能在文昌鱼先天免疫反应过程中具有重要的作用，可以作为文昌鱼响应细菌感染的功能蛋白质组的生物标志物(bio-markers)。因此，进一步采用westernblotting分析细菌感染对文昌鱼体液四种蛋白质的影响。

收集细菌感染的文昌鱼体液蛋白，进行样品编号：(1)生理盐水对照组(con)；(2)金黄色葡萄球菌活菌感染组(sa-inf)；(3)溶血性链球菌活菌感染组(sh-inf)；(4)副溶血弧菌活菌感染组(vp-inf)；(5)金黄色葡萄球菌灭活菌免疫组(sa-imm)；(6)溶血性链球菌灭活菌免疫组(sh-imm)；(7)副溶血弧菌灭活菌免疫组(vp-imm)，westernblotting分析bio-markers蛋白表达量的变化。结果发现，活菌感染导致cavpt上调表达，而灭活菌免疫后文昌鱼cavpt蛋白表达相比活菌感染组明显下调表达；cavp和scp的表达变化正好反，活菌感染后下调表达，而灭活菌免疫后上调表达；ck在细菌无论是感染还是免疫后均下调(图6a)。图6b是2-de图谱中ck、cavpt、scp及cavp的丰度值柱状图，其westernblotting的结果与在2-de的蛋白表达变化是普遍一致的。这些结果进一步证实cavpt、ck、scp及cavp在文昌鱼先天免疫反应过程具有重要的作用。

1.3.3细菌免疫攻毒对文昌鱼生存的影响

如上所述，当宿主和病原细菌相互作用的时候会出现两种结果：宿主免疫力将细菌杀死，或者细菌繁殖将宿主感染。但是当宿主接种灭活菌的时候，细菌已经没有毒性及繁殖力，可能反而增强宿主对细菌的免疫力。文昌鱼免疫灭活细菌后再注射活菌感染的过程称为攻毒(challenge,cha)。首先将灭活的革兰氏阳性细菌溶血性链球菌、阴性细菌副溶血弧菌注射免疫文昌鱼，免疫72h后注射同种及异种细菌感染攻毒，48h后统计死亡率，并且收取各组文昌鱼肠道及体液蛋白样品。结果如表3所示，文昌鱼注射灭活细菌免疫后，再次用同种或异种细菌攻毒时，死亡率较对照非免疫组显著降低，说明灭活菌对文昌鱼有显著的免疫保护，且同种细菌免疫攻毒免疫相对保护率更高。在革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌中都是如此。可能是由于文昌鱼的先天免疫系统对最先进入体内的灭活细菌有了一定的免疫反应和识别，当同种细菌再次进入体内的时候文昌鱼的免疫反应更为强烈，并显著增强，而异种细菌再次进入体内的时候先天免疫反应对其的识别没有对同种细菌来的清晰，识别强度不够，所以导致文昌鱼对异种病原菌攻毒的抵抗能力低。

无论是同种细菌攻毒还是异种细菌攻毒都将文昌鱼分为健康生存的文昌鱼和受伤垂死的文昌鱼两种，而免疫后注射生理盐水对照组文昌鱼都是健康的生存状态。各组文昌鱼在解剖镜下取得肠道后，再切段浸提体液。健康生存的文昌鱼肠道无异样，受伤的个体肠道发生不同程度溃烂，鳃发黑松散，肌肉糜烂，严重者连同肝盲囊轻微溃烂。

表4文昌鱼免疫后攻毒的结果(**p小于0.01，差异极显著)

1.4关键差异蛋白肠含量变化的检测

文昌鱼革兰氏阳性细菌溶血性链球菌、阴性细菌副溶血弧菌免疫后进行同种细菌、异种细菌的攻毒，均有免疫保护现象的发生，且对同种细菌的免疫保护率高于异种细菌。将文昌鱼免疫后攻毒的肠蛋白样品分组编号：(8)溶血性链球菌免疫后同种溶血性链球菌攻毒健康组(sh-imm-homo-h)；(9)溶血性链球菌免疫后同种溶血性链球菌攻毒垂死组(sh-imm-homo-w)；(10)溶血性链球菌免疫后异种副溶血弧菌攻毒健康组(sh-imm-hetro-h)；(11)溶血性链球菌免疫后异种副溶血弧菌攻毒垂死组(sh-imm-hetro-h)；(12)副溶血弧菌免疫后同种副溶血弧菌攻毒健康组(vp-imm-homo-h)；(13)副溶血弧菌免疫后同种副溶血弧菌攻毒垂死组(vp-imm-homo-w)；(14)副溶血弧菌免疫后异种溶血性链球菌攻毒健康组(vp-imm-hetro-h)；(15)副溶血弧菌免疫后异种溶血性链球菌攻毒垂死组(vp-imm-hetro-w)。

我们将免疫攻毒的文昌鱼分为健康生存组和受伤垂死组，进一步采用westernblotting分析免疫攻毒对文昌鱼肠cavpt和ck的影响，考察此二种蛋白在文昌鱼免疫后攻毒中的作用。结果发现，肠cavpt在生理盐水对照组、溶血型链球菌免疫后同种或者异种病原菌(副溶血弧菌)攻毒的生存组中均未检测到，但在副溶血弧菌攻毒垂死组中被检测到(图7a)。图7b显示，副溶血弧菌免疫后的同种副溶血弧菌攻毒和异种溶血性链球菌攻毒的垂死组中均检测到肠cavpt，在异种攻毒的生存组中也能检测到痕量的cavpt。这些结果有力地表明肠cavpt可以作为文昌鱼感染细菌后死亡的标志。这一标志在革兰氏阴性细菌中相比阳性细菌反应更为强烈。

与肠cavpt不同，生存文昌鱼肠ck保持相对稳定的表达水平，但灭活菌免疫后ck蛋白显著上调，且革兰氏阳性细菌灭活菌免疫较阴性细菌免疫对ck蛋白表达的影响更为显著。免疫后再进行同种或异种病原菌攻毒明显抑制ck的表达，然而垂死组ck表达水平较生存组更高，且在革兰氏阴性细菌中表现得更为明显(图7c，d)。更重要的是，肠道ck蛋白表达水平不变却与免疫保护相关。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。