一种快速高效提取木薯叶片和块根中氰苷的方法与流程

本发明属于种质资源学技术领域，具体公开了一种快速高效提取木薯叶片和块根中氰苷的方法。

背景技术：

木薯(manihotesculentcrantz.)隶属大戟科木薯属，是世界三大薯类作物之一，广泛种植于热带和亚热带地区。在非洲和中南美洲木薯是主要的粮食作物，在我国，除了部分用于食用和饲用外，主要用来提取淀粉以及酒精。随着我国耕地逐年减少、人口越来越多，粮食安全问题日益突出。木薯具有抗旱、耐瘠薄等特点，在较少水肥条件下也可获得比较高的收成，因此，选育食用木薯品种、发展食用木薯生产，可在一定程度上缓解我国的粮食紧张问题。另外，木薯还是畜牧养殖的重要原料，可节约玉米稻谷等粮食原料，从而大大节约养殖成本。木薯无论作为人类的粮食还是畜牧业的养殖原料，一个不利因素是其块根以及叶片中含有氰苷。氰苷，也叫生氰葡萄糖苷，是一种广泛存在于高等植物中的糖苷类次生代谢产物，在植物受到虫害、动物啃食等损伤的情况下，会转化为醇腈，醇腈在alpha-醇腈裂解酶催化下裂解产生氢氰酸，对动物产生毒害，同时对植物自身起保护作用，这个过程被称为生氰反应。含有氰苷可使木薯的抗逆性增强，对其自身有益，但低氰苷含量则是木薯作为粮食的重要前提。因此，选育低氰苷含量的木薯品种，是培育食用木薯的重要课题。

目前，生产试验中常见的是通过测定木薯叶片或块根中的氢氰酸含量来指导低氰苷品种选育。做法是破碎样品使其中的氰苷在醇腈裂解酶催化下裂解释放出可溶性的氢氰酸，再通过蒸馏收集然后通过硝酸银滴定法等测得样品中氢氰酸的含量，也有直接提取氰苷的报道。但这类方法存在的问题一是周期较长，释放氢氰酸通常需要数小时甚至过夜；二是需要的组织样品量较大，通常需要10克甚至更多的样品才能进行实验；三是重复性差，同一样品结果变幅较大。本文介绍一种快速提取木薯叶片和块根中氰苷的方法，该方法快速高效，结果的重复性强，所需组织量少，木薯低氰苷品种的选育工作中可做参考。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速高效提取木薯叶片和块根中氰苷的方法，以解决现有技术中对木薯直接提取氰苷的方法存在提取周期较长、组织样品的需求量较大、同一样品测定结果变幅较大的问题。

1.为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种快速高效提取木薯叶片和块根中氰苷的方法，包括以下步骤：

(1)、对木薯的叶片和块根部位进行取样；叶片选取第一伸展叶，叶片的取样部位为第一伸展叶的中间位置，通过2mleppendorf离心管盖对第一伸展叶的中间位置进行夹取从而获得叶片样品，将叶片样品装入2mleppendorf离心管内并将管盖扣合，然后迅速放到冰上；块根选取整个块根的中间部位，通过刀具将块根的中间部位切成4-6mm厚的片状块根，块根的取样部位为片状块根的中间位置和韧皮部及木质部交界的部分，通过打孔器分别对片状块根的中间位置和韧皮部及木质部交界的部分打孔操作从而获得直径为6-10mm的块根样品一、块根样品二，将块根样品一、块根样品二分别装入到2mleppendorf离心管内并将管盖扣合，然后迅速放到冰上。

(2)、在通风橱内用65℃水浴预热85％甲醇备用。

(3)、对于叶片样品，先往每个装有叶片样品的2mleppendorf离心管内加入300ul经步骤(2)预热过的85％甲醇，然后将2mleppendorf离心管的管盖扣合，接着用离心管盖锁封锁2mleppendorf离心管，接着将2mleppendorf离心管置于浮漂上放入100℃水浴内加热3分钟，3分钟后取出并置于冰上充分冷却。

(4)、对于块根样品一和块根样品二，先往每个装有块根样品一或块根样品二的2mleppendorf离心管内加入500ul经步骤(2)预热过的85％甲醇，然后将2mleppendorf离心管的管盖扣合，接着用离心管盖锁封锁2mleppendorf离心管，接着将2mleppendorf离心管置于浮漂上放入100℃水浴内加热5分钟，5分钟后取出并置于冰上充分冷却。

(5)、通过10000转/分钟的转速对2mleppendorf离心管内的混合物进行离心处理1分钟，并提取上清液。

(6)、将步骤(5)中获得的上清液全部转入高效液相色谱用的玻璃瓶中，用高效液相色谱-质谱法测氰苷含量。

(7)、用hp1100型高效液相色谱仪(agilenttechnologies公司)偶联布鲁克道尔顿公司产的hct-ultra型离子阱质谱仪分别测提取叶片样品、块根样品一、块根样品二中的氰苷含量。

本技术方案的有益效果在于：

(1)本方案中对木薯中氰苷的提取方法，整个操作过程时间短，环节少，节约了劳动工时；

(2)本方案中对木薯中氰苷的提取方法，材料的用量少，减少了对原料的浪费，同时整个操作方法容易掌握，涉及到的操作设备少、简易，利于推广。

附图说明

图1是木薯叶片取样部位示意图；

图2是木薯块根切片部位示意图；

图3是木薯片状块根取样部位示意图；

图4是三种木薯材料叶片中两种氰苷含量对比示意图；

图5是三种木薯材料块根中两种氰苷含量对比示意图。

具体实施方式

具体实施过程如下：

1.材料与方法:

1.1需要提前准备的设备与材料

65℃、100℃水浴锅各一个；2mleppendorf离心管一批，取样及提取氰苷用；打孔器，直径选取6-10mm；保证取下的木薯块根样品可以放入2mleppendorf离心管中；离心管盖锁，用于卡在离心管上，防止提取氰苷时水浴过程中离心管爆裂；万分之一天平；85％甲醇；冰；高效液相色谱用玻璃瓶及瓶盖；计时器。

分析所用植物材料为种植于大田(植后150天)的木薯材料arg7,ku50和w14。arg7和ku50是木薯栽培品种，w14属木薯近缘野生种，材料保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所种质资源圃。

1.2方法

1.2.1取样前准备工作

首先取60个2mleppendorf离心管，编号并用万分之一天平称重并记录；然后准备400-500ml85％甲醇，可以用超纯水稀释无水甲醇至需要的浓度。

1.2.2取样

每个木薯品种取5个植株的叶片与块根。如图1所示，叶片取第一伸展叶，取样部位为叶片中间位置，取样时用离心管盖夹取叶片中间位置即可，然后迅速放到冰上，防止氰苷降解。注意第一伸展叶并非最嫩的未伸展的小叶片，应该是刚伸展的功能叶片。

块根取样时取中间部位，用刀具切成4-6mm厚的薄片，用打孔器按照图2、图3的位置取样，即每个品种取块根中间位置和韧皮部及木质部交界部分各一处，取样直径6-10mm，然后快速放入冰上，带回实验室准备提取氰苷。

1.2.3提取及含量测定

首先在通风橱内用65℃水浴预热85％甲醇备用；然后快速称重并记录，计算所取用的样品量；对于叶片样品，每个管内加入300ul预热的85％甲醇，盖好盖后用离心管盖锁封锁离心管，以防止下一步加热时离心管爆裂。再将离心管置于浮漂上放入100℃水浴内加热3分钟，3分钟后取出离心管置于冰上充分冷却。对于块根样品，每个管内加入500ul预热的85％甲醇，在100℃水浴内加热5分钟，其它操作与叶片样品相同；最后用10000转/分钟转速离心1分钟，将上清液全部转入高效液相色谱用玻璃瓶，用高效液相色谱-质谱法测氰苷含量。也可先用冷冻真空机冻干提取产物后保存，用于后续测定。用hp1100型高效液相色谱仪(agilenttechnologies公司)偶联布鲁克道尔顿公司产的hct-ultra型离子阱质谱仪测提取样品的氰苷含量。

2.结果与分析

2.1高效液相色谱-质谱试验标准曲线的制作

用55％(v/v)的甲醇-2％(v/v)的水溶液配置亚麻苦苷和百脉根苷标准品的浓度梯度标准溶液,浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、20和50μg/ml，各自以1μl的进样量上样，并以获得的积分面积对应各自浓度进行线性回归，得到亚麻苦苷和百脉根苷的回归方程和相关系数。表1列出了两种氰苷的线性回归方程，相关系数表明峰面积与上样样品中氰苷含量具有很好的线性关系。

表1亚麻苦苷和百脉根苷的线性范围、线性回归方程及相关系数

2.2木薯

对提取到的木薯氰苷利用液相色谱-质谱法测定的结果见图4、图5。

图4结果显示，实验所用三个木薯材料叶片中均是亚麻苦苷含量要远高于百脉根苷。这与前人结果一致。野生木薯w14叶片亚麻苦苷的含量为3.56-5.16μg/mg，栽培品种ku50和arg7分别为0.98-2.30μg/mg和0.64-1.22μg/mg。显然，三个木薯种质中野生的w14氰苷含量要远大于两个栽培品种，arg7含量最低。

图5为三个木薯材料块根氰苷含量的测定结果。与叶片相同，木薯块根亦含有亚麻苦苷和百脉根苷两种氰苷。而野生木薯w14块根氰苷含量同样高于ku50和arg7两个栽培品种，三者中arg7块根的氰苷含量最低。另外，多数情况下，三个木薯材料的块根韧皮部与木质部结合部位的氰苷含量要大于块根内部氰苷含量。

本方案中的方法需要注意以下几个关键点，否则会大大影响提取效果：(1)取样后有条件时宜立即提取，如果是田间取样则要迅速放到冰上，且不宜放置太久，以免破损的组织中醇腈裂解酶等分解氰苷；(2)提取过程中加入预热的85％甲醇后一定要用专用离心管锁锁紧离心管盖，以防在100℃水浴中加热时离心管爆裂。如果不慎离心管发生爆裂或管盖打开，则会大大影响提取效果；(3)提取的氰苷可以长期保存，以备后续测定，但应在低温下真空抽干溶剂，该过程应防止样品在器皿内飞溅。

与淀粉酒精工业用相比，食用木薯品种均具有低氰苷的特点，因此在培育食用木薯品种过程中，测定木薯叶片及块根中的氰苷含量是不可缺少的工作之一，本方案所采用的方法从取样到提取结束仅需20分钟，具有快速且重复性好的特点，是木薯氰苷提取的有效方法。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。