一种基于共价键合法固定捕获抗体的纸基酶联免疫吸附法的制作方法

本发明属于免疫分析技术领域，涉及一种纸基酶联免疫吸附法，尤其是一种以共价键合法固定捕获抗体检测人血液中类过敏相关mrgprx2受体含量的纸基elisa双抗体夹心法。

背景技术：

酶联免疫吸附试验(elisa)是利用抗原抗体的特异性反应，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体的表面上，通过特异性反应捕获待测物，然后通过待测物与酶标记的抗原或抗体反应，之后经过酶与底物产生的颜色反应定量检测待测物的技术。这个技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便等优点，不但可用于临床检查，也可用于血清流行病学的调查。与传统的96孔板台式酶联免疫吸附试验相比，纸基酶联免疫吸附试验具有明显的优势。纸不仅生物相容性好，其高比表面积的微孔结构提高了固定抗体的量。纸张的另一个较为显著的特征是每个测试区只需少量的抗体、样品和底物溶液，试样和试剂消耗较少，分析速度快，操作简单，因此这种方法既便宜又快速(1小时以下)。最重要的是，该方法可与多种检测方法兼容，结果可通过简单的台式扫描仪或移动电话获取，并通过imagej软件分析，使该方法可适用于资源贫乏的国家。因此，纸基酶联免疫吸附法已成为一种受关注的廉价检测平台，在某些情况下可代替玻璃以及高聚物芯片进行现场的分析检测。

典型的elisa双抗体夹心法需要许多步骤，并在每个步骤之后需要几次清洗，这些步骤带来的一个挑战是捕获抗体的固定强度。通常，固定在基底表面上的抗体数量越多，在分析过程中捕获的分析物的分子数量就越多，分析检测的灵敏度就越高。固定抗体的方法有物理吸附法和化学结合法。由于其简单性和通用性，物理吸附是目前应用最广泛的固定方法。然而，吸附在纤维素纸上的抗体分子中约有40％可以脱附，由此造成基于物理吸附法固定抗体的纸基elisa方法对极低浓度目标物的检测不敏感。因此，开发有效的固定策略来提高灵敏度对于纸基酶联免疫吸附法至关重要。与物理吸附法固定抗体相比，化学共价法固定抗体可以提高抗体的固定强度，保证抗体的固定数量，从而提高分析检测的灵敏度。专利cn201810960085.6报道了一种配位络合含his标签过敏原的纸基传感器检测与血清中的免疫球蛋白ige相关的过敏反应。螯合配位固定方法对抗原的固定是牢固可靠的，但其固定过程需先对纸基表面进行化学修饰产生醛基，而后与络合物镍-氨三乙酸结合，再螯合含his标签的过敏原，操作复杂，步骤繁多，成本较高。因此，开发步骤简单、成本低廉、高效的捕获抗体共价固定方法具有重要意义。

g蛋白偶联受体(g-proteincoupledrecepters,gpcrs)是最大的一类七次跨膜受体，可将胞外的信号传到胞内从而引发生物反应，调控细胞的增殖、存活和新陈代谢，并且在神经信号的传递过程中发挥重要作用。mrgprx2是一类新颖的gpcr，主要在人皮肤肥大细胞中有较高表达。研究表明，mrgprx2是很多小分子药物引起类过敏、假性过敏的作用靶点。近年来，随着对各类药物不良反应的监测，类过敏反应的发生频率呈上升的趋势，由于其危害性较大，受到越来越多的关注。实验室前期研究发现人血液嗜碱性粒细胞中mrgprx2受体的含量高低与研究对象对类过敏反应的敏感程度正相关。专利cn201580053612.x和国际专利wo2018232316(a1)报道了基于mrgprx2/mrgprb2表达细胞筛选致类过敏药物和抗类过敏药物的方法，但未从人群角度出发预测易发类过敏反应的临床病人。专利cn110240643a报道了基于物理吸附法固定捕获抗体的传统elisa方法测定血液中mrgprx2的含量，该方法的灵敏度有限。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于共价键合法固定捕获抗体的纸基酶联免疫法用于检测人血液中类过敏相关mrgprx2受体的含量，该方法能够解决现有共价键合技术步骤繁多、操作复杂、成本高以及共价键合技术灵敏度低的难题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种基于共价键合法固定捕获抗体的纸基酶联免疫吸附法，包括以下步骤：

1)以mrgprx2鼠单抗为捕获抗体，引入兼具羧基和氨基官能团的牛血清白蛋白，通过mrgprx2鼠单抗与牛血清白蛋白的酰胺缩合反应形成抗体-bsa网络结构；

2)将捕获抗体固定在滤纸上，以辣根过氧化物酶标记的mrgprx2兔多抗为检测抗体，以mrgprx2蛋白溶液为标准品建立标准曲线；

3)通过对比待检测人血液样本的显色强度与标准曲线，得到待检人血样中mrgprx2的含量，实现人血液中类过敏相关受体mrgprx2的快速定量检测。

优选地，通过蜡封技术在滤纸上构建圆环形疏水边界，将捕获抗体的固定和目标物的检测限定在一系列直径为0.5～1.0cm的圆形亲水区域内。

优选地，在引入牛血清白蛋白进行酰胺缩合反应时加入活化剂，所用的活化剂为1-乙基-3-(3-(二甲氨基)丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺中的一种或两者的混合物。

优选地，mrgprx2鼠单抗与牛血清白蛋白进行酰胺缩合反应的反应溶剂为三蒸水、ph值为5～8的2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲液或者ph值为5～8的磷酸盐缓冲液。

优选地，在酶联免疫吸附法定量检测过程中用来封闭捕获抗体的封闭液为浓度2％～10％的牛血清白蛋白或奶粉溶液。

优选地，所述捕获抗体的浓度为5～100μg/ml。

优选地，所述检测抗体的浓度为1～10μg/ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的方法以mrgprx2鼠单抗为捕获抗体，引入具有氨基和羧基官能团的牛血清白蛋白(bsa)，利用捕获抗体与bsa中氨基与羧基间的酰胺缩合反应实现捕获抗体的固定。无需对滤纸表面进行官能化预处理，操作简单易行、成本低廉；bsa的加入也起到了隔离作用，使抗体-抗体交联最小化，避免抗体间高度交联网络的形成，利于抗体构象的保持，促进抗体的稳定。稳定性实验表明，经此共价键合法固定的纸-捕获抗体可在4度冰箱中稳定存放至少80天(附图5)。同时，本发明方法定量结果准确、可靠，试剂用量少，蛋白抗体反应时间短，可在45分钟内实现血液中mrgprx2含量的高通量、快速测定。而常规elisa方法蛋白与捕获抗体和检测抗体的结合时间长，通常需要2.5～3.5小时完成检测。该方法检测人血液中mrgprx2蛋白的定量限为1.5ng/ml，与传统elisa方法(定量限为7.75ng/ml，专利cn110240643a)相比，灵敏度更高。因此，本发明以mrgprx2受体为待测物，拟开发低成本、简单高效的共价键合固定捕获抗体方法和高通量、高灵敏度的elisa双抗体夹心法测定人血液中mrgprx2受体的含量，对预测临床病人对类过敏反应的敏感程度并指导临床用药有重要意义。

附图说明

图1为纸基elisa微孔板的制备过程示意图；

图2为捕获抗体的固定示意图；

图3为纸基elisa双抗体夹心法的检测过程示意图；

图4为elisa双抗体夹心法的标准曲线；

图5为纸基elisa微孔板在25度和4度条件下保存时的稳定性实验结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图3，本发明公开的检测人血液中类过敏相关mrgprx2受体含量的纸基酶联免疫吸附法，包括以下步骤：

(1)对滤纸进行蜡封制备疏水区域，具体操作如下(图1)：

1)用打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列直径为0.5～1.0cm的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上，备用；

2)将钢板在300℃下预热处理5min，然后压迫上述覆盖有打孔蜡纸的滤纸，制得蜡封好的纸基elisa微孔板。

(2)在滤纸上固定捕获抗体：

分别吸取一定量的mrgprx2鼠单抗、反应溶剂、活化剂以及牛血清白蛋白(bsa)溶液混合涡旋，取出一定量滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干(参见图2)。

(3)洗涤：

在晾干后的滤纸小孔中加入pbst缓冲液进行洗涤，室温晾干。

(4)封闭：

向小孔中加入bsa溶液进行封闭，室温晾干。

(5)加入mrgprx2标准蛋白：

向小孔中加入mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2蛋白的浓度为15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)加入检测抗体并洗涤：

向小孔中加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的mrgprx2兔多抗(hrp-兔多抗)作为检测抗体，反应1min后立即用pbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：

加入底物tmb避光显色，然后手机或相机拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：

以显色强度为纵坐标，mrgprx2蛋白的浓度为横坐标建立标准曲线，结果参见图4，从图4中可以看出，当mrgprx2蛋白的浓度从0增加到250ng/ml左右时，其显色强度随浓度的增加线性增大。

(9)人血液样本的前处理：

收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液，分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)人血液样本的elisa检测：

在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，向小孔中加入步骤(9)提取到的膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到人血液样本的显色强度，与步骤(8)获得的标准曲线进行比较，得到待检人血样中mrgprx2的含量，通过mrgprx2的含量高低预测病人对类过敏反应的敏感程度。实验发现正常人mrgprx2受体含量在2～30ng/ml，哮喘病人mrgprx2受体含量高于40ng/ml。该方法可简单、快速、灵敏地实现人血液中mrgprx2受体含量的测定，进而预测临床病人对类过敏反应的敏感程度并指导临床用药。

实施例1

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用6mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列6mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封过的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取600μm的bsa25μl，100μmph6.0的mes50μl，100μm的edc60μl和40μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取5μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl8％的bsa封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为2μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理：收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例2

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用8mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列8mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取600μm的bsa50μl，三蒸水80μl，100μm的edc40μl，100μm的nhs40μl和30μg/ml的鼠单抗50μl于离心管中混匀，取8μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl10％的bsa封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为5μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理：收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例3

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用10mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列10mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取300μm的bsa25μl，100μmph6.0的pbs50μl，100μm的nhs50μl和10μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取10μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加20μl5％的奶粉溶液封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为6μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理：收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例4

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用6mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列6mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取400μm的bsa50μl，100μmph8.0的mes50μl，100μm的edc80μl，100μm的nhs20μl和100μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取5μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl10％的bsa封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为8μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例5

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用8mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列8mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取300μm的bsa50μl，三蒸水100μl，100μm的edc80μl，100μm的nhs10μl和10μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取8μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl5％的奶粉溶液封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为10μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理：收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例6

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用10mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列10mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取200μm的bsa50μl，100μmph8.0的pbs70μl，100μm的edc80μl，100μm的nhs40μl和80μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取10μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl4％的bsa封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为3μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理：收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例7

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用8mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列8mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取100μm的bsa75μl，100μmph7.0的mes100μl，100μm的edc60μl和30μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取5μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl5％的bsa封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为10μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理：收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例8

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用8mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列8mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取800μm的bsa25μl，100μmph7.0的pbs50μl，100μm的edc90μl，100μm的nhs20μl和40μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取10μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl10％的bsa封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为10μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理：收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例9

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用6mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列6mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取200μm的bsa30μl，100μmph5.0的mes50μl，100μm的edc50μl，100μm的nhs30μl和50μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取5μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl4％的奶粉溶液封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为6μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

实施例10

基于共价键合法固定抗体的纸基elisa双抗体夹心法检测人血液中mrgprx2含量的步骤如下：

(1)滤纸蜡封：用10mm内径的打孔器和小锤子将蜡纸敲出一系列10mm内径的小孔，将打完孔的蜡纸覆盖在滤纸上；将钢板放入300℃的箱式电阻炉中加热5min，拿出后压在蜡纸上5min制备得到蜡封好的滤纸。

(2)捕获抗体的固定：分别吸取300μm的bsa50μl，100μmph5.0的pbs50μl，100μm的edc50μl，100μm的nhs25μl和80μg/ml的鼠单抗25μl于离心管中混匀，取10μl滴在蜡封过的滤纸小孔上，室温晾干。

(3)洗涤：在晾干后的滤纸小孔中加入10μl的pbst洗涤，三次后室温晾干。

(4)封闭：每孔加10μl2％的bsa封闭，室温晾干。

(5)标准蛋白溶液的加入：每孔加入5μl2％bsa稀释的mrgprx2蛋白溶液，mrgprx2的浓度从15ng/ml～1000ng/ml，室温晾干。

(6)检测抗体的加入和洗涤：每孔加入5μl浓度为7μg/ml的hrp-兔多抗，反应1min后立即用10μlpbst洗涤四遍。

(7)显色和图像采集：每孔加5μltmb避光显色，10min后，拍照并通过imagej软件分析显色强度。

(8)标准曲线的绘制：以显色强度为纵坐标，mrgprx2的浓度为横坐标建立标准曲线。

(9)人血液样本的前处理：收集新鲜血样，使用人单个核细胞分离液(东方华辉，产品批号：25171004)分离纯化获取1ml患者抗凝血液中的嗜碱性粒细胞；用thermo膜蛋白提取试剂盒裂解上述细胞提取膜蛋白。

(10)血液样本的elisa检测：在固定好捕获抗体的滤纸小孔上重复步骤(3)和(4)后，每孔加入5μl膜蛋白，重复步骤(6)和(7)得到显色强度，与标准曲线比较得到待检血样中mrgprx2的含量，实验测得人血液中mrgprx2的含量在2-160ng/ml范围内。

综上所述，本发明以人血液中类过敏相关受体mrgprx2的检测为目标，以mrgprx2鼠单抗为捕获抗体，采用化学键合法固定捕获抗体，引入兼具羧基与氨基官能团的牛血清白蛋白(bsa)分子，利用抗体分子与bsa分子中氨基与羧基间的酰胺缩合反应形成抗体-bsa网络结构，实现捕获抗体的经济、简单、高效固定，无需对滤纸表面进行化学修饰；制备得到的纸-捕获抗体可在4度冰箱中稳定保存80天；以辣根过氧化物酶hrp标记的mrgprx2兔多抗为检测抗体，以mrgprx2溶液为标准品建立mrgprx2的纸基elisa双抗体夹心法。45分钟内完成elisa检测，结果可通过简单的台式扫描仪或移动电话获取，并通过imagej软件分析，仪器依赖度低并可进行现场分析检测。该捕获抗体的固定方法简单、高效、成本低，该纸基elisa双抗体夹心法检测通量高、速度快、检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，定量结果的准确性、重现性良好，适用于临床检查和血液流行病学调查。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。