一种提高蛋白复合物电荷价态的方法

1.本发明涉及生物质谱领域，特别涉及一种提高蛋白复合物电荷价态的方法及应用该方法的非变性质谱检测方法。


背景技术：

2.蛋白多形成复合物而发挥其功能，因此探索蛋白复合物的结构和功能之间关系，有助于揭示生命现象本质，为重大疾病的预防、诊断以及新药发现提供新的理论指导和技术支撑。非变性质谱(native ms)是一种通过非变性溶剂对生物分子进行喷雾离子化进而质谱检测的统称，可提供蛋白复合物的分子量、化学计量比、结合配体种类、亚基网络拓扑学等信息。此外，当非变性质谱与自上而下蛋白质组学(top-down proteomics)结合时还可提供一级到四级的结构信息，很好地互补于传统的生物物理技术。
3.提高质谱中气相蛋白复合物的电荷数有诸多优势，例如：(1)针对基于电荷检测原理的质谱仪(fticr和orbitrap质谱)，电荷数的增加可以显著提高质谱仪的检测效率(kafader,j.o.et al.nat.meth.2020,17,391-394)；(2)针对基于多极杆传统系统的质谱仪，电荷数的增加可以显著提高离子的传输效率(teo,c.a.et al.anal.chem.2014,86,4455-4462)；(3)电荷数的提高(质荷比m/z的减小)可降低对质量分析器的要求，便于检测更大分子量的蛋白复合物；(4)同时，基于电子和碰撞离子活化方法可从电荷数提高中获益，从而显著提高解离效率、碎片离子数目和序列覆盖率(macias,l.a.et al.anal.chem.2020,92,227-251；brodbelt,j.s.et al.chem.rev.2020,doi:10.1021/acs.chemrev.9b00440)。因此，开发一种普适性、简单易得的蛋白复合物电荷价态提高方法，对于解析大蛋白复合物的气相结构至关重要。
4.对蛋白离子的电荷进行选择性和可控性操作，是获取不同气相蛋白构象、蛋白复合物不同的解离/去折叠途径以及蛋白构象与电荷价态间关联性信息的必要条件(laszlo,k.j.et al.j.am.chem.soc.2016,138,9581-9588；gonz
á
lez fl
ó
rez,a.i.et al.angew.chem.int.ed.2016,55,3295-3299)。目前，多种策略已被报道用于蛋白离子的电荷数提高，例如化学衍生法引入固定电荷(krusemark,c.j.et al.j.am.soc.mass.spectrom.2009,20,1617-1625)，引入supercharging试剂(teo,c.a.et al.anal.chem.2014,86,1640-1647)，以及电热诱导去折叠(cassou,c.a.et al.anal.chem.2014,86,1640-1647)等。其中，supercharging试剂(如间硝基苄醇和环丁砜)已被证明不论是在非变性还是变性缓冲体系中都具有高效的电荷提高能力。已有报道，supercharging策略可显著提高蛋白及其复合物在质谱仪中的传输效率、碎片化效率及检测效率(kafader,j.o.et al.nat.meth.2020,17,391-394；teo,c.a.et al.anal.chem.2014,86,4455-4462；macias,l.a.et al.anal.chem.2020,92,227-251；brodbelt,j.s.et al.chem.rev.2020,doi:10.1021/acs.chemrev.9b00440)。但是，高浓度supercharging试剂的引入常常造成溶液相中蛋白构象的扰动，以及谱峰中严重的加合物干扰(ogorzalek loo,r.r.et al.j.am.soc.mass.spectrom.2014,25,1675-1693)。同时，
由此造成的蛋白离子检测灵敏度下降亦不容忽视。此外，supercharging试剂常常用于小蛋白离子的电荷数提高，但其在提高大蛋白复合物电荷数的同时保持非共价相互作用，仍然具有一定的分析挑战。因此，开发一种针对大蛋白复合物提高其电荷价态，且保持非共价相互作用不被破坏的新型supercharging策略，对于蛋白复合物的非变性质谱分析意义非凡。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种在不破坏蛋白复合物的非共价相互作用的前提下，显著提高蛋白离子电荷价态的方法。该方法无需在蛋白溶液中引入任何supercharging试剂或变性剂，因此避免了这些试剂对溶液相中蛋白构象的扰动、严重的加合物谱峰干扰以及灵敏度降低等弊端。
6.本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
7.一种提高蛋白复合物电荷价态的方法，包括以下步骤：
8.s1.制备蛋白样品溶液：用溶剂将蛋白及其复合物配成蛋白样品溶液；所述蛋白及其复合物的分子量为20kda～10mda；
9.s2.高气压电喷雾电离：将s1.中的蛋白样品溶液装入毛细管喷针，同时离子源腔室内通入工作气体以产生高于大气压的气压氛围；并对毛细管喷针施加电压，得到气相蛋白离子。
10.本发明通过步骤s2.的高于大气压的气压氛围使蛋白及其复合物在电喷雾电离过程中显著提高所带的电荷数。在常压下的电喷雾电离过程中，待测蛋白离子的电荷价态遵循rayleigh极限，即当蛋白液滴内部电荷数接近rayleigh极限电荷(zr)时，由于库伦排斥力的作用会使液滴进一步裂解成小液滴以释放出多余电荷，从而维持液滴内电荷数小于zr，直至溶剂完全蒸发并释放出最终的带电蛋白离子。与之相比，本发明中离子源腔室内高于大气压的气压氛围的存在，可产生更小的初始液滴并加速蛋白离子的形成过程。相比于常压下的电喷雾电离过程，高气压氛围下液滴的裂解次数下降，因此待溶剂完全蒸发后每个蛋白离子可带有更高电荷数，甚至超过zr；其次，高气压氛围还会进一步抑制液滴外围的电荷离子发射过程，从而进一步提高最终蛋白离子所带的电荷数。因此，本发明只需简单改变离子源腔室内的气压大小，便可控制蛋白离子所带电荷数，同时无需在溶液中加入supercharging试剂或变性剂便可实现电荷数的提高，避免了对溶液相中蛋白构象的扰动、严重的加合物谱峰干扰以及灵敏度的降低。
11.步骤s1.中，所述蛋白及其复合物包括但不限于抗原、抗体、水溶性蛋白、膜蛋白、蛋白-小分子复合物或蛋白-蛋白复合物。优选地，步骤s1中，所述的蛋白及其复合物的分子量为27kda～801kda。
12.步骤s2.中，所述工作气体为空气、氮气、氩气。优选地，所述工作气体为氮气。
13.本发明中，通过离子源腔室内通入工作气体以产生高于大气压的气压氛围的方式，可以有两种，一种是采用常规的敞口式离子源腔室，通过不断地输入工作气体，使得敞口式离子源腔室产生略高于大气压的气压氛围。
14.优选地，步骤s2.中，所述离子源腔室为敞口式离子源腔室时，所述气压氛围由工作气体流动产生，所述工作气体的气体流速为50～1000l/h。同时，发明人研究发现，在这种方式下，工作气体的流速在大于600l/h时，离子源腔室内的气压上升不明显，工作气体的流
速为600l/h时对应的压力约为1.2
×
105pa。
15.另外，所述离子源腔室还可以选择封闭式的离子源腔室，这时，离子源腔室内的气压氛围是通过在离子源腔室中填充工作气体来产生高气压。优选地，所述气压氛围为1.1
×
105pa～1
×
107pa。
16.所述离子源腔室的腔体可由透明/不透明的固体材料、或透明/不透明的固体组合材料制备而成。
17.步骤s2.中，所述毛细管喷针由导电材料制备而成，所述导电材料包括但不限于不锈钢材料、表面有金属镀层的玻璃材料、内部插有导电电极的玻璃材料。
18.所述毛细管喷针的尖端的直径为100nm～100μm。最优选地，所述毛细管喷针的尖端的直径为1μm。
19.步骤s2.中，所述电压为0.6～1.2kv。
20.步骤s2.中，优选通过导电金属丝对毛细管喷针施加电压，所述导电金属丝可为导电铂丝、导电铜丝，优选为导电铂丝。
21.一种蛋白复合物非变性质谱检测方法，包括以下步骤：
22.s1.制备蛋白样品溶液：用溶剂将蛋白及其复合物配成蛋白样品溶液；所述蛋白及其复合物的分子量为20kda～10mda；
23.s2.高气压电喷雾电离：将s1.中的蛋白样品溶液装入毛细管喷针，同时离子源腔室内通入工作气体以产生高于大气压的气压氛围；并对毛细管喷针施加电压，得到气相蛋白离子；
24.s3.质谱检测：s2.中的气相蛋白离子进入质谱仪的传输系统和质量分析器系统，进行分离和检测，获得非变性质谱图；所述质量分析器系统采用正离子模式。
25.步骤s3.中，所述质量分析器系统为常用的质谱仪质量分析器系统，可为磁质谱、四级杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱或傅里叶变换离子回旋共振质谱；所述离子阱质谱包括线性离子阱质谱、轨道离子阱质谱或矩形离子阱质谱。
26.本发明对蛋白的质谱检测的原理，与常规的电喷雾电离质谱方法类似，在制备了蛋白样品后，将其装入自行制备的毛细管喷针内，插入导电金属丝，在一定的电压下，毛细管喷针的尖端可以发射出蛋白液滴，随后蛋白液滴在高气压氛围下发生去溶剂化和离子蒸发，由于高气压氛围可以有效地稳定rayleigh电荷极限所造成的库伦排斥力，以及抑制离子发射过程，因此蛋白样品溶液中可保留有较高的电荷数，直至溶剂完全蒸发后，气相蛋白离子便可获得更高的电荷数。随后，气相蛋白离子经质谱仪的传输系统进入质量分析器系统被分离并检测，获得非变性状态的蛋白及其复合物的质谱图。
27.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
28.本发明通过在离子源腔室内通入工作气体产生高于大气压的气压氛围，使蛋白溶液在高气压下进行电喷雾电离，可在不破坏蛋白复合物的非共价相互作用的前提下，显著提高蛋白离子电荷价态。本发明方法无需在蛋白溶液中引入任何supercharging试剂或变性剂，因此避免了这些试剂对溶液相中蛋白构象的扰动、严重的加合物谱峰干扰以及灵敏度降低等弊端。相对于传统的supercharging策略，本发明方法适用于20kda～10mda的蛋白及其复合物，具有极高的普适性。相比传统常压下电喷雾电离方法，本发明方法可将非变性质谱图谱峰信噪比提高2-5倍，很好地克服非变性质谱分析灵敏度不足的缺点。同时，只需
改变离子源腔室内的压力大小，便可调节并控制最终蛋白离子所带的电荷数。本发明的高气压氛围便宜易得，且本发明无需繁琐的样品制备过程，就可以实现比传统方法更优的电荷数提高的效果。相比传统方法，本发明所述高气压电喷雾电离方法具有广泛的普适性和应用前景，可“百搭”于市面上任何商品化的质谱仪，后续可用于在线native top-down质谱分析。
附图说明
29.图1为实现本发明所述的提高非变性质谱中蛋白复合物电荷价态的检测方法采用的高气压电喷雾电离装置的示意图，各标记为：1-离子源腔室、2-导电铂丝、3-毛细管喷针、4-气相蛋白离子、5-采样锥；
30.图2为(a)高气压和(b)常压电喷雾电离后获得的血清免疫球蛋白g1κ(igg1κ)抗体的非变性质谱图；
31.图3为(a)谷氨酸脱氢酶、(b)分子伴侣60(groel)、(c)醇氧化酶、(d)铁蛋白在离子源腔室内氮气流速分别为0l/h、200l/h、400l/h和600l/h时的非变性质谱图；
32.图4为(a)谷氨酸脱氢酶、(b)分子伴侣60(groel)、(c)醇氧化酶、(d)铁蛋白的平均电荷价态随离子源腔室内氮气流速的变化趋势图；
33.图5为(a)高气压和(b)常压电喷雾电离后获得的碳酸酐酶-锌离子复合物的非变性质谱图；
34.图6为不同氮气流速下碳酸酐酶-锌离子复合物的碰撞截面(ccs)对比图；
35.图7为常压(矩形)、高气压(圆形)和rayleigh极限(三角形)条件下29种蛋白及其复合物平均电荷价态随分子量的变化趋势图；
36.图8为29种蛋白及其复合物在常压和高压下平均电荷价态差值随溶剂可及表面积(sasa)的变化趋势图。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅为说明的目的而提供，并不意味着对本发明的限制。下面实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，涉及的仪器均为市售产品。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
38.以下实施例中使用的高气压电喷雾电离装置和质谱仪为沃特世synapt g2-si高分辨质谱。
39.实施例1高气压电喷雾电离装置
40.本发明的高气压电喷雾电离装置可以参考图1。
41.将制备好的蛋白样品溶液装入自行制备的毛细管喷针3内，同时毛细管喷针3内插入导电铂丝2以施加电压，离子源腔室1内可以通入工作气体以产生高气压氛围，毛细管喷针3的尖端可以发射出蛋白液滴，随后蛋白液滴在高气压氛围下发生去溶剂化和离子蒸发，由于离子源腔室1内的高气压氛围可以有效地稳定rayleigh电荷极限所造成的库伦排斥力以及抑制离子发射过程，因此蛋白溶液中可保留有较高的电荷数，直至溶剂完全蒸发后，便可获得有较高电荷数的气相蛋白离子4。随后，气相蛋白离子4经过采样锥5进入质谱仪的传输系统和质量分析器系统，进行分离和检测，并最终获得非变性状态的蛋白及其复合物的
质谱图。
42.实施例2高气压电喷雾电离对非变性质谱中蛋白的电荷价态的影响
43.本实施例的实验步骤如下：
44.1.制备蛋白样品溶液：用200mm醋酸铵缓冲溶液将血清免疫球蛋白g1κ抗体(igg1κ抗体，分子量约为180kda)配制成10μm浓度的蛋白样品溶液。
45.2.电喷雾电离：
46.(1)高气压实验组：使用实施例1中的高气压电喷雾电离装置，对制备好的igg1κ抗体蛋白样品溶液进行电喷雾电离，离子源腔室内通入工作气体，具体参数如下：离子源腔室为敞口式，离子源腔室内温度为30℃，工作气体为氮气，氮气流速为600l/h，检测此时氮气气压约为1.2
×
105pa，导电铂丝施加的电压为0.8kv，采用的毛细管喷针尖端直径为1μm。
47.(2)常压对照组：使用实施例1中的高气压电喷雾电离装置，对制备好的igg1κ抗体蛋白样品溶液进行电喷雾电离，离子源腔室内不通入工作气体，其他具体参数与高气压实验组的相同。
48.3.质谱检测：高气压和常压电喷雾电离后获得的气相igg1κ抗体离子通过采样锥进入质谱仪的传输系统和质量分析器系统，使用飞行时间质谱进行检测，正离子模式下，最终获得的非变性质谱图如图2所示。
49.图2反映，常压下igg1κ抗体非变性质谱图中电荷价态分布为+22～+26，当氮气流速为600l/h即气压约为1.2
×
105pa时，igg1κ抗体非变性质谱图中电荷价态分布显著提高到+28～+32，最高峰的电荷价态从+24提高到+30，提高了+6的电荷价态；同时，igg1κ抗体谱峰信号强度提高了近3倍。实验表明，本发明方法采用高气压电喷雾电离，可提高igg1κ抗体的电荷价态，并且提高igg1κ抗体在非变性质谱中的谱峰信号强度。
50.实施例3高气压电喷雾电离对非变性质谱中蛋白复合物离子的电荷价态的影响
51.本实施例的实验步骤如下：
52.1.制备蛋白样品溶液：用200mm醋酸铵缓冲溶液分别将谷氨酸脱氢酶(同源六聚体，分子量约为336kda)、分子伴侣60(groel，同源十四聚体，分子量约为801kda)、醇氧化酶(同源八聚体，分子量约为675kda)、铁蛋白(同源二十四聚体，分子量约为490kda)配制成10μm浓度的蛋白样品溶液。
53.2.电喷雾电离：
54.(1)高气压实验组：使用实施例1中的高气压电喷雾电离装置，对制备好的四种蛋白样品溶液进行电喷雾电离，离子源腔室内通入工作气体，具体参数如下：离子源腔室为敞口式，离子源腔室内温度为30℃，工作气体为氮气，氮气流速分别为200、400、600l/h，导电铂丝施加的电压为0.8kv，采用的毛细管喷针尖端直径为1μm。
55.(2)常压对照组：使用实施例1中的高气压电喷雾电离装置，对制备好的四种蛋白样品溶液进行电喷雾电离，离子源腔室内不通入工作气体，即氮气流速为0l/h，其他具体参数与高气压实验组的相同。
56.3.质谱检测：高气压和常压电喷雾电离后获得的各种气相蛋白离子通过采样锥进入质谱仪的传输系统和质量分析器系统，使用飞行时间质谱进行检测，正离子模式下，最终获得的非变性质谱图如图3所示。
57.图3反映，当氮气流速从0l/h增加到600l/h时，即当气压从大气压提高到约1.2
×
105pa时，谷氨酸脱氢酶、分子伴侣60(groel)、醇氧化酶、铁蛋白在非变性质谱图中最高峰的电荷价态分别从38+提高到44+、从66+提高到74+、从60+提高到66+、从52+提高到64+；同时，蛋白复合物谱峰的信噪比提高了2～5倍。实验表明，气压大小确实对蛋白复合物的电荷价态产生了影响，提高电喷雾电离时的气压可相应提高蛋白复合物的电荷价态，同时提高蛋白复合物谱峰的信噪比。
58.实施例4高气压电喷雾电离后获得的蛋白复合物的平均电荷价态随氮气流速的变化趋势的研究
59.根据实施例3的实验步骤，将高气压实验组中的氮气流速分别设为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000l/h，在最终获得的非变性质谱图中得到不同氮气流速下相应的谷氨酸脱氢酶、groel、醇氧化酶、铁蛋白的平均电荷价态，实验结果如图4所示。
60.图4反映，当氮气流速从0l/h增加到400l/h时，四种蛋白复合物的平均电荷价态均呈近线性增加，随后进一步增加氮气流速到1000l/h，蛋白复合物的平均电荷价态的涨幅很小，特别是在600l/h以后。这是因为该实施例中高气压电喷雾电离装置的离子源腔室是敞开式的(非密闭式)，因此当氮气流速大于600l/h时，进一步增加气体流速并不会导致离子源腔室内气压的进一步升高。但根据实验结果，发明人推断，采用封闭式离子源腔室并通过填充工作气体来进一步提升离子源腔室内的气压氛围的话，蛋白的电荷价态很有可能进一步得到提升。
61.实施例5高气压电喷雾电离对金属蛋白复合物间非共价相互作用的影响
62.本实施例的实验步骤如下：
63.1.制备蛋白样品溶液：用200mm醋酸铵缓冲溶液将碳酸酐酶-锌离子复合物(分子量约为29kda)配制成10μm浓度的蛋白样品溶液。
64.2.电喷雾电离：
65.(1)高气压实验组：使用实施例1中的高气压电喷雾电离装置，对制备好的碳酸酐酶-锌离子复合物蛋白样品溶液进行电喷雾电离，离子源腔室内通入工作气体，具体参数如下：离子源腔室为敞口式，离子源腔室内温度为30℃，工作气体为氮气，氮气流速为600l/h，氮气气压约为1.2
×
105pa，导电铂丝施加的电压为0.8kv，采用的毛细管喷针尖端直径为1μm。
66.(2)常压对照组：使用实施例1中的高气压电喷雾电离装置，对制备好的碳酸酐酶-锌离子复合物蛋白样品溶液进行电喷雾电离，离子源腔室内不通入工作气体，其他具体参数与高气压实验组的相同。
67.3.质谱检测：高气压和常压电喷雾电离后获得的气相蛋白离子通过采样锥进入质谱仪的传输系统和质量分析器系统，使用飞行时间质谱进行检测，正离子模式下，最终获得的非变性质谱图如图5所示；
68.4.碰撞截面的测量：将高气压实验组中的氮气流速分别设为：100、200、300、400、500、600l/h，采用离子淌度-质谱仪器测量碰撞截面(ccs)的数值，实验结果如图6所示。
69.图5中并没有观察到脱去zn
2+
的谱图，表明电喷雾电离中使用高气压并不会使蛋白复合物脱去金属离子配体(zn
2+
)，证明了采用高气压电喷雾电离并不会破坏蛋白复合物间非共价相互作用。
70.图6反映，在不同氮气流速下，碳酸酐酶-锌离子复合物的ccs谱峰并没有发生明显
的漂移。图6结果表明，电喷雾电离中使用高气压并不会导致蛋白复合物构象(碰撞截面)发生明显变化，证明了采用高气压电喷雾电离并不会破坏蛋白复合物间非共价相互作用。
71.实施例6高气压对不同分子量的蛋白及其复合物的平均电荷价态的影响
72.选取分子量范围为27kda～801kda的29种蛋白及其复合物，采用实施例2的实验步骤，获得非变性质谱图，从而得到29种蛋白及其复合物的平均电荷价态。对29种蛋白及其复合物的分子量与其平均电荷价态之间的相关性进行研究，选取的29种蛋白及其复合物具体见表1，实验结果如图7所示。对29种蛋白及其复合物在常压和高压下平均电荷价态差值随溶剂可及表面积(sasa)的变化趋势进行研究，实验结果如图8所示。
73.图7反映，常压下29种蛋白及其复合物的平均电荷价态大约是rayleigh极限电荷(zr)的60％～96％；当氮气流速提高到600l/h即氮气气压约为1.2
×
105pa时(即高气压下)，29种蛋白及其复合物的平均电荷价态可以提高为zr的82％～116％，最高电荷价态甚至可以提高为zr的91％～123％。实验结果证明了离子源腔室内的高气压氛围可以显著提高蛋白及其复合物的电荷价态。本实施例展示了本发明方法普遍适用于分子量范围为27kda～801kda的29种蛋白及其复合物，证明了本发明方法的广谱性和广阔的应用前景。
74.图8反映，29种蛋白及其复合物在常压和高压下平均电荷价态差值随其溶剂可及表面积(sasa)的增加而提高。一般情况下，蛋白及其复合物的分子量越大，其溶剂可及表面积也越大。实验结果表明，具有较大外表面积的蛋白及其复合物可以容纳更多的电荷数，因此蛋白及其复合物的分子量越大，在高气压氛围下其电荷数的提高幅度也更大。
75.表1 29种蛋白及其复合物名称、分子量及大气压和高气压下最高电荷态
76.[0077][0078]
上述实施例只是本发明的实施方式之一，其他任何未背离本构思的前提和原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。