当归药材中掺假独活和掺假量的快速检测方法与流程

文档序号：22673757发布日期：2020-10-28 12:26阅读：381来源：国知局

本发明属于药物检测技术领域，具体的说是一种当归药材中掺假独活和掺假量的快速检测方法。

背景技术：

中药材及饮片是供中医临床用药、中成药生产的重要原料，是我国医疗保健事业的重要组成部分和医药宝库中的瑰宝。当归为常用中药，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效。临床用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，风湿痹痛，跌扑损伤，痈疽疮疡，肠燥便秘。当归来源于伞形科植物当归angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根。主产于甘肃、青海等地。

中药材及饮片的质量包括“真伪”和“优劣”两方面，《中国药典》为我国中药材、中药饮片质量检验的法定标准。标准中关于“真伪”检验的技术包括性状检验（即传统的经验鉴别）、显微鉴别和化学鉴别（以薄层色谱鉴别为主，个别采用高效液相色谱法hplc、气相色谱法gc）。“优劣”检验的技术包括以高效液相色谱法hplc、气相色谱法gc为主的含量测定、浸出物含量测定,以及其他检查指标的项目。

近年，中药材及饮片质量隐患较多，不法分子为了谋取暴利，肆意掺进外观相近的其他中药材饮片或根本就不是中药饮片的植物、动物或矿物。由于当归药材价格不断上涨，不法商贩将市场上冷背的独活药材加工后冒充当归出售，独活和当归在性状上十分相似，肉眼很难分辨，特别是以饮片形式存在时更不易区分，多数情况下只能经过眼看和口尝进行鉴别。传统鉴别方法是对药材或饮片的“形”、“色”、“气”、“味”为基本要素的判别，这对辨识者的技术水平、实践能力、从业技术都有很高的要求，需要具备丰富的经验和敏锐的判别能力；由于检验者的水平参差不一，检验的准确性、重复性和结论的一致性不高，误判情况时有发生，且对掺假的品种、掺假量没有得出较准确的结论；并且对于人为掺假做假现象，国家标准收录的理化鉴定方法并不能满足中药饮片真伪、优劣鉴定的需要，必须借鉴现代科学技术及检测设备，根据市场出现掺假的具体药材及饮片品种，有目的、有针对性的研究具有专属性且量化的检测检验方法，为中药材及饮片生产企业、流通领域、医疗和质检部门提供检验的依据。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种当归药材中掺假独活和掺假量的快速检测方法，能够快速检测出市场购买的当归药材及饮片中是否掺假独活，并对独活的掺假量进行快速、准确的计算，易于操作。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

一种当归药材中掺假独活和掺假量的快速检测方法，在当归药材中预设掺入5%-90%的独活的掺假量，当归药材中掺假独活的掺假量x与当归药材中掺假独活的相似度y两个变量之间存在一次方函数关系，建立的倒数二元一次方程为：

式中：r表示x与y的线性离合程度，r越大回归线性离合效果越好。

优选的：该方法包括以下步骤：

步骤一、制备当归正品药材溶液色谱图，精密称定当归正品药材粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，选用功率300w，频率40hz的超声处理30分钟，待溶液降至室温，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到当归正品药材溶液；选用高效液相色谱仪，进样体积10μl，测定，得到当归正品药材溶液色谱图；

步骤二、制备蛇床子素标准品溶液色谱图，精密称取蛇床子素标准品8.90mg，置100ml容量瓶中，精密加入甲醇100ml，得到蛇床子素标准品溶液；选用高效液相色谱仪，进样体积10μl，测定，得到蛇床子素标准品溶液的色谱图；

步骤三、制备独活正品药材溶液色谱图，精密称取独活正品药材粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，选用功率300w，频率40hz的超声处理30分钟，待溶液降至室温，再称定重量，用甲醇补足减小的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到独活正品药材溶液；选用高效液相色谱仪，进样体积10μl，测定，得到独活正品药材溶液色谱图；

步骤四、制备供试品药材溶液色谱图，精密称取当归药材中掺假有独活成分的供试品粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，选用功率300w，频率40hz的超声处理30分钟，待溶液降至室温，再称定重量，用甲醇补足减小的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到供试品溶液；选用高效液相色谱仪，进样体积10μl，测定，得到供试品药材溶液色谱图；

步骤五、将步骤四所制备的供试品药材溶液色谱图与步骤一所制备的当归正品药材溶液的色谱图、步骤二所制备的蛇床子素标准品溶液的色谱图、步骤三所制备的独活正品药材溶液色谱图进行比较，判断供试品溶液中是否掺假独活；

步骤六、将步骤四所制备供试品药材溶液色谱图和步骤三所制备的独活正品药材溶液色谱图，导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件，经过匹配得到当归药材中掺假独活的相似度y，进而代入相似度y与掺假量x之间的倒数二元一次方程中，即可计算出当归药材中掺假独活的掺假量x。

优选的，所述高效液相色谱仪的色谱进样条件为流动相乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱系统，流速为1.0ml/min，检测波长为350nm，柱温为30℃，进样体积10μl。

本发明确定高效液相色谱仪的检测波长为350nm时，分别选取318nm、322nm、350nm处检测，通过对上述三种检测波长比较，在318nm、322nm检测时，在掺假量为5%的当归掺假独活的色谱图中，在与蛇床子素对照品色谱保留时间相对应的位置上，保留时间：34.581min的当归有一小峰与保留时间：35.150min的蛇床子素的峰分离度达不到1.5，故调整检测波长为350nm下，当归药材掺入独活的色谱图中，蛇床子素峰的前后无其他峰的干扰。正品当归与掺假的独活色谱分离良好、基线平稳。

在实验室，将80批不同产地当归药材中掺假不同产地独活不同掺假量供试品按照步骤四所述方法制备80批供试品药材溶液色谱图，按照步骤三制备10批独活正品药材溶液色谱图，导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件，分别导出当归药材中掺假量为5%～90%掺假独活的标准图谱和独活正品药材标准图谱，再将当归药材中掺假量为5%～90%掺假独活的标准图谱与独活正品药材标准图谱进行相似度匹配，具体操作步骤如下：

s1、将10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量5%的独活的图谱，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量5%标准图谱”，如图5所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量10%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量10%标准图谱”，如图6所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量20%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量20%标准图谱”，如图7所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量30%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量30%标准图谱”，如图8所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量40%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量40%标准图谱”，如图9所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量50%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量50%标准图谱”，如图10所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量60%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量60%标准图谱”，如图11所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量70%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量70%标准图谱”，如图12所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量80%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量80%标准图谱”，如图13所示；

10批不同产地当归药材中掺假不同产地掺假量90%独活的样品，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“掺假量90%标准图谱”，如图14所示；

10批不同产地独活色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，生成标准图谱，命名为“独活药材标准图谱”，如图15所示；

s2.将s1制备的掺假量5%标准图谱、掺假量10%标准图谱、掺假量20%标准图谱、掺假量30%标准图谱、掺假量40%标准图谱、掺假量50%标准图谱、掺假量60%标准图谱、掺假量70%标准图谱、掺假量80%标准图谱、掺假量90%标准图谱、独活药材标准图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，以独活药材标准图谱作为参考图谱，以“平均数”标准图谱生成方法，时间窗宽度为“0.30”，可以得到以“独活药材参考图谱”作为标准的相似度数据。

经过匹配得到对应不同掺假量的相似度，进而得到相似度与掺假量之间的关系：当归药材中独活的掺假量x与当归药材中掺假独活的相似度y两个变量之间存在一次方函数关系，建立的倒数二元一次方程为：log10y=0.2234logx+0.5649，r=0.9958，式中：r表示x与y的线性离合程度，r越大回归线性离合效果越好。

不同产地当归药材中掺入不同产地独活且掺假样品总量为1g的掺假量见表1、掺假量与相似度结果见表2，掺假量与相似度的线性关系如图16所示。

表1

表2

为了验证所选取的洗脱系统的适宜性，选取当归药材中掺假独活掺假量为10%、30%、50%的样品，按照本发明所述方法制备供试品溶液，在乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相及检测波长为350nm色谱条件下连续进样6次进行试验，得到精密度考察色谱图如图17、18、19所示；计算色谱中蛇床子素峰的峰面积平均值，结果rsd<0.5%表明精密度良好，结果见表3。

表3

分别取6份当归药材中掺假独活掺假量为10%、30%、50%的样品，按照本发明所述方法制备供试品溶液，在乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相及检测波长为350nm色谱条件下，得到重复性考察色谱图如图20、21、22所示；分别计算色谱中蛇床子素峰的峰面积平均值，结果rsd均<1.0%，表明重复性良好，结果见表4。

表4

分别取当归药材中掺假独活掺假量为10%、30%、50%的样品，按照本发明所述方法制备供试品溶液，将供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10小时进样，在乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相及检测波长为350nm色谱条件下，得到稳定性考察色谱图如图23、24、25所示；分别计算色谱中蛇床子素峰的峰面积平均值，结果rsd均<0.5%表明稳定性良好，结果见表5。

表5

当归药材中掺假独活的掺假量x与当归药材中掺假独活的相似度y存在的函数关系验证：

为了检测通过相似度推算当归正品药材中掺假独活的掺假量，进行模拟试验，将掺假量为3.7%-85.4%的当归药材中掺假独活的图谱，与独活正品药材标准图谱进行相似度匹配，经过匹配得到当归药材中掺假独活的相似度，通过方程为：log10y=0.2234logx+0.5649，求得掺假量。

本发明所述方法符合科学理论，实验操作简便，可在较短时间内完成样品的检测，对当归药材是否掺假独活及独活的掺假量能够进行简单、快速准确的检验，为检测中药材掺假提供了一种全新的方法。本发明在中药材及饮片的生产、销售和使用领域的质量检验中具有重要的实用价值，特别是对于药品质量管理部门打击掺假、掺伪的不法行为具有十分重要的借鉴和推广意义。

本发明所选用的仪器包括：仪器：quintix224-1cn型电子天平（赛多利斯）；hh-6型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；watersacquityarc型高效液相色谱仪（美国waters）；agilent1260型高效液相色谱仪（美国agilent）;日立chromaster型高效液相色谱仪（日本）。所选用的实验试剂包括蛇床子素标准品（批号：110822-201710，以99.5%计）购自中国食品药品检定研究院；乙腈（产品批准号：q/12nk4021-2003，天津市光复精细化工研究所，色谱纯）；甲醇（天津是大茂化学试剂厂，分析纯）磷酸（天津是大茂化学试剂厂，分析纯）；水为双蒸水。所选用的实验材料包括10批不同产地当归样品均为伞形科植物当归angelicasinensis（oliv.）diels的干燥根。掺假药材10批不同产地独活均为伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserrateshanetyuan的干燥根（不同产地当归及不同产地独活来源信息见表6）。

表6

制备模拟样品是在当归正品药材中分别掺入5%-90%不同比例的独活药材，进行检测方法的系统研究、验证试验和建立函数关系。

附图说明

图1为当归正品药材溶液色谱图谱；

图2为蛇床子素标准品溶液色谱图；

图3为独活正品药材溶液色谱图谱；

图4为当归药材中掺假独活不同掺假量的供试品药材溶液色谱图；

图5为掺假量为5%的当归药材中掺假独活的标准图谱

图6为掺假量为10%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图7为掺假量为20%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图8为掺假量为30%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图9为掺假量为40%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图10为掺假量为50%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图11为掺假量为60%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图12为掺假量为70%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图13为掺假量为80%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图14为掺假量为90%的当归药材中掺假独活的标准图谱；

图15为独活正品药材标准图谱；

图16当归药材中掺假独活掺假量与当归药材中掺假独活的相似度之间的线性关系；

图17为精密度考察色谱图（掺假量为10%）；

图18为精密度考察色谱图（掺假量为30%）；

图19为精密度考察色谱图（掺假量为50%）；

图20为重复性考察色谱图（掺假量为10%）；

图21为重复性考察色谱图（掺假量为30%）；

图22为重复性考察色谱图（掺假量为50%）；

图23为稳定性考察色谱图（掺假量为10%）；

图24为稳定性考察色谱图（掺假量为30%）；

图25为稳定性考察色谱图（掺假量为50%）。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的表述。

式中：r表示x与y的线性离合程度，r越大回归线性离合效果越好。

实施例1

步骤二、制备蛇床子素标准品溶液色谱图，精密称取蛇床子素标准品8.90mg，置100ml容量瓶中，精密加入甲醇100ml，得到蛇床子素标准品溶液；选用高效液相色谱仪，进样体积10μl，测定，得到蛇床子素标准品溶液的色谱图，如图2所示；

步骤四、制备供试品药材溶液色谱图，精密称取当归药材中掺杂独活掺假量为4.3%的供试品粉末1.0g，其中当归正品药材含量为0.9566g，独活含量为0.0434g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，选用功率300w，频率40hz的超声处理30分钟，待溶液降至室温，再称定重量，用甲醇补足减小的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到供试品溶液；选用高效液相色谱仪，进样体积10μl，测定，得到供试品药材溶液色谱图；

步骤六、将步骤四所制备供试品药材溶液色谱图和步骤三所制备的独活正品药材溶液色谱图，导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件，经过匹配得到当归药材中掺假独活的相似度y为0.512，进而代入相似度y与掺假量x之间的倒数二元一次方程中，即可计算出当归药材中掺假独活的掺假量x为4.4%，与实际独活的掺假量相比较，相对平均偏差为1.2%。