一种末梢微量血维生素D质谱检测方法与流程

本发明涉及末梢微量血维生素d检测技术领域，特别是涉及一种末梢微量血维生素d质谱检测方法。

背景技术：

维生素d是一种脂溶性维生素，具有类固醇激素的功能。维生素d(vitd)缺乏是儿童健康面临的重大公共卫生问题。

研究表明：6-12月龄婴儿vitd缺乏不足率高达35％-40％。维生素d缺乏诊断标准是依据血清中的25-羟基维生素d浓度。目前国际公认液相色谱-串联质谱法是检测25-羟基维生素d最可靠的方法，具有很高的灵敏度、特异性和准确性，并且可同时测定血清25-羟基维生素d2和25-羟基维生素d3浓度。

临床上测定血清vitd通常需采集静脉血(常量血)，由于低龄儿童尤其是新生儿及婴幼儿的血管比较细，常规采取静脉血的过程中会哭闹等，依从性差，且家长顾虑孩子年龄小，不愿意一次抽取2ml的静脉血，常规采集静脉血比较困难。因此，采取微量血进行检测，可以缓解儿童采血过程的痛苦，提高患者和家长的依从性。

但由于微量血采集受采血部位深浅、组织液干扰等因素影响，与常量血检测结果有差异，目前尚无法用微量血方法来检测25-羟基维生素d。

前面的叙述在于提供一般的背景信息，并不一定构成现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种末梢微量血维生素d质谱检测方法，该方法在传统用hplc-ms/ms测定静脉常量血清中25-羟基维生素d的基础上，建立了hplc-ms/ms法测定手指微量血中25-羟基维生素d的新方法；简便、快速、灵敏度高、干扰少、准确度和重现性好；为临床上用微量血取代常量血进行vitd检测提供可靠依据。

本发明提供一种末梢微量血维生素d质谱检测方法，所述末梢微量血维生素d质谱检测方法包括以下步骤：

(1)血清标本收集：

静脉血样本通过静脉穿刺进入含有凝血激活剂的试管；取指尖血放入ep试管中，再向ep试管中加入抗凝剂乙二胺四乙酸(edta)，血清分离，在-20℃避光中保存；

(2)准备检测材料和化学制品：

25-羟基维生素d2(100μg/ml，purity98％)、25-羟基维生素d3(100μg/ml，purity98％)、25-羟基维生素d2-d3(25-羟基维生素d2的内标，100μg/ml，purity98％)、25-羟基维生素d3-d6(25-羟基维生素d3的内标，0.5mg，purity95％)、甲酸、标准物质(srm2972、srm972a)、有机溶剂正己烷和甲醇(高效液相色谱级)、硫酸锌(znso4)；

(3)校准标准品：

在甲醇浓度为6.25/6.25、12.5/12.5、25/25、50/50、125/125、250/250和500/500nmol/l(25-羟基维生素d2/25-羟基维生素d3)时制备混合校准标准品，每批校准品均作为样品处理；

(4)静脉血清、微量血清25-羟基维生素d检测方法：

采用高效液相色谱串联质谱法定量测定血清25-羟基维生素d浓度，检测仪器为高效液相色谱串联质谱仪；

(5)数据分析：

采用hplc-ms/ms方法对静脉血、微量血的血清标本进行25-羟基维生素d检测；统计分析两种方法的均值偏差；评估25-羟基维生素d状态之间的一致性；

(6)hplc-ms/ms方法的分析性能评价：

通过静脉血清样本、末梢微量血样本的hplc-ms/ms色谱图，采用hplc-ms/ms技术，对维生素d代谢产物和内标进行了充分分离；

(7)静脉和微量血hplc-ms/ms分析方法的结果验证；

(8)静脉和微量血中25-羟基维生素d水平：

比较三组静脉血和微量血中25-羟基维生素d浓度的变化，25-羟基维生素d的量等于25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d2的量之和。

(9)静脉和微量血标本中25-羟基维生素d浓度结果比较：

进一步采用bland-altman方法对两种标本结果的一致性进行检验，统计得出两种标本的转换模型：log(校正后微量25-羟基维生素d)＝0.01049+1.06692*log(微量25-羟基维生素d)，log(校正后微量25-羟基维生素d3)＝0.02864+1.05947*log(微量25-羟基维生素d3)；根据公式对微量血25(oh)d和25(oh)d3结果进行转换；

(10)校正后25-羟基维生素d和25-羟基维生素d3结果比较分析：

三组中静脉血25-羟基维生素d与校正微量血25-羟基维生素d均值相比组间没有差异，予以三组数据进行合并。

进一步地，所述步骤(4)中静脉血清检测仪器为高效液相色谱串联质谱仪，型号为shimadzu8040；质谱仪设置条件：雾化器温度350℃，雾化气气流6l/min，雾化气压35psi，dl管温度150℃。

进一步地，所述步骤(4)中微量血清检测仪器为高效液相色谱串联质谱仪，型号为absciex4500md；质谱仪设置条件：离子源温度400℃，喷雾气压力70psi，气帘气压力20psi，离子化电压4500v

本发明的末梢微量血维生素d质谱检测方法，通过同时采集同一对象的微量血和常量血，用高效液相色谱-串联质谱法同时检测常量血和微量血25-羟基维生素d水平，采用直线回归分析法分析两者25-羟基维生素d的相关性及转换系数，从而得出log(校正后微量25-羟基维生素d)＝0.01049+1.06692*log(微量25-羟基维生素d)，log(校正后微量25-羟基维生素d3)＝0.02864+1.05947*log(微量25-羟基维生素d3)公式；从而可以通过公式将常量血和微量血25-羟基维生素d浓度相互转换；为临床上用微量血取代常量血进行vitd检测提供可靠依据。

附图说明

图1为本发明实施例的静脉血清样本hplc-ms/ms色谱图。

图2为本发明实施例的末梢微量血样本hplc-ms/ms色谱图。

图3为本发明实施例的两种标本25-羟基维生素d和25-羟基维生素d3结果的bland-altman一致性检验散点图。

图4为本发明实施例的静脉25-羟基维生素d/25-羟基维生素d3与校正微量血25-羟基维生素d/25-羟基维生素d3的相关性分析图。

图5为本发明实施例的静脉25-羟基维生素d/25-羟基维生素d3浓度与校正微量血25-羟基维生素d/25-羟基维生素d3的roc曲线分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。

本发明的目的在于提供一种末梢微量血维生素d质谱检测方法，该方法在传统用hplc-ms/ms测定静脉常量血清中25(oh)d的基础上，建立了hplc-ms/ms法测定手指微量血中25(oh)d的新方法；简便、快速、灵敏度高、干扰少、准确度和重现性好；为临床上用微量血取代常量血进行vitd检测提供可靠依据。

血清标本收集：

静脉血样本通过静脉穿刺进入含有凝血激活剂的试管；从手指采集的微量血被挤入含有抗凝剂乙二胺四乙酸(edta)的ep管中；分离血清，在-20℃避光中保存。

检测材料和化学制品：

25(oh)d2(100μg/ml，purity98％)、25(oh)d3(100μg/ml，purity98％)、25(oh)d2-d3(25(oh)d2的内标，100μg/ml，purity98％)、25(oh)d3-d6(25(oh)d3的内标，0.5mg，purity95％)和甲酸。标准物质srm2972和srm972a；有机溶剂正己烷、甲醇(高效液相色谱级)和硫酸锌(znso4)。

校准标准品：

在甲醇浓度为6.25/6.25、12.5/12.5、25/25、50/50、125/125、250/250和500/500nmol/l(25(oh)d2/25(oh)d3)时制备混合校准标准品；每批校准品均作为样品处理。

静脉血清25-(oh)d检测方法：

采用高效液相色谱串联质谱法定量测定血清25-(oh)d浓度，检测仪器为高效液相色谱串联质谱仪(型号：shimadzu8040)。采集静脉血清，取样本100ul经过蛋白质去除、提取、纯化等预处理后，提取有效成分。质谱仪配备esi源采用正离子扫描模式，采用质谱mrm离子监测方法选择前体离子(m/z401.3for25ohd3,m/z413.3for25ohd2,andm/z407.3for25(oh)d3-d6,m/z416.3for25(oh)d2-d3)，进一步生成特定的产物离子用于数据分析。如下表(基于hplc-ms/ms方法静脉血反应监测采集设置参数表)所示：

质谱仪设置条件：雾化器温度350℃，雾化气气流6l/min，雾化气压35psi，dl管温度150℃。

根据仪器检测标准物质数据制作标准曲线方程，相对标准偏差<15％。根据标准曲线方程计算质控样本和待测样本25-(oh)d3和25-(oh)d2含量，质控范围多规则质控方法判定质控结果是否合格，每批次检测样本至少双质控。25-(oh)d3批内和批间变异系数均<5％，25-(oh)d2批内和批间变异系数均<5％。

微量血25-(oh)d检测方法：

采用高效液相色谱串联质谱法定量测定微量血25-(oh)d浓度，检测仪器为高效液相色谱串联质谱仪(型号：absciex4500md)。采集微量指血，取样本20ul经过除蛋白与杂质处理后，提取有效成分。质谱仪配备esi源采用正离子扫描模式，采用质谱mrm离子监测方法选择前体离子(m/z401.3for25ohd3,m/z413.3for25ohd2,andm/z407.3for25(oh)d3-d6,m/z416.3for25(oh)d2-d3)，进一步生成特定的产物离子用于数据分析。如下表(基于hplc-ms/ms方法微量血反应监测采集设置参数表)所示：

质谱仪设置条件：离子源温度400℃，喷雾气压力70psi，气帘气压力20psi，离子化电压4500v。

根据仪器检测标准物质数据制作标准曲线方程，相对标准偏差<15％。根据标准曲线方程计算质控样本和待测样本25-(oh)d3和25-(oh)d2含量，质控范围多规则质控方法判定质控结果是否合格，每批次检测样本至少双质控。25-(oh)d3批内和批间变异系数均<10％，25-(oh)d2批内和批间变异系数均<10％。

数据分析：

采用hplc-ms/ms两种方法对血清标本进行25(oh)d检测。用bland-altman统计分析两种方法的均值偏差。使用cohen'skappa评估25(oh)d状态之间的一致性(一致性：<0.4，差；0.4-0.75，适中到好；大于0.75，好)。p<0.05具有统计学意义。所有数据分析应用empower(r)和graphpad统计软件。

hplc-ms/ms方法的分析性能评价：

图1所示为静脉血清样本的hplc-ms/ms色谱图，采用hplc-ms/ms技术，对维生素d代谢产物和内标进行了充分分离，25(oh)d3在1.50min，其内标在1.45min洗脱；而25(oh)d2在1.60min，其内标在1.61min洗脱。潜在干扰3-epi-25(oh)d在1.00-1.25min或2.00min洗脱，25(oh)d2和25(oh)d3检测不产生干扰。

图2所示为末梢微量血样本的hplc-ms/ms色谱图，采用hplc-ms/ms技术，对维生素d代谢产物和内标进行了充分分离，25(oh)d3在1.40min，其内标也在1.40min洗脱；而25(oh)d2在1.50min，其内标也在1.50min洗脱。潜在干扰3-epi-25(oh)d在1.00-1.25min或2.00min洗脱，25(oh)d2和25(oh)d3检测不产生干扰。

静脉和微量血hplc-ms/ms分析方法的结果验证：

对静脉血清标本，25(oh)d3的检测限(limitofdetection，lod)均为0.01ng/ml，25(oh)d2的检出限为0.05ng/ml；25(oh)d3的定量限(limitofquantification，loq)为1.5ng/ml，25(oh)d2的loq为1.5ng/ml，当25(oh)d2在0.8ng/ml～50.0ng/ml范围内时，线性良好，相关系数r2>0.99。当25(oh)d3在2.5ng/ml～160.0ng/ml范围内时，线性良好，相关系数r2>0.99。在测定25(oh)d3时，三种浓度10ng/ml、40ng/ml和160ng/ml被设置为质量控制。在测定25(oh)d2时，三种浓度5、10和40ng/ml用于质量控制。两种化合物的准确度回收率(％)在85％～115％合理范围内，准确率分别为3.87％和4.91％。如下表(静脉血清标本hplc-ms/ms检测方法的验证结果表)所示：

对微量血标本，25(oh)d3的lod为0.01ng/ml，25(oh)d2的检出限为0.05ng/ml；25(oh)d3的loq为5ng/ml，25(oh)d2的定量限为0.8ng/ml，当25(oh)d2在0.10ng/ml～12.50ng/ml范围内时，线性良好，相关系数r2>0.99。当25(oh)d3在0.31ng/ml～40.0ng/ml范围内时，线性良好，相关系数r2>0.99。在测定25(oh)d3时，三种浓度1.25ng/ml、5.00ng/ml和20.00ng/ml被设置为质量控制。在测定25(oh)d2时，三种浓度0.39、1.56和6.25ng/ml用于质量控制。两种化合物的准确度回收率(％)在85％～115％合理范围内，准确率分别为1.65％和45.32％。如下表(微量血清标本hplc-ms/ms检测方法的验证结果表)所示：

静脉和微量血中25(oh)d水平：

比较三组静脉血和微量血中25(oh)d浓度的变化。25(oh)d的量等于25(oh)d3和25(oh)d2的量之和。静脉血和毛细血管血中25(oh)d和25(oh)d3的平均值在三组之间存在差异。如下表(静脉和微量血25(oh)d/25(oh)d3结果及精密度比较表)所示：

因为92％的样品含有小于0.1ng/ml的25(oh)d2，我们在随后的统计分析中没有包括该分析物。

静脉和微量血标本中25(oh)d浓度结果比较：

进一步采用bland-altman方法对两种标本结果的一致性进行检验(见图3)，两种标本25(oh)d浓度结果95％一致性界限为(-4.36，12.75)，结果的偏倚为4.196，偏倚sd为4.365，表示两种标本结果有较好一致性。同样地，其中25(oh)d3浓度95％的一致性界限为(-4.01，12.40)。进一步统计得出两种标本的转换模型：log(校正后微量25(oh)d)＝0.01049+1.06692*log(微量25(oh)d)，log(校正后微量25(oh)d3)＝0.02864+1.05947*log(微量25(oh)d3)。根据公式对微量血25(oh)d和25(oh)d3结果进行转换。

校正后25(oh)d和25(oh)d3结果比较分析：

三组中静脉血25(oh)d与校正微量血25(oh)d均值相比组间没有差异，如下表(静脉血25(oh)d/25(oh)d3与校正毛细血管血25(oh)d/25(oh)d3结果比较表)所示：

予以三组数据进行合并。进一步分别分析静脉25(oh)d和25(oh)d3与校正微量血中25(oh)d和25(oh)d3的相关性为0.7941和0.8103(见图4)，roc曲线统计分析两种25(oh)d和25(oh)d3的auc分别为0.9367和0.9565(见图5)。以上结果分析证明hplc-ms/ms检测微量血25(oh)d具有良好的准确性和灵敏度。

基于上文的描述可知，本发明优点在于：

1、通过同时采集同一对象的微量血和常量血，用高效液相色谱-串联质谱法同时检测常量血和微量血25(oh)d水平，采用直线回归分析法分析两者25(oh)d的相关性及转换系数，从而得出log(校正后微量25(oh)d)＝0.01049+1.06692*log(微量25(oh)d)，log(校正后微量25(oh)d3)＝0.02864+1.05947*log(微量25(oh)d3)公式；从而可以通过公式将常量血和微量血25(oh)d浓度相互转换；为临床上用微量血取代常量血进行vitd检测提供可靠依据。

2、本方法在传统用hplc-ms/ms测定静脉常量血清中25(oh)d的基础上，建立了hplc-ms/ms法测定手指微量血中25(oh)d的新方法，该方法简便、快速、灵敏度高、干扰少，准确度和重现性好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。